Autor: Professor Dr. Dile P. Stremel

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1 1 Autor: Profeor Dr. Dile P. tremel 01) Tente decrever como é o crecimento populacional e o ambiente no qual e deenvolve uma cultura celular. Quai fenômeno ocorrem, dificuldade de modelagem cinética, etc. De acordo com a morfologia, durante o crecimento celular, organimo unicelulare que e dividem aumentam em biomaa de acordo com o número de célula preente. Quando coniderando organimo como o mofo ou bolore (fungo), o comprimento e número de micélio(conjunto de hifa) aumentam enquanto o organimo crece. O crecimento do mofo aumenta em tamanho e denidade ma não neceariamente em número. Aociado com o crecimento etão doi outro proceo: conumo de material do ambiente celular e liberação de metabólito e produto finai no meio. A alteraçõe no proceo variam amplamente enquanto o crecimento ocorre. A célula conomem nutriente e convertem ubtrato do ambiente em produto. A célula gera calor e por ua vez a temperatura do meio fixa a temperatura da célula. Interaçõe mecânica ocorrem atravé da preão hidrotática e efeito de fluxo do meio para a célula e da mudança na vicoidade devido ao acúmulo de célula e produto metabólito celulare. O Ambiente no qual o microorganimo e deenvolve, ou meio, nota-e que é um itema multicomponente que deve conter todo o nutriente enquanto a célula crece e diferente produto e. A célula produz componente que influenciam o ph do meio, que por ua vez influencia a atividade celular e proceo de tranporte. Durante o curo de reaçõe celulare, a temperatura do caldo, ph, força iônica e propriedade reológica podem mudar com o tempo. O ambiente celular é freqüentemente um itema multifáico conitindo de meio líquido dipero com gá ou um itema líquido-líquido no qual fae imicívei etão preente, ou alguma veze um itema trifáico com dua fae líquida e uma gá Quanto à caracterítica da população celular, cada célula é um itema multicomponente complexo que não é homogêneo, nem memo a nível celular. Muita reaçõe independente ocorrem imultaneamente na célula, ujeito a controle de adaptação interno. Ete controle interno proporcionam à célula a capacidade e a propriedade de e adaptar a atividade e tipo de reaçõe que ocorrem na célula como função do ambiente celular. Em longo tempo de cultivo podem ocorrem mutaçõe ou o itema pode forçar à um delocamento genético da população. Além do mai, em uma cultura de crecimento, encontra-e ignificante heterogeneidade célula a célula. Ito é, a nível unicelular, diferente célula na população em um dado ponto no tempo e em um dado ponto ou região no epaço variam com repeito à idade. Claramente, não é poível formular um modelo cinético que inclua toda a caracterítica mencionada. No entanto é poível formular alguma aproximaçõe e implificar a repreentação do itema de forma a repreentar a cinética populacional. Com repeito ao ambiente é prática comum formular o meio de forma que todo o componente, exceto um etejam preente em concentraçõe uficientemente elevada, de forma que a variação na concentraçõe do demai não altere ignificativamente a taxa globai. Deta forma um nutriente torna-e limitante e deve-e coniderar omente a concentração dete componente quando analiando o efeito da compoição do meio na cinética de crecimento. Ocaionalmente é neceário incluir no modelo outro componente do meio, tal como produto inibitório que acumula no meio em ordem para obter uma decrição adequada para a cinética celular. Controle externo ão neceário para regular e manter contante algun parâmetro ambientai tai como: ph, temperatura e concentração de oxigênio diolvido. De outra forma é neceário uma decrição multicomponente do ambiente no modelo para repreentar adequadamente o intervalo deejado de comportamento cinético.

