RAPHAEL FERNANDO BRAGA GONÇALVES

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1 RAPHAEL FERNANDO BRAGA GONÇALVES AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA E VIABILIDADE DE FOLÍCULOS PRÉ- ANTRAIS OVINOS APÓS CRIOPRESERVAÇÃO E CULTIVO IN VITRO DE CURTA DURAÇÃO FORTALEZA 2011

2 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS RAPHAEL FERNANDO BRAGA GONÇALVES AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA E VIABILIDADE DE FOLÍCULOS PRÉ- ANTRAIS OVINOS APÓS CRIOPRESERVAÇÃO E CULTIVO IN VITRO DE CURTA DURAÇÃO FORTALEZA

3 RAPHAEL FERNANDO BRAGA GONÇALVES AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA E VIABILIDADE DE FOLÍCULOS PRÉ- ANTRAIS OVINOS APÓS CRIOPRESERVAÇÃO E CULTIVO IN VITRO DE CURTA DURAÇÃO Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de pequenos ruminantes. Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues. FORTALEZA

4 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho G635a Gonçalves, Raphael Fernando Braga Avaliação da morfologia e viabilidade de folículos pré-antrais ovinos após criopreservação e cultivo in vitro de curta duração / Raphael Fernando Braga Gonçalves f. : il. color., enc. ; 30 cm. Dissertação (Mestrado) Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Medicina Veterinária, Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias, Fortaleza, Área de Concentração: Reprodução Animal Orientação: Profª Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues. 1. Criopreservação. 2. Cultivo in vitro. 3. PROH. 4. Tecido ovariano. 5. Ovinos. I. Título. CDD:

5 RAPHAEL FERNANDO BRAGA GONÇALVES AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA E VIABILIDADE DE FOLÍCULOS PRÉ- ANTRAIS OVINOS APÓS CRIOPRESERVAÇÃO E CULTIVO IN VITRO DE CURTA DURAÇÃO Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre Ciências Veterinárias. Aprovada em: / / BANCA EXAMINADORA Profa Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues Universidade Estadual do Ceará (Orientadora) Profa Dra. Juliana Jales de Hollanda Celestino Universidade da Integração Internacional da Lusofonia Afro-brasileira Profa. Dra. Janaína Serra Azul Monteiro Evangelista Universidade Estadual do Ceará 5

6 A Deus, que torna tudo possível, Dedico 6

7 AGRADECIMENTOS Inicialmente, agradeço à Universidade Estadual do Ceará, por meio do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, pela oportunidade de realizar esta pós-graduação, meio pelo qual poderei lutar por uma vida digna e um futuro melhor para mim e toda a minha família. Agradeço também à CAPES, pelo incentivo financeiro na forma de bolsa de estudo, e ao Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-antrais (LAMOFOPA), pela estrutura oferecida para a realização do meu trabalho. Sem as instituições citadas, nada teria sido possível. Agradeço à minha família, nas pessoas do meu pai Walter Rosa Gonçalves Filho, minha mãe Gláucia Marisa Braga Gonçalves, meu irmão Marcello Augusto Braga Gonçalves, minha irmã Ana Gabriela Braga Gonçalves, minha avó Maria da Conceição Ramos Braga e também aos meus cãezinhos e gatinhos. Obrigado por sempre estarem lá quando preciso e por representarem o que há de mais importante na minha vida. À minha namorada e melhor amiga, Hylana Lima, por ter sempre um abraço, um carinho, uma bronca ou palavras de apoio para me oferecer. Sem você, meu amor, a vida seria mais amarga e eu não seria capaz de ver o amanhã brilhar. À minha orientadora, Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues, pela paciência inenarrável, pela oportunidade oferecida e pelo exemplo de seriedade, e ao meu co-orientador, o Dr. José Ricardo de Figueiredo, pelo profissionalismo, caráter e pela delicadeza no trato com as pessoas, reconhecendo e aceitando a humanidade alheia. A toda equipe do LAMOFOPA, em especial para Franciele Lunardi, Anelise Alves, Valdevane Araújo, Anderson Almeida e Gerlane Modesto, pela ajuda nos experimentos e pelos momentos de descontração que fazem o trabalho menos árduo e a rotina menos cansativa. Aos colegas da turma de mestrado, em especial para Agostinho Neto e Eudson Júnior, pelas conversas divertidas e os debates em alto nível, que me engrandeceram intelectualmente e muito acrescentaram ao meu caráter. 7

