Sexagem de Sêmen e Embriões

Transcrição

1 Universidade Federal de Pelotas Graduação em Biotecnologias Manipulação de Gametas e Embriões Sexagem de Sêmen e Embriões Prof. Tiago Collares Prof a. Priscila M. M. de Leon Dezembro, 2012

2 Sexagem Histórico: Década de 80: pesquisadores da Califórnia desenvolveram a tecnologia do sêmen sexado por citometria de fluxo; 1989: sexagem de embriões humanos por PCR; 1990: sexagem de embriões bovinos por biópsia e PCR; 1998: primeiro potro sexado; 1999: primeiro terneiro utilizando sptz sexado e congelado de IA; 2001: cordeiro nascido utilizando sêmen sexado e congelado; 2003: comercialização de sêmen sexado nos EUA; 2004: comercialização de sêmen sexado no Brasil;

3 Aplicações gerais da Sexagem Rentabilidade na produção de carne; Especialização da criação leiteira; Comercialização especializada: planejar os nascimentos de machos e fêmeas de acordo com as necessidades do rebanho e de mercado; Produção e seleção genética específica; Síndromes relacionadas ao sexo;

4 Sexagem de Sêmen

5 Sexagem de Sêmen Moruzzi, 1979: deu especial atenção ao DNA, ao evidenciar diferenças entre os espermatozoides X e Y; Gorus & Pipeleers, 1981: utilização da técnica de Percoll, consistiu na centrifugação de espermatozoides em um gradiente de densidade contínuo, cujo princípio se baseou na diferença de massa entre as populações de espermatozoides X e Y; PINKEL et al., 1982: construção do citômetro de fluxo com alta resolução, usado para mostrar a diferença de 3,2% no conteúdo de DNA do núcleo de espermatozoides de camundongos; JOHNSON et al., 1989: coelhos nascidos de sêmen sexado por citometria de fluxo;

6 Sexagem de Sêmen Atualmente: sexagem do sêmen é feita através da tecnologia de separação por fluxo, a única técnica confiável para separar espermatozoides femininos dos masculinos, utilizando um aparelho chamado Citômetro de Fluxo; Técnica é baseada na detecção de 3 a 4% a mais no conteúdo do DNA nos espermatozoides femininos.;

7 Sexagem de Sêmen 1º passo : é diluir o ejaculado a uma concentração pequena; 2º passo: corá-los com fluorófo que se ligue em DNA (Hoechst 33342); 3º passo: este conteúdo será levado ao Citômetro de Fluxo, e quando os espermatozoides passam pelo raio lazer, a fluorescência é identificada; Como o cromossomo X é maior, os espermatozoides femininos emitem maior quantidade de luz que os espermatozoides masculinos; Os detectores medem a quantidade de fluorescência emitida e detectam cargas + e em cada gota contendo 1 só espermatozoide; 4º passo: este fluxo é logo separado em três recipientes eletromagnéticos: partículas com carga (+), contendo 1 esperma feminino partículas com carga (-) com 1 esperma masculino partículas sem definição * Este processo separa espermatozoides de ambos os sexos com 90% de acerto.

8 Sexagem de Sêmen X Y Hoechst Espermatozóides X possuem mais DNA (3-4%) - Espermatozóides X com mais corante ligado ao DNA

9 Sexagem por Citometria de Fluxo

10 Sexagem por Citometria de Fluxo * Capacidade de sexagem: a sptz/segundo

11 Sexagem de Sêmen Segundo JOHNSON e WELCH (1999) a variação no conteúdo de DNA entre os espermatozoides X e Y é a seguinte: 2,8% no homem; 3,0% no coelho; 3,6% no suíno; 3,7% no garanhão; 3,8% no bovino; 3,9% no cão; 4,2% nos ovinos. Cromossomo Y e Cromossomo X

12 *GARNER, 2006: existem diferenças relacionadas às características do cromossomo Y entre espermatozoides de raças de bovinos, determinando resultados variáveis na eficiência do processo de separação dos espermatozóides X e Y, assim como nos resultados de prenhez após a utilização de sêmen sexado de raças taurinas e zebuínas.