2 2 02) É poível formular um modelo com todo o fenômeno envolvido, explique? Não, geralmente procura-e implificar o modelo, poi a conideração de inúmero fenômeno envolvido pode er complexa, memo porque a conideração de um modelo complexo requer um conhecimento batante amplo do mecanimo celular e do mecanimo de adaptação do microorganimo. Memo a conideração de um meio multifáico muita veze requer conhecimento experimental de algun parâmetro, o que muita veze não é poível. A dificuldade de formulação encontram retriçõe, principalmente na determinação experimental para dar uporte à formulação. 03) O que é um modelo não etruturado? e etruturado. Qual é mai idealizado e por quê? Um modelo pode er etruturado ou não etruturado, de acordo com o número de componente utilizado na repreentação celular. Repreentaçõe celulare que ão multicomponente ão chamado etruturado, enquanto repreentaçõe celulare por um componente único ão não etruturado. O modelo mai idealizado é o modelo não etruturado, poi conidera a célula como um componente único e nete cao não e tem uma vião do caminho de reaçõe biológica na célula. Quando e incorpora caracterítica do ciclo celular no modelo, a validade e a faixa de aplicaçõe do modelo celular aumenta. 04) De acordo com o balanço material para o reator batelada, e você etivee modelando o crecimento, qual parâmetro teria de er etimado e de que forma você procederia? Para um biorreator batelada, o balanço para o crecimento celular pode er expreo pela equação 01, onde V é o volume do biorreator. d ( VX ) = V r (01) x A velocidade de reação é proporcional ao numero de célula preente ou quantidade de biomaa (X) rx = µ x X (02) A velocidade epecífica de crecimento µ depende da fae de crecimento no biorreator, é um parâmetro a er etimado para a equação 03. Coniderando o crecimento na fae exponencial µ é contante dx = µ x X Ou: 1 dx µ x = = d[ lnx] / (04) X Integrando a equação dede uma concentração inicial de inoculo (Xo), conhecida, obtém-e 05. Atravé de um ajute linear com o dado experimentai da fae exponencial, pelo mínimo quadrado pode-e obter o valor de µ ln X = ln X o + µ x t (05) Com o valor etimado pode-e calcular qualquer valor de X para um determinado tempo de fermentação x ( t-t lag ) X X 0 e µ = (06) (03)

3 3 05) Decreva o Reator Bioquímico abaixo e ecreva a equação para o componente i, upondo que o proceo não etá no etada etacionário. Que tipo de equaçõe reultam para i componente?. (a) X f f C if X V C i X C i (b) CTR para cultivo contínuo de célula (a) Principai componente de um CTR de laboratório e (b) notação uada na modelagem e análie de biorreatore O reator acima é conhecido como quimiotato 1. Nete cao o itema é agitado perfeitamente, de forma que a compoiçõe não variam em nenhuma poição do reator. Em um reator com uprimento de oxigênio que também exerce agitação no itema, juntamente com a hélice do agitador. Um rotâmetro mede o fluxo de ar neceário ao proceo. De outra forma, ocorre a formação de gá enquanto ocorre reação biológica. Uma análie do efluente atravé de um analiador on-line dá uma medida do grau de converão da reação e permite a determinação de outro produto atravé de uma inpeção etequiométrica, tomando por bae o CO 2 e o O 2 efluente.. Meio etéril é adicionado por meio de uma bomba peritáltica ao biorreator, continuamente e produto é retirado continuamente, aim como o permite a retirada de amotra de líquido para análie de concentração de açúcar e célula. Percebe-e que o proceo é aeróbio devido a neceidade de adição de oxigênio ao proceo. O itema de gae contém filtro de ar, poi a adição de O 2 não pode ter contaminação, tem de er ar etéril, nete cao o proceo exige eterilidade. Modelo Para deenvolver o modelo no etado traniente ou não etacionário para o componente i, conidera-e que há acúmulo ou variação do componente i ao longo do tempo: 1 Quimiotato Trata-e de um reator contínuo operando na região de valore de D para o quai X varia pouco, endo um proceo que varia pouco, cuja compoição química é contante, atravé da introdução de ubtrato pela alimentação. Turbiodato Deigna-e como proceo contínuo operando na região de grande variação de X. Nee cao ajuta-e a vazão de alimentação de forma a manter X contante, mantendo a turbidez do meio contante.