8 Aos meus irmãos Jessênios, pela companhia agradável e a busca por uma existência plenamente feliz e iluminada em meio a essa dura e escura realidade em que vivemos. Aos meus grandes amigos Patrick Mesquita, Rafael Ximenes, Victor Moura, Diego Diógenes, Carlos Junior, Valério da Rocha, Raphael Moreno, e muitos outros dos quais não citarei os nomes para não me alongar demais, mas que, ao lerem estas linhas, saberão que a eles me refiro, por todo o apoio, todas as risadas e todos os momentos felizes. Sou uma pessoa de muita sorte por ter tantos irmãos amados, tantas pessoas com as quais eu posso contar sempre. Obrigado por estarem na minha vida. A todos que, de alguma forma, contribuíram com a realização deste trabalho e me deram forças para continuar. MUITO OBRIGADO! 8

9 Daí a César o que é de César, e a Deus o que é de Deus (Jesus Cristo, o Cordeiro de Deus) 9

10 RESUMO A criopreservação de tecido ovariano tem como principal objetivo a manutenção deste tecido para sua posterior utilização, garantindo a preservação do material biológico de mulheres e fêmeas de animais de alto valor genético. Embora a criopreservação de tecido ovariano seja extensamente estudada, diversos pontos ainda necessitam ser elucidados, como a definição da concentração e tempo de exposição do agente crioprotetor a ser utilizado. Além disso, ainda não foram obtidos resultados satisfatórios relacionados ao cultivo in vitro de tecido ovariano previamente criopreservado. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivos definir um protocolo eficiente para a criopreservação de tecido ovariano ovino utilizando o propanodiol (PROH) como agente crioprotetor e avaliar o tecido ovariano previamente criopreservado após cultivo in vitro de curta duração. Para tanto, o tecido ovariano foi fragmentado e exposto (5, 10 ou 20 minutos) e/ou congelado utilizando PROH em duas diferentes concentrações (1,0 ou 1,5 M). Os fragmentos de cada tratamento foram submetidos à avaliação da morfologia folicular por Histologia Clássica e à análise de viabilidade pela utilização do corante Azul de Tripan. Em seguida, após a definição do protocolo mais adequado (melhor tempo de exposição e concentração de PROH), foi realizado o cultivo in vitro do tecido ovariano por 2 ou 4 horas para posterior análise da morfologia e viabilidade folicular conforme descrito anteriormente. Os dados obtidos foram analisados por ANOVA seguida dos testes t de Student e SNK, para verificar as diferenças entre os percentuais de folículos morfologicamente normais, ou do teste do Qui-Quadrado, para identificar diferenças nos percentuais de folículos viáveis. Os resultados obtidos demonstraram que a exposição por 5 minutos seguida de criopresevação do tecido em solução de 1,5 M de PROH garantiu um percentual de folículos viáveis semelhantes ao tecido fresco (P>0,05). Durante o período de cultivo in vitro, os folículos apresentaram uma redução significativa (P<0.05) na percentagem de folículos normais e viáveis em comparação ao tecido fresco. Assim, o presente trabalho concluiu que é possível criopreservar eficientemente o tecido ovariano ovino utilizando 1,5 M de PROH e exposição por 5 minutos, embora ocorra uma redução gradual na qualidade folicular do tecido criopreservado submetido a curtos períodos de cultivo in vitro. Palavras-chave: Criopreservação, Cultivo in vitro, PROH, Tecido ovariano, Ovinos. 10