13 Limitantes da Sexagem de Sêmen Principal limitação: redução da taxa de concepção, pois sexar espermatozoides é um processo que impacta negativamente na viabilidade celular; Em rebanhos: 60 a 65% de concepção em novilhas com sêmen convencional, enquanto que, 45 a 55% de concepção com sêmen sexado; somente 30% dos espermatozoides se orientam corretamente, ou seja, apenas 15% dos espermatozoides que entram na máquina são comercializados como sexados; São comercializadas palhetas com 2 milhões de sptz sexados; custo do citômetro + mão de obra especializada + diminuição da viabilidade celular = alto custo do sêmen sexado se recomenda que o sêmen sexado seja usado somente em rebanhos bem manejados e com novilhas altamente férteis;

14 Resultados utilizando sêmen sexado GARNER, 2006:

15 Resultados utilizando sêmen sexado GARNER, 2006:

16 Desvantagens da Sexagem de Espermatozoides Pureza do sêmen sexado (90% a 85%); Alguns touros não é possível sexar devido a baixa qualidade espermática; Fertilidade é diminuída tanto na Inseminação Artificial como na FIV; Equinos não é possível sexar sêmen comercialmente; Técnica de sexagem de espermatozoides depende de equipamento de citometria de fluxo;

17 Sexagem de Embriões

18 Sexagem de Embriões Conceito: a Sexagem de Embriões é um avanço tecnológico que nos permite identificar o sexo do embrião antes da transferência para a receptora. Biotencologia relacionada a Produção in vitro e a Transferência de embriões; Criador escolhe o sexo do embrião a ser transferido; Realizada através da análise do DNA embrionário; Ferramenta que permite intensificar e acelerar o melhoramento genético de animais de alto valor zootécnico; Contribuindo diretamente para otimização da eficiência reprodutiva e lucratividade nos rebanhos;

19 Aplicação Comercial de Embriões Sexados Bovinocultura de Corte x Leite Reposição de Matrizes Reprodução Comercialização de Fêmeas Produção de carne e Abate Comercialização de Touros Produção de Leite Reposição de Matrizes Reprodução Comercialização de Fêmeas Comercialização de Touros

20 Aplicação Comercial de Embriões Sexados

21 X A maior frequência de machos nos produtos provenientes da PIV é altamente indesejável; O número de machos com alto potencial zootécnico necessário em um rebanho é bem menor em relação às fêmeas; A probabilidade de um terneiro tornar-se doador de sêmen é baixa, causando a desvalorização dos produtos; Toda a fêmeas oriunda de um acasalamento bem planejado é potencialmente uma doadora;

22 Vantagens da Sexagem de Embriões Maior aproveitamento de receptoras; Menor custo com tratamentos hormonais e sincronização; Manejo simplificado; Menor locação de espaço na propriedade; A possibilidade de se ter um rebanho de matrizes aptas a produzirem cada vez mais e num curto espaço de tempo se multiplica; Estudos mostram um desvio na proporção macho/fêmea de embriões produzidos in vitro ( % de machos) uma vaca que, em toda sua vida útil teria em média 4 a 5 crias, produziria com a transferência de embriões, de 30 a 40 crias

23 Vantagens da Sexagem de Embriões Optar pela implantação ou congelamento dos "embriões fêmeas e descartando os "machos" : Economizando os custos altos das gestações, aumentando ainda mais o número de fêmeas, filhas de suas melhores matrizes, com possibilidade de atingir o seu equilíbrio de produção rapidamente (Melhora do Plantel é otimizada). Vai ocorrer a diminuição dos custos de imediato pela simples redução pela metade do número de receptoras necessárias.