4 4 aída : dc ( if Ci ) V rfi i V F C + = (08) Dividindo pelo volume do reator, uma vez que o memo não varia, poi a vazão de entrada é igual a vazão de dci F = ( Cif Ci ) + r (09) fi V Rearranjando: dci ( if Ci ) + rfi = D C onde D é a taxa de diluição (relação entre a vazão pelo volume, com unidade h -1 ) (10) Para i componente, tem-e: dc dc. 1 2 dc n = D C ( C ) 1f = D C = D C ( C ) 2f f 2 ( nf Cn ) + rfn r f1 + r (11) na notação vetorial: C = D( Cf C) + r & (12) Nete cao tem-e um itema de equaçõe diferenciai ordinária a erem reolvida por um método de integração numérica do tipo Euler ou Runge-Kutta. Devido à natureza não linear da velocidade de reação, a olução numérica é facilmente implementada em computador, podendo-e incorporar diferente modelo cinético para levar em conta fenômeno de inibição pelo ubtrato, produto ou pela própria célula, ou ainda manutenção celular e morte. 06) O que é um nutriente limitante? Quando um nutriente paa a não er limitante? Ante de coniderar o detalhe da dependência da taxa de crecimento no uprimento de nutriente, deve-e reviar a idéia gerai e prática para contrução do meio de cultura celular. Nó ditinguimo doi tipo de meio de acordo com ua contituição. Um meio intético é aquele que tem uma compoição química bem definida, tal meio pode er contituído com um uplemento mineral como a neceária fonte de carbono, nitrogênio e energia, aim como vitamina. Em adição, para fornecer o neceário íon para a adequada função celular, a bae mineral do meio também contém componente tampão para reduzir flutuaçõe de ph durante o crecimento. Meio complexo contêm materiai de compoição indefinida, por exemplo extrato de levedura. Outro meio comun incluem caldo de carne, infuão de angue e cérebro(bhi), liquor contituído a bae de milho (corn teep liquor), reíduo. O objetivo de e preparar um meio adequado é fornecer condiçõe para um bom crecimento e produção de alta taxa de íntee. Contrário a intuição, não neceariamente, o uprimento de nutriente tem de er adicionado em grande exceo. Ainda mai concentração exceiva de um nutriente pode inibir ou até memo envenenar o crecimento da célula, além de tudo e uma célula crece muito extenivamente. O metabólito acumulado do produto final deetabilizará o proceo bioquímico normal da célula. Conequentemente, é prática comum limitar o crecimento limitando a quantidade de nutriente do meio. e a concentração de um elemento eencial do meio é variável enquanto a concentraçõe de todo o componente do meio ão mantida contante, a taxa de crecimento

5 5 varia de uma forma hiperbólica. Uma relação entre a taxa epecífica de crecimento e um elemento eencial do meio foi propoto em A relação de Monod etabelece que: µ µ = K + Aqui, µ é a taxa máxima de crecimento alcançável quando >>K e a concentraçõe de todo o componente ão inalterada. K é a concentração de nutriente limitante na qual a velocidade epecífica de crecimento é metade do eu valor máximo, falando uperficialmente, é a divião entre o intervalo baixo concentração, onde µ e torna fortemente dependente (linear) de e intervalo alto de concentração onde µ e torna independente de. Como motrado na figura 2 o valore de K para o crecimento da E-coli em meio de glicoe e tryptophan ão 0,22x10-4 M e 1,1ng/mL repectivamente. Conhecendo-e a bioquímica celular, abe-e que a equação de Monod é uma grande implificação, aim como em outra área da Engenharia, há equaçõe imple que expream interrelaçõe embora o ignificado fíico do parâmetro ejam deconhecido ou memo não exitam. (13) de Figura.2 Dependência da velocidade epecífica de crecimento limitante da E-coli (a) meio com glicoe e (b) Meio com tryptofano (com permião de Prenctice Hall, Inc, Englewood Cliff, New Jérei) A forma da equação de Monod caracteriza diferente ituaçõe. Freqüentemente o valor de K é muito pequeno. Para muito maior que K, o que ocorre na maioria da ituaçõe. A equação pode er compreendida como uma adequada decrição do devio de µ, em relação a µ quando a concentração de torna-e pequena. Para muito menor que K,, o comportamento de µ, é finito para uma determinada concentração de finita de. 07) Explique o fenômeno do wah-out (ue o recuro gráfico e o modelo matemático para auxiliar na explicação) Quando a taxa de crecimento de uma população etá relacionada de acordo com uma equação de Monod, conecçõe emergem entre a condiçõe operacionai do reator, cinética microbial e parâmetro etequiométrico. Para motrar ete fato, ecreve-e um balanço de maa em termo de ubtrato limitante acoplado ao balanço de maa celular uma vez que µ depende de. No balanço de ubtrato faz-e uo do fator de rendimento Y x maa de célula formada Y x = (14) maa de ubtrato conumida Para entender e modelar a cinética populacional, nete cao emprega-e modelo etruturado, que conideram omente a maa celular ou concentração em número de célula para caracterizar a biofae ou fae biótica. A taxa

6 6 líquida de crecimento r x é freqüentemente coniderada como µx onde x é a maa de célula por unidade de volume e µ tem unidade do recíproco de tempo e é chamado de velocidade epecífica de crecimento da célula. Uando eta forma de repreentação (crecimento balanceado) em um CTR para o balanço de célula, tem-e: dx = D X ( X) + r 0 f x = (15) No etado etacionário é válido dx = D( X f X) + rx = 0 (16) Como não há célula endo alimentada no itema (alimentação etéril) X f =0 DX r x = 0 (17) Reecrevendo em termo de velocidade epecífica de crecimento DX= µ x X Eta equação motra que uma população diferente de zero é mantida dentro do reator, omente e a taxa de diluição for igual à velocidade epecífica. O balanço de maa para o ubtrato é ecrito então por: 1 (19) Y ( ) µ x 0 D f = x Ou, ubtituindo µ, na equação anterior, tem-e: 1 µ x 0 (20) Y ( ) D f = x ( K + ) Ecrevendo um balanço celular no etado etacionário, tem-e: µ x 0 (21) ( x) D x f = ( K + ) A equaçõe 20 e 21 ão o modelo quimiotato de Monod. Rearranjando: a equação 21, obtém-e 22 µ ( K + ) D x + D x f = 0 Coniderando que a alimentação x f é etéril, a concentração de ubtrato pode er calculada como função da taxa de diluição. D K = (23) ( µ D) Para calcular a concentração de célula, coniderando-e alimentação etéril, recorre-e ao fator de converão microorganimo/ubtrato (Y x ): ( x xf ) ( ) x Yx = = (24) o Iolando-e o valor da concentração celular e levando-e em conta que a concentração na alimentação é etéril, tem-e: ( o ) Yx x = (25) (18) (22)

7 7 ubtituindo-e o valor da concentração de ubtrato, eq. 23 na expreão anterior, tem-e: DK x = Yx f ( µ D) (26) A equaçõe 23 e 26 contém a dependência explícita de x e na taxa de diluição (D=F/V). Para fluxo pequeno a um dado volume, D tende a zero, então tende a zero. Uma vez que todo ubtrato alimentado é conumido pela célula, a concentração de célula no efluente é: x= Y x f Quando D aumenta continuamente, aumenta inicialmente linearmente com D e então mai rapidamente quando D tende a µ. A concentração celular x declina com o memo comportamento, primeiro linearmente em D, então diminuindo rapidamente quando D tende a µ. Em algum ponto D e aproxima de µ, x torna-e zero. A taxa de diluição implemente ultrapaou a máxima taxa poível de crecimento e o valor de etado etacionário para x é zero. Eta condição de perda de célula no etado etacionário, chamado wah-out ocorre para D maior que D, onde x=0, nete cao a concentração de ubtrato no reator alcança o valor de entrada f. D µ f = (27) K + f Figura 3 Dependência da concentração de ubtrato do efluente, concentração celular x e produtividade celular xd, em relação à taxa de diluição D em cultura contínua (Modelo de Monod, µ = 1 h-1; K = 0,2 g/l; Y x = 0,5; f = 10 g/l) Note que próximo ao wah out o reator é muito enível a pequena variaçõe em D; uma pequena variação em D fornece um relativo delocamento em x e. A enitividade pode er compreendida e a produção de maa celular é o objetivo do cultivo contínuo. A taxa de produção celular por unidade de volume de reator é Dx. Eta quantidade é ilutrada na figura 3 e aqui, é máximo. Calcula-e o valor máximo de concentração de aída reolvendo a equação: ( Dx) d = 0 (28) dd onde a equação 26 é uada para ecrever x como função de D. Reolvendo a eq.28, fornece-e: K D = µ 1 (29) K + f Quando f for muito maior que K que é o cao freqüente, o valor de D, aproxima-e de µ e coneqüentemente o wah out e aproxima. Eta ituação é evidente na figura 3, o que pode requerer uma deitência da obtenção da máxima produção de biomaa, para evitar a região de grande enibilidade. Incluõe de

8 8 apecto prático de enibilidade, controlabilidade e confiabilidade em problema de otimização, tal como ete devem er levado em conideração no alcance de objetivo quantificado Quando analiando a produção de produto finai de uma fermentação contínua, introduz-e o coeficiente de rendimento Y px, definido por: maa de produto formado Y px = (30) aumento da maa celular Em algun cao Y px pode variar, ma coniderando-e nete cao aumir valor contante. Ua-e ete coeficiente de rendiemnto para ecrever o balanço de produto. No cao da fermentação contínua em etado etacionário, tem-e para o balanço de produto: D 1 µ x (31) Y ( p p) x 0 Então: f = px Ypxµ x x p= pf + = 0 (32) D Combinado com equaçõe anteriore relacionando µ e x ao parâmetro do proceo, a equação 32 permite o cálculo da concentração de produto no efluente. A taxa de produção é definida por pd, a qual é imizada para Y px contante, quando D tem o valor epecificado na eq.29. O objetivo é a máxima produção também conciliada com o apecto de enibilidade. Algun etudo de cao revelam não adequação do modelo de Monod à alta e muito baixa taxa de diluiçõe. Eta explicaçõe etão no iten 7.2.2, e (Bailey &Oli, 1986). Reumidndo, há a neceidade de e ampliar ou incluir modificaçõe no termo cinético para levar em conta o metabolimo endógeno, manutenção celular, ou ugerir taxa epecífica de crecimento que levam em conta diferene dependência (pág 391, equaçõe 7.29, 7.30 e 7.31) da cinética de crecimento, como o modelo de Teier, Moer e Contoi. Outro Modelo de Crecimento Outro modelo para a velocidade epecífica de crecimento foram propota de acordo com cao particulare que forneceram bom ajute a dado experimentai. Por exemplo, Teiier, Moer e Contoi, que ugerem o eguinte modelo: K ( 1 e / ) λ ( 1+ K ) 1 µ =µ Teier (33) µ = µ Moer (34) µ =µ Contoi (35) BX+ A dua primeira equaçõe reultam equaçõe algébrica com oluçõe mai complicado que a forma de Monod. A equação de Contoi contém uma contante aparente a qual é proporcional à concentração de biomaa X. O último termo diminui a velocidade epecífica de crecimento quando a deidade da população aumenta levando a µ X 1. A velocidade epecífica de crecimento pode er inibida pelo contituinte do meio tal como ubtrato e produto. Um exemplo é Andrew, a qual propõem que a inibição pelo ubtrato tem a forma: µ =µ (36) 2 K + + / K i p Fermentação alcoólica fornece um exemplo de inibição pelo produto; a fermentação anaeróbia da glicoe por levedura foi tratada por Aiba, hoda e Nagatani com a função K P µ =µ (37) K i+ K P+ P É poível que doi ou mai ubtrato ejam imultaneamente limitante do crecimento. Enquanto pouco dado ão diponívei, a dependência de Monod em cada nutriente pode er expreo por:

9 9 1 1 µ =µ (38) K1+ 1 K 2+ 1 na auência de dado convincente para eta forma, a mema erve como indicador que o creciento depende de vário nutriente limitante. 08) Geralmente em um proceo contínuo pode haver perda de viabilidade celular(mote), ou decrécimo na concentração celular, qual modificação tem de er levado em conideração no modelo cinético de crecimento para ete fenômeno? Como comentado no final do item 07, alguma ituaçõe preciam er incluída no termo cinético, nete cao devido à exautão de nutriente pode ocorrer o metabolimo endógeno no qual a célula conomem ubtancia celular, ou implemente a perda de viabilidade devido ao aparecimento de ubtância tóxica. Então é neceário incluir no modelo um termo a mai no temo de cinético de crecimento. Repare que a cinética é linear em relação a x, ma não linear em relação a. Nete cao (k e x) é a taxa de morte celular µ rx = x k ex (33) K + 09) Qual forma de velocidade epecífica de crecimento é dependente da concentração celular? Explique. A velocidade epecífica de crecimento propota por Monod é apena função da concentração de ubtrato. Contoi propõem o eguinte model dependente da concentração celularpara levar em conta o efeito inibidor do crecimento µ µ = (34) Bx + 10) Proponha Uma velocidade epecífica de crecimento, função exponencial, que eja inibida pela concentração de produto? Pode-e modificar a equação de monod, para levar em conta a inibição pelo produto, exitem vária forma de inibição, a exponencial é uma dela µ K P µ = ( e P ) (35) K + Na equação K P é uma contante de inibição pelo produto, determinada experimentalmente e P é a concentração de produto. No cao de P aumentar, a velocidade epecífica decrece exponencialmente com P, verifique. 11) Que fatore influem na velocidade de crecimento? A concentração de ubtrato dependendo e é limitante ou inibidor, a denidade celular, a concentração de produto, a preença de doi ou mai ubtrato limitante do crecimento. Outro fatore ambientai importante, como a temperatura, ph, atividade da água(preença de oluto no meio), preão hidrotática e oxigênio diolvido influenciam a velocidade epecífica de crecimento conideravelmente. 12) Durante um proceo de fermentação, ocorre coniderável conumo de ubtrato. Analiando a equação de Monod, nota-e que deveria haver uma aparente diminuição na velocidade epecífica de crecimento, o que não e oberva na prática, por quê? Na prática, procura-e trabalhar com concentração bem acima da concentração de ubtrato limitante, nete cao o valor de é muito maior que K e praticamente a velocidade epecífica de crecimento é igual a velocidade epecífica máxima de crecimento 13) Comente obre a cinética de formação de produto. A mai imple cinética de formação de produto aparece quando há uma imple conecção entre a formação de produto, a utilização de ubtrato ou o crecimento celular. A formação de produto pode er ecrita como: r = Y p ou: r = Y p p px r r x (36) (37)

10 10 Tai cao aparecem em fermentaçõe do tipo I. A fermentação alcoólica é um exemplo deta clae. Tal cinética de formação de produto ão alguma veze chamada de crecimento aociado. Em muita fermentaçõe, epecialmente aquela envolvendo metabólito ecundário, não ocorre ignificante formação de produto em um pequeno tempo de proceamento. A fermentação da penicilina exibe tal comportamento, nete cao o modelo cinético para repreentação é do tipo não aociado. No cao não aociado, a taxa de produção é proporcional à concentração celular (βx) ao invé da taxa de crecimento (αr x ). O etudo cláico de Leudeking e Piret em fermentação do ácido acético por Lactobacillu delbrueckii é um exemplo de proceo em que há uma contribuição cinética aociada e não aociada: r p = αr x + βx Eta expreão envolvendo doi termo cinético, freqüentemente chamado de cinética Leudeking-Piret tem ido útil e verátil no ajute de dado para a formação de produto de diferente fermentaçõe. Eta é uma cinética eperada quando o produto é o reultado do metabolimo energético em fermentaçõe anaeróbia. No cao do primeiro e egundo termo da equação 39 (apó o inal de igual), ete podem er identificado como energia uada para o crecimento e manutenção, repectivamente. A figura a eguir ilutram a claificação de produto(metabólito) microbiano de acordo com o crecimento (1)crecimento aociado; (2) Crecimento mito; (3) Crecimento não aociado). (38) Metabólito primário: é aquele que é produzido durante a fae de crecimento exponencial do microrganimo. Um exemplo típico dete tipo de metabólito é a produção de álcool. O etanol é um produto do metabolimo anaeróbico de levedura e alguma bactéria e é formado como parte do metabolimo energético. Uma vez que o crecimento ó pode ocorrer e houver produção de energia, a produção de etanol etá aociada ao crecimento. Outro exemplo: aminoácido, nucleotídeo, ácido orgânico e enzima. Metabólito ecundário: produzido durante a fae etacionária de crecimento ou idiofae, ou eja a produção não aociada ao crecimento celular. Contituem o grupo mai comum e importante do metabólito de interee indutrial. Como exemplo cláico podemo citar a produção de antibiótico. Principai caracterítica do metabólito ecundário: - cada tipo é formado por relativamente pouco m.o. - não ão eenciai para o crecimento e reprodução celular - ua formação é extremamente dependente da condiçõe de crecimento (meio) poi a repreão pode ocorrer - produzido freqüentemente como um grupo de compoto etruturalmente relacionado - podem er uperproduzido mai facilmente que o primário poi não ão ligado ao crecimento. 14) Comente obre modelagem de biorreatore: Proceo fermentativo decontínuo, decontínuo alimentado, emicontínuo, continuo Proceo fermentativo decontínuo: A fermentaçõe decontínua vêm endo utilizada há muito ano, e no dia de hoje ainda ão muito empregada em divero proceo fermentativo. Também conhecida como fermentaçõe em batelada, ão contituída de um reator, muita veze mencionado como dorna, que é carregado com microorganimo, endo inoculada e incubada. No decorrer do proceo fermentativo nada é adicionado, exceto oxigênio (proceo aeróbio), antiepumante e ácido ou bae. Uma da caracterítica báica dete proceo é a contância volumétrica, poi e admite não haver adiçõe de oluçõe no proceo e nem memo evaporação com perda de líquido. Conite no preparo de inóculo e propagação em volume maiore A técnica de preparação compreende dua fae ditinta: a de laboratório e indutrial. No laboratório e faz a inoculação de um pequeno volume de meio nutriente, incubado em condiçõe favorávei, tranferindo-e para um volume maior e aim uceivamente. O cao aplica-e até a fae indutrial onde o volume neceário é obtido. O cuidado dentro do proceo variam conforme o objetivo do memo: Vale lembrar que a tranferência devem er efetuada na fae logarítmica do proceo.

11 11 O proceo fermentativo decontínuo cotumam er claificado em trê grande grupo: 1. Cada dorna recebe um inóculo. 2. Proceo com recirculação do microorganimo. 3. Proceo por meio de corte. A fermentação decontínua pode levar a baixo rendimento e/ou produtividade, quando o ubtrato adicionado de uma ó vez no início da fermentação, exerce efeito de inibição, repreão ou devia o metabolimo celular a produto que não inteream. Apreenta também tempo morto, período em que o fermentador não etá endo utilizado, como na carga e decarga. Entretanto poui alguma vantagen de batante importância. Apreenta meno rico de contaminação, tem grande flexibilidade de operação, pode realizar fae uceiva no memo recipiente, tem capacidade de identificar todo o materiai relacionado quando e etá deenvolvendo um determinado lote de produto. Uada na indútria farmacêutica. Também de grande aplicação na indútria de alimento, dentro da produção de divero iten: iogurte, chucrute, cerveja, vinho entre outro. A velocidade epecífica de crecimentona fae eponencial também pode calcular a partir do tempo de duplicação celular, atravé da equação obtida ubtituindo-e a concentração final pelo dobro da inicial, na eq. 05 ln td = µ = (39) µ x x Proceo fermentativo decontínuo alimentado Ete proceo também é conhecido como batelada alimentada. Pode er definido como uma técnica em que um ou mai nutriente ão adicionado ao fermentador durante o cultivo e em que o produto permanecem aí até o final da fermentação. Alguma caracterítica importante podem er denotada: A vazão de alimentação pode er contante ou variar com o tempo. A adição do moto pode er de forma contínua ou intermitente. Pode haver ou não mudança de volume, poi depende da concentração de ubtrato e da taxa de evaporação. Cada condição de trabalho, pode levar a diferente perfi de concentração de ubtrato, célula e produto. É intereante obervar que ao contrário do itema cláico decontínuo, nete cao podemo ter um perfil de concentração de microorganimo decrecente, poi a adição de moto a dorna paa a er um valor importante. Vale alientar que apó o enchimento da dorna, o proceo paa a ter caracterítica cláica. A eguir obervamo uma figura que ilutra o modo de operação de tal proceo. F moto Inóculo Figura 4. Modo de operação proceo decontínuo alimentado Devido à diveridade de aplicaçõe que encontramo, alguma variaçõe podem ocorrer para realizar ajute e adequá-lo a neceidade. Abaixo denotamo algun dele e ua caracterítica principai: Proceo decontínuo alimentado repetitivo trata-e de retirar rapidamente um determinado volume de meio fermentado da dorna, endo recompoto até eu valor máximo atravé da adição de moto. Ete proceo tem por objetivo aproveitar como inóculo o microorganimo que etá crecendo com alta velocidade de crecimento e trabalhar com célula que etão na fae produtiva por mai tempo, repectivamente, levando ao aumento de produtividade do itema. Ete proceo é utilizado para produção de levedura e antibiótico.

12 12 Proceo decontínuo alimentado etendido tem por finalidade etender o período de fermentação, mantendo nívei de concentração de ubtrato no reator adequado para que a célula continuem com atividade fermentativa direcionada para a formação do produto deejado. Além dea claificação o proceo também pode er de dua forma: Controlada por mecanimo de retroalimentação:o fornecimento pode er controlado como função da concentração dete no meio de fermentação, direto ou indireto como denidade otica, ph, etc Não controlado por itema de retroalimentação: O ubtrato é fornecido ininterruptamente até o final da fae de enchimento da dorna. Abaixo decrevemo alguma finalidade do proceo de fermentação decontinua alimentada: - Minimização do efeito de controle do metabolimo celular. A utilização dete proceo é importante porque regula a concentração do meio, não propiciando uma uperprodução de enzima ou produto que afete na eficiência do microorganimo, alterando por coneqüência ua obrevivência. - Prevenção da inibição por ubtrato ou precurore. O controle de vazão na alimentação permite que e evite o trabalho em condiçõe inibitória, melhorando a produtividade e/ou rendimento dee proceo fermentativo - Minimização da formação de produto de metabolimo tóxico. O controle da velocidade de fornecimento de ubtrato ao itema permite que e mantenha a velocidade de crecimento celular em intervalo deejado e/ou minimize a formação de produto tóxico para a célula. - uperação de problema freqüente de etabilidade em proceo contínuo - Para controlar problema como: contaminação, mutação e intabilidade de plamídeo. Em algun cao o proceo contínuo forma produto indeejávei, ou memo acarreta perda por evaporação, então e utiliza o proceo decontínuo alimentado que controla ete produto formado (como a epuma na formação do etanol) e também repõe líquido perdido (como na produção de antibiótico). Proceo emicontínuo O proceo é emicontínuo, quando uma vez colocado no reator o meio de fermentação e o inóculo, a operaçõe que e eguem obedecem à equencia: Operação 1 Aguarda-e o término da fermentação Operação 2 Retira-e parte do meio fermentado, mantendo-e no reator o retante do meio fermentado Operação 3 Adiciona-e ao reator um volume de meio de fermentação igual ao volume de meio fermentado retrado na operação 2 Um proceo emicontínuo é aim coniderado quando uma érie de operaçõe é realizada em eqüência. Primeiro aguarda-e o término da fermentação, depoi e retira parte do meio fermentado, mantendo-e o retante no reator, adicionando ao reator um volume de meio de fermentação igual ao volume de meio fermentado. Pode-e dizer que o meio fermentado não retirado do reator erve de inóculo ao meio de fermentação adicionado. Claifica-e como emicontínuo porque tanto o fluxo de entrada do meio no reator quanto à aída de material fermentado ão intermitente. No interea aber de que maneira a fração do volume retirado do fermentador interfere na produtividade do proceo.

13 13 Proceo Contínuo: O proceo contínuo é extremamente verátil quanto à ua poibilidade de operação Contínuo em um único etágio (um único reator) 1. em reciclo de célula. 2. com reciclo de célula Contínuo em múltiplo etágio (n reatore em érie) 1. com uma única alimentação (com ou em reciclo de célula) 2. com múltipla alimentaçõe (com ou em reciclo de célula) No divero tipo de operaçõe, também teremo ditinto comportamento de etado. Ete ditinto comportamento erão decrito a eguir. Modelagem para reator contínuo ideal em reciclo de célula O meio de cultura contendo o ubtrato limitante em uma determinada concentração, é alimentado a uma vazão contante. Admite-e agitação perfeita, endo o reator coniderado homogêneo. Abaixo temo repreentado o equema de funcionamento: Figura 5 - itema contínuo em um único etágio, em reciclo de célula A modelagem para ete cao já foi dicutida anteriormente no item 07, a equaçõe reultante para o modelo do itema da figura 5 pode er reumido: dx = D(X o X) + µ X (63) d X = D(0 ) µ (64) YX dp = D(Po P) + µ P X (65) Agora podemo fazer dua conideraçõe: 1. Normalmente temo uma alimentação de meio eterilizado, então X o =0 2. Coniderando no etado etacionário, então dx / = 0. Temo então que: µ = D (66) X = Y X 0 K µ D D (67) P X Produtividade em célula: K D = DX + DYX 0 µ D (68) O arrate de célula, embora não recomendável, é uualmente utilizado para a determinação da velocidade epecífica de crecimento µ. Para tanto parte-e de um valor contante, µv=d, impondo-e uma vazão epecífica de alimentação nitidamente uperior a µ de forma a obter um decrécimo na concentração celular no reator.

14 14 itema contínuo com reciclo de célula. itema com reciclo interno de célula Nete itema uma fração de célula é mantida no reator, eja atravé de uma imple edimentação, ou atravé do emprego de um filtro na aída de líquido do reator. À primeira vita parece etranho o fato de e coniderar a exitência de uma purga, conforme apreentado abaixo, de fato ua exitência não é etritamente neceária. Ea aída direta do caldo fermentado, em filtração, permite maior controlabilidade do proceo em termo de manutenção do etado etacionário do itema. Na figura abaixo obervamo equema de funcionamento: F o cf X, (1-c)F hx, Figura 6 - itema continuo em um único etagio, com reciclo interno de célula No cao de um tratamento de reíduo, onde o objetivo é a degradação da matéria orgânica, temo valore mai baixo de concentraçõe reiduai de ubtrato, ignificando deta maneira menor tempo de reidência para atingir o valore neceário de degradação. itema com reciclo externo. Nete itema o líquido efluente circula atravé de um eparador de célula, de maneira que uma corrente concentrada de célula retorna ao fermentador, enquanto uma outra (filtrada ou permeado), ai praticamente ienta de célula. Abaixo obervamo um equema do itema: F o F,X, (1-c)F hx cf gx af gx Figura 7 - itema contínuo em um único etágio com reciclo externo de célula itema contínuo com múltiplo etágio: Oberva-e nete entido algun tipo de proceo: - itema com uma única alimentação - itema com múltipla alimentaçõe

15 15 - itema com reciclo de célula, com uma ou com múltipla alimentaçõe. De um modo geral, o itema em múltiplo etágio proporcionam diferente ambiente para o deenvolvimento de célula, ao e mudar de um etágio para outro. Aim podemo empregar condiçõe otimizada ditinta em cada reator. Poderia-e uar por exemplo um reator para otimizar a condiçõe de cultivo e no outro imizar a produção. A modelagem matemática empregada é imilar ao exemplo anteriore demontrado, endo que devemo no cao de múltipla alimentação, devemo coniderar a vária corrente de alimentação. Figura 8 - itema contínuo em múltiplo etágio com uma alimentação e com reciclo Figura 9 itema contínuo em múltiplo etágio, com múltipla alimentaçõe e com reciclo