11 ABSTRACT Ovarian tissue cryopreservation aims the maintenance of this tissue for later use, ensuring the preservation of the biologic material from women and high genetic valuable animals. However, many points has yet to be studied, as the definition of cryopotectant concentration and exposure time. Moreover, it hasn t been achieved successful results, in sheep, after in vitro culture of cryopreserved tissue. In this context, this work aimed to define an optimum protocol for sheep ovarian tissue cryopreservation using PROH as crioprotectant and to evaluate the responsiveness of cryopreservated tissue to a short-term in vitro culture. Then, the ovarian tissue was fragmented, exposed (5, 10 or 20 minutes) and/or cryopreserved using PROH (1,0 or 1,5M). Fragments from each treatment were submitted to morphology evaluation by Classic Histology and to viability analysis by Typan blue staining. Thereafter, with the definition of the most appropriate cryopreservation protocol (best exposure time and concentration of PROH), cryopreserved tissue was cultured for 2 or 4 hours in order to evaluate the effects of short-therm in vitro culture over follicular morphology and viability by the same techniques described previously. Data were analyzed with ANOVA followed by Student s t and SNK tests, in order to verify differences between percentages of morphologically normal follicles, or Chi-square test, in order to evaluate differences between percentages of viable follicles. Our results showed that the exposure for 5 minutes before cryopreservation in 1,5M PROH maintained similar percentages of viable follicles than fresh tissue (P>0,05). This protocol was selected and used for the short-term in vitro culture step. We observed that, as in vitro culture goes on, follicles suffer significant gradual loss in their morphology, what was confirmed by viability analysis (P<0,05). Thus, this work concludes that is possible to properly cryopreservate sheep ovarian tissue using 1,5M PROH and 5 minutes exposure. Moreover, it occurs a gradual quality reduction of follicles obtained from short-term cultured tissue after cryopreservation procedure. Keywords: Cryopreservation, In vitro culture, PROH, Ovarian tissue, Ovine. 11

12 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Representação esquemática do ovário de mamífero...17 Figura 2 Fotomicrografias de tecido ovariano ovino. A e B evidenciam, respectivamente, folículos pré-antrais normais e degenerados do grupo controle fresco. C, D e E apresentam, respectivamente, folículos normais e degenerados dos grupos controle e criopreservado e incubação por 2 (INC 2) ou 4 horas (INC 4) Figura 3 Fotomicrografias de folículos pré-antrais marcados ou não por Azul de Tripan nos grupos controle fresco e criopreservado, e nos grupos incubados por 2 (INC 2) ou 4 horas (INC 4)

13 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Percentagem de folículos pré-antrais morfologicamente normais após exposição por 5, 10 ou 20 minutos à solução contendo 1,0 ou 1,5 M de propanodiol seguida, ou não de congelação lenta do tecido ovariano ovino...49 Tabela 2 Percentagem de folículos viáveis após exposição por 5, 10 ou 20 minutos e congelação lenta de tecido ovariano ovino utilizando 1,5 M de propanodiol...50 Tabela 3 Percentagem de folículos morfologicamente normais e viáveis após criopreservação de tecido ovariano ovino incubado ou não por 2 (INC 2) ou 4 horas (INC 4)

14 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Ovário dos mamíferos Foliculogênese População e atresia folicular Criopreservação Métodos de criopreservação Agentes Crioprotetores Etapas da Congelação Lenta Avaliação de folículos pré-antrais criopreservados JUSTIFICATIVA HIPOTESES OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos CAPÍTULO 1 - Congelação lenta de tecido ovariano ovino utilizando PROH seguida de incubação de curta duração CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFRÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

15 1. INTRODUÇÃO Os folículos pré-antrais compreendem cerca de 90-95% da população folicular, armazenando a grande maioria dos oócitos presentes nos ovários de mamíferos (FIGUEIREDO et al., 2008). No entanto, esse contingente de folículos ovarianos, naturalmente declina ao longo da vida reprodutiva da fêmea, independente da espécie ou raça, reduzindo, consequentemente, a fertilidade do animal, caracterizando-se em um fator negativo, sobretudo para animais de produção. A morte inesperada de uma fêmea de alta produtividade ou a interrupção da sua função reprodutiva por razões que não comprometam a gônada ovariana é também outro fator negativo para a produtividade animal. Desta forma, no campo da Medicina veterinária, visando preservar o material genético de fêmeas de alto valor zootécnico ou preservar espécies e raças em vias de extinção, faz-se necessária a criação de bancos de células germinativas femininas, o que pode ser possível através da criopreservação de folículos pré-antrais isolados (SUGIMOTO et al., 2000; HOLT, 2001; AMORIM et al.,2003) ou inclusos no tecido ovariano (RODRIGUES et al., 2004; SANTOS et al., 2006; ISACHENKO et al., 2009). Para a Medicina humana, a criopreservação de tecido ovariano representa uma excelente alternativa para restabelecer a fertilidade de mulheres com risco de falha ovariana prematura em consequência de quimio e/ou radioterapia, empregadas no tratamento contra o câncer (CHOI et al., 2008). Neste caso, vários nascimentos de indivíduos normais têm sido relatados após transplantes de tecido ovariano previamente criopreservado (Donnez et al., 2011). Apesar de promissora, a criopreservação de tecidos e a sua posterior reutilização possuem uma série de desafios a serem superados pela criobiologia. A criopreservação, dentre outros prejuízos, pode induzir a ruptura e perda da integridade celular, perda de atividade mitocondrial (SANTOS et al., 2006) e dano no citoesqueleto (SMITH et al., 2004). Desta forma, é muito importante a definição de um protocolo eficiente de criopreservação que possibilite a preservação eficiente dos tecidos. Para tanto, um dos pontos críticos é a escolha correta do agente crioprotetor, haja vista que essas substâncias podem ser tóxicas às células quando concentrações e/ou tempos de exposição são empregados de forma inadequada. Embora diversos trabalhos tenham sido realizados nos últimos anos visando aperfeiçoar os protocolos de criopreservação de tecido ovariano ovino (AMORIM et al.,2003; SANTOS et 15

16 al.,2006, 2007; PINTO et al., 2008, FAUSTINO et al., 2010), mais investigações ainda são necessárias para minimizar as crioinjúrias promovidas durante este processo. Dentre as alterações observadas em folículos pré-antrais logo após a descongelação ou aquecimento do tecido ovariano, destacam-se a baixa densidade folicular na suspensão e a visualização de folículos extremamente retraídos, após procedimento de isolamento folicular. Esses dois fatores dificultam o resgate e a análise da viabilidade folicular, respectivamente. Portanto, acredita-se que uma incubação (sem a intenção de promover crescimento folicular) pós-descongelação do tecido ovariano permita que o mesmo restabeleça a normalidade térmica e metabólica. Além disso, as células foliculares poderiam, ainda, expressar morfologicamente o dano molecular que possa ter ocorrido durante a criopreservação (PAYNTER et al., 1999). A presente dissertação, a qual envolve basicamente a preservação de tecido ovariano, deu origem a um artigo técnico, intitulado: Congelação lenta de tecido ovariano ovino utilizando PROH seguida de incubação de curta duração. Para facilitar a compreensão deste trabalho, os aspectos relacionados ao ovário dos mamíferos, foliculogênese, população e atresia folicular e, princípios básicos da criopreservação serão explicados na revisão de literatura a seguir. 16

17 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Ovário dos mamíferos O ovário é o mais importante órgão do sistema reprodutor feminino (Fig.1). Nos mamíferos, este órgão apresenta duas regiões: a cortical e a medular. A primeira corresponde à região mais periférica do órgão, contendo folículos ovarianos em diversos estádios de desenvolvimento, bem como corpos hemorrágicos, lúteos e albicans. A região medular corresponde à porção mais interna, constituída por tecido conjuntivo, algumas células musculares lisas, nervos, artérias e veias que se estendem para dentro do córtex ovariano (CORMACK, 1991), responsáveis pela nutrição e sustentação do ovário (HAFEZ & HAFEZ, 2004). No entanto, deve-se ressaltar que nos eqüídeos, em geral, a região medular do ovário se desenvolve rapidamente durante a vida fetal, o que faz com que essa região envolva o parênquima do órgão, de modo que o ovário destas espécies apresenta a medula disposta externamente e o córtex localizado internamente (HAFEZ & HAFEZ, 2004). Além de exercer importante função endócrina, responsável pela produção de diversos hormônios e fatores de crescimento essenciais para o desenvolvimento reprodutivo do animal, o ovário caracteriza-se também por exercer uma função exócrina, ou gametogênica, