Micromanipulação de Gametas e Embriões

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Aparecida Pacheco da Cunha
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1 Universidade Federal de Pelotas Graduação em Biotecnologias Manipulação de Gametas e Embriões Micromanipulação de Gametas e Embriões Prof. Tiago Collares Prof a. Priscila M. M. de Leon Janeiro, 2013

Micromanipulação de gametas e embriões Histórico: Kite, 1914: injeção de espermatozoides no citoplasma de oócitos de peixe estrela; Hiramoto, 1962: microinjetou espermatozoides de

2 Micromanipulação de gametas e embriões Histórico: Kite, 1914: injeção de espermatozoides no citoplasma de oócitos de peixe estrela; Hiramoto, 1962: microinjetou espermatozoides de ouriço do mar em oócitos homólogos; Uehara e Yanagimachi, 1976: oócitos de hamster injetados com núcleo de espermatozoides isolados eram capazes de formar pronúcleo feminino e masculino.

3 Micromanipulação de gametas e embriões Histórico: Gianpiero Palermo, 1991: Primeiro nascimento humano 47 oócitos em MII; 38 permaneceram intactos após ICSI; taxa de fertilização de 66%; 15 embriões transferidos; 4 gestações (2 únicas, 1 gemelar e 1 aborto)

4 Micromanipulação de gametas e embriões Histórico: Squire et al., 1996: 4 oócitos em MII microinjetados e 1 gestação positiva; Hinrichs & Choi, 2003: Primeiro potro produzido por ICSI de oócito maturado in vitro.

5 Micromanipulação de gametas e embriões Procedimentos de Micromanipulação têm sido realizados em gametas e embriões. Como: dissecções da zona pelúcida, inserções de espermatozoides em oócitos, remoção e transplante de pronúcleos e blastômeros; Técnicas de micromanipulação: PZD: Dissecção Parcial da Zona Pelúcida SUZI: Inserção de Espermatozoides no Espaço Perivitelínico (subzonal) ICSI: Injeção Intracitoplasmática de Espermatozoides Hatching assistido Biópsia embrionária e corpúsculo polar

6 Micromanipulação de gametas e embriões Equipamentos para Micromanipulação: Microscópio Invertido Micromanipulador Agulhas Sistema de confecção de agulhas

7 Agulhas de Micromanipulação: Holding Agulha de Inoculação

8 Agulhas de Micromanipulação: Hatching ou Biopsia

9 Sistema de confecção de agulhas:

10 ICSI Injection Pipettes Holding Pipettes

11 Zona Drilling Pipettes Polar Body Biopsy Pipettes Partial Zona Dissection (PZD) Pipettes

12 Blastomere Biopsy Pipettes

13 Micromanipulador:

14 Sistema de Micromanipulação Eppendorf 3&nodeidtab=73225&nodeidmovie=73227

15 Micromanipulação de gametas e embriões Dissecção Parcial da Zona Pelúcida (PZD) Malter & Cohen, 1989: método pelo qual a abertura da ZP é feita mecanicamente pela dissecção com uma microagulha. Procedimentos de PZD: Oócito é desnudado em hialuronidase e colocado em sucrose para aumentar o espaço perivitelínico; Oócito é fixado pela "holding" e uma microagulha é inserida na ZP sem perfurar o oolema; Oócito é transferido para o meio de FIV; Aumento das taxas de fertilização e clivagem (79% e 68%) em relação ao controle (53% e 33%); *problema de poliespermia! Cohen et al., 1988: primeira gestação em humanos usando PZD; Malter e Cohen,1989: anormalidades no "hatching" embrionário; Atualmente não é mais utilizado!

16 Dissecção Parcial da Zona Pelúcida (PZD)

17 Micromanipulação de gametas e embriões Inserção de Espermatozoides no Espaço Perivitelínico (SUZI) Nagy et al., 1988: injeção de um ou mais espermatozóides no espaço perivitelínico; Procedimentos de SUZI: Espermatozoides são sugados para dentro da micropipeta; ZP é pressionada e perfurada, até que penetre no espaço perivitelínico; Espermatozoides são depositados no espaço perivitelínico e micropipeta é retirada; Cohen et al., 1991: aumento significativo de polispermia quando mais que dois espermatozoides eram inseridos; Nagy et al., 1988: primeira gravidez obtida por este método de SUZI; Taxa de fertilização de 15% a 22%

18 Inserção de Espermatozoides no Espaço Perivitelínico (SUZI)

19 Micromanipulação de gametas e embriões Injeção Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) Lanzendorf et al., 1988: descrevem pela primeira vez a ICSI na espécie humana, com o relato da obtenção de pronúcleos após a microinjeção de 20 oócitos (taxa de fertilização de 35%); Procedimentos de ICSI: Holding posicionada Corpúsculo Polar no sentido 12h ou 6h; Espermatozoide é imobilizado e sugado para dentro da micropipeta; ZP é pressionada e perfurada, até que penetre o ooplasma; Espermatozoide é depoistado e micropipeta é retirada; Palermo et al., 1992: ICSI em 47 oócitos em MII; 38 permaneceram intactos após a microinjeção; 31 fertilizaram (66%); foram transferidos para o útero 15 embriões; 4 gestações foram obtidas. Palermo, 1993: aplicação de ICSI para fatores masculinos de infertilidade;

Técnica de ICSI Espermatozoides podem ser preparados com Gradiente de Percoll; Espermatozoides são colocados em solução de PVP 10% em meio FIV; Viscosidade x facilidade de captura do espermatozoide

20 Técnica de ICSI Espermatozoides podem ser preparados com Gradiente de Percoll; Espermatozoides são colocados em solução de PVP 10% em meio FIV; Viscosidade x facilidade de captura do espermatozoide Gota contendo espermatozoides é posicionada no meio da placa; Oócitos são desnudados com sol. de Hialuronidase; Oócitos são posicionados ao redor da gota contendo espermatozoides; Espermatozoide é imobilizado ( quebrando a cauda) e capturado; Pipeta de inoculação é posicionada na gota do oócito; Holding fixa a oócito a ser fertilizado; CP posicionada nas 12h ou 6h (probabilidade de lesionar núcleo) Espermatozoide é injetado no ooplasma (posição 3h); Pipeta de Inoculação é retirada e oócito é solto; * Sistema de microinjeção é preenchido com óleo mineral; * Gotas são cobertas com óleo mineral (evitar evaporação); * Micromanipulação sob aumento 200 x;

21 Diferenças entre Técnicas de Micromanipulação:

22 Técnica de ICSI Aplicações da ICSI: Infertilidade Masculina; Infertilidade sem causa aparente; Após 3 tentativas de FIV; Produção in vitro de embriões Equinos; Taxas de Fertilização: Humanos de 50-55%; Equinos de 60% a 80%; 5 a 8% de lesão nos oócitos após a ICSI 40% de fertilização após punção do epidídimo

http://www.youtube.com/watch?v=lyqvxd1mhuk&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=fkhpq3rbqec&feature=related http://www.

23 Injeção Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) 1% a 2,5% de anormalidades cromossômicas; 5% de malformações em fator masculino severo;

25 Micromanipulação de gametas e embriões Hatching Embrionário assistido Abertura da zona pelúcida facilitando a implantação do embrião; Indicação Hatching: Mulheres com mais de 40 anos; Embriões que apresentem zona pelúcida espessa; Falha de implantação em ciclos de FIV anteriores; Hatching x controle: Taxa de Gestação : 44% x 41%; Taxa de Nascimento: 36% x 33%; Gestações Múltiplas: 18% x 15% Aborto: 6,6% x 6,2%

26 Hatching Embrionário assistido:

28 Micromanipulação de gametas e embriões Biópsia embrionária e Corpúsculo Polar Retirada de fragmento para extração de DNA e diagnóstico molecular a fim de identificar doença genética antes da implantação; Diagnóstico Genético Pré-implantacional (PGD) Embriões: Porção de 6 a 10 células são removidas para extração do DNA representando de 10-30% da massa celular; Embriões de 5 a 7 dias; Oócitos: Retirada do 1º Corpúsculo Polar; Indicação: Doenças como: hemofilias do tipo A, distrofias musculares, síndrome do X frágil;

29 Biópsia embrionária: 10% de mortalidade embrionária; H8&feature=related

30 Biópsia embrionária: Mórula Blastocisto

31 Biópsia Corpúsculo Polar: Não afeta fertilização e desenvolvimento embrionário

32 Causas de Azospermia (ausência de espermatozóides no ejaculado) Deleções no cromossomo Y em 15% dos homens inférteis; Propagação destas causa de Infertilidade com ICSI;

33 Citocalasina B: melhora flexibilidade do citoesqueleto; Adição de 5µg/mL de citocalasina B melhora taxa de sobrevivência embrionária em camundongos (80% x 89%); O tratamento a curto prazo não tem efeito tóxico;

35 Tratamento com Tritor X-100: com objetivo de melhorar a formação pronuclear; Espermatozoides tratados x controle: formação pronuclear 54% x 36%; Não melhora desenvolvimento embrionário em suínos;

ICSI; Meninos não teve diferença; Meninas de ICSI tem mais gordura

37 FIV e ICSI podem afetar o acúmulo de gordura corporal em humanos; Investigou a gordura corporal de adolescentes de 14 anos nascidos de ICSI; Meninos não teve diferença; Meninas de ICSI tem mais gordura depositada; Fatores epigenéticos em fatores relacionados ao metabolismo;

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