24 Técnicas de Sexagem de Embriões Não invasivas: mantém a integridade do embrião; 1. Métodos imunológicos: detecção de um antígeno de superfície celular antígeno H-Y Citotoxicidade: Em ensaios citotóxicos os embriões que expressam esse antígeno apresentam lise celular ou cessam o desenvolvimento, sendo classificados como macho; Eficiência de 80-86%; Desvantagem: inviabilidade do machos; Imunofluorescência indireta (IFI): são utilizados anticorpos anti-h-y, monoclonais ou policlonais, conjugados com o isotiocianato de fluoresceína; Visualização por meio de microscopia de fluorescência; 49-70% de acurácia Desvantagem: diminui viabilidade embrionária (59% de degeneração)

25 Técnicas de Sexagem de Embriões Não invasivas: 2. Métodos bioquímicos: maior atividade enzimática relacionada ao cromossomo X em fêmeas Atividade da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase: Eficiência de 64%; Alta taxa de Mortalidade Embrionária: inviabiliza a aplicação comercial dos métodos bioquímicos, sugerindo toxicidade da reação para os embriões

26 Técnicas de Sexagem de Embriões Invasivas: Os métodos mais precisos para a determinação do sexo; requerem biópsia de células dos embriões; 1. Métodos Citogenéticos: visualização da cromatina sexual Visualização da cromatina sexual: 1ª técnica utilizada para a identificação do sexo. Baixo sucesso; Cariotipagem: identificação de XX ou XY na fase de metáfase; Eficiência de 9% em mórulas;

27 Técnicas de Sexagem de Embriões Invasivas: 2. Métodos Moleculares: sondas de DNA específicas para a determinação do sexo de embriões pré-transferência Hibridização in situ: localização de sequências Y-específicas por meio de marcação radioativa; 57% de eficiência e 95% de acurácia; Hibridização in situ fluorescente (FISH): marcadores sondas não-radioativas; Pouca informação sobre sua eficiência; Complexidade (muitas etapas) inviabiliza a aplicação;

28 Invasivas: Técnicas de Sexagem de Embriões 2. Métodos Moleculares: Reação em Cadeia da Polimerase (PCR): HANDYSIDE et al. (1989) em embriões humanos; A PCR amplifica exponencialmente pequenos fragmentos de DNA de regiões Y-específicas; Alto grau de eficiência e Acurácia; Procedimento rápido e de fácil realização;

29 Estágio e Qualidade Embrionária Estágio: Mórula compacta (D5) Biópsia não tem orientação Blastocisto expandido (D7) Biópsia do trofoblasto, massa celular deve permanecer intacta Qualidade: Excelente (G1) Boa (G2 e G3)

30 A Técnica de Sexagem de Embriões Embriões produzidos in vitro ou provenientes de coleta in vivo; 1º ) Biópsia Embrionária: é utilizado um micromanipulador; Porção de 6 a 10 células são removidas para extração do DNA representando de 10-30% da massa celular; Embriões de 5 a 7 dias; Conservação do material a -196 C; 2ª) Extração do DNA genômico: Células são lisadas na Proteinase K (6 µg); Incubação a 37 C/60 minutos; Incubados a 98 C/10 minutos para inativação da enzima;

31 A Técnica de Sexagem de Embriões 3º ) Amplificação por PCR: PCR Multiplex: Primer para região do Y (SRY); Primer para região controle (microssatélite ou SRX); 40 ciclos de desnaturação, anelamento e extensão; 4º) Visualização em Gel: Gel de Agarose 0,8% a 1,5%; Corado com GelRed ou Brometo de Etídeo; A técnica mais utilizada consiste na punção por micromanipulação do embrião de 7 dias, retirando-se um fragmento cujo código de DNA evidenciará ou não a amplificação do Y (SRY) por PCR e seguido de eletroforese

32 1ª Etapa: Biópsia Embrionária

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34 2ª Etapa: Extração do DNA 37 C /60 minutos 98ºC /10 minutos

35 3ª Etapa: Amplificação por PCR Multiplex PCR: Primer SRY: F 5 ATC AGT GCA GGG ACC GAG ATG 3 R 5 AAG CAG CCG ATA AAC ACT CCT T 3 Primer 1.715: F 5 TGG AAG CAA AGA ACC CCG CT 3 R 5 TCG TGA GAA ACC GCA CAC TG 3 Volume da reação de 15-50µl 40 ciclos

36 4ª Etapa: Visualização por eletroforese M = Controle positivo com DNA de macho bovino F = Controle positivo com DNA de fêmea bovina No = Controle Negativo (sem DNA) Embriões machos (XY), apresentam 2 bandas 1, 3 e 5 Embriões fêmeas (XX), apresentam 1 banda 2 e 6

37 Limitantes da Sexagem de Embriões Apenas o sexo masculino é detectado; Quando não houver a presença de banda não é possível identificar o sexo do embrião; 10% de mortalidade embrionária com a biopsia; Mortalidade ligada a qualidade embrionária;

38 Resultados Obtidos com a Sexagem de Embriões PCR se observa uma eficiência de 90-95% e acurácia de 93-98%; Ramalho et al. (2004): 80% de identificação correta entre mórulas e blastocistos; Os embriões sexados podem ser congelados com sucesso; Taxa de prenhes não é alterada; A rapidez na execução da técnica e a possibilidade da determinação do sexo de embriões bovinos frescos, sem a necessidade de criopreservação, é uma das principais vantagens da utilização da PCR em laboratórios de PIV de embriões bovinos.

39 Sexagem em Humanos Diagnóstico Genético Pré-Implantacional (DGP); Ferramenta de diagnóstico pré-natal para casais com alto risco de transmissão de doenças genéticas; usado para determinação do sexo do embrião em casos de doenças genéticas ligadas ao cromossomo X Doenças como: Síndrome do X frágil, Distrofia muscular Duchenne, Hemofilia são evitadas com transferência de meninas; Dilema bioético: transferência de embriões não doentes, mas portadores de genes, cuja chance de transmissão para a prole futura é de 50%. Sociedade Européia: Equilíbrio de gênero equilíbrio familiar e mesmo número de transferência masculinas e femininas por clínica

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41 Equine ccffdna Objetivos: Detecção da presença do ccffdna no plasma de éguas prenhas e determinação do sexo fetal através de SRY-PCR Realizar um estudo de validação pré-desenvolvimento de um teste de laboratório

42 Material e Métodos: Equine ccffdna População em estudo: 20 éguas prenhas 2 éguas vazias 2 éguas virgens DNA genômico de 10 fêmeas DNA genômico de 10 machos Coleta e preparação da amostra: Sangue venoso é coletado e processado (centrifugações) dentro de 15 mim Extração do ccffdna 1mL de plasma QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) (Akolekar et al., 2010)

43 Material e Métodos: Equine ccffdna Sexagem Molecular: Padronizada com DNA genômico de macho e fêmea Sequenciamento Detecção do SRY (182 bp) Controle com GAPDH (150 bp) 10µL como template da reação de PCR Controles: NTC (no-template control ) Controle negativo (DNA genômico de fêmea) Controle positivo (2% de DNA genômico de macho) * Confirmação do sexo fetal no nascimento

44 Equine ccffdna Resultados: Padronização do SRY-PCR SRY-PCR SRY- Sequenciamento

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46 Resultados: Equine ccffdna Table 1. Sensitivity of molecular sexing by SRY and GAPDH genes amplification in equine circulating cell-free fetal DNA (ccffddna). Samples SRY PCR % (n/total) ccffdna Male pregnancy 72.7 (8/11) Female pregmancy 0 (0/9) Control Genomic DNA Male 100 (10/10) Female 0 (0/10) Control mares ccffdna non-pregnant 0 (0/2) ccffdna virgin 0 (0/2) GAPDH PCR % (n/total) 100 (11/11) 100 (9/9) 100 (10/10) SRY 2 nd -PCR* % (n/total) 90.9 (10/11) 0 (0/9) 100 (10/10) GAPDH 2 nd -PCR % (n/total) 100 (11/11) 100 (9/9) 100 (10/10) SRY/PCR: Acurácia 85% (17/20) 100 (10/10) 0 (0/10) 100 (10/10) SRY qpcr % (n/total) 90.9 (10/11) 0 (0/9) 100 (10/10) 0 (0/10) SRY/2 nd -PCR e qpcr : Acurácia 95% (19/20) 100 (2/2) 100 (2/2) 0 (0/2) 0 (0/2) 100 (2/2) 100 (2/2) 0 (0/2) 0 (0/2) GAPDH qpcr % (n/total) 100 (11/11) 100 (9/9) 100 (10/10) 100 (10/10) 100 (2/2) 100 (2/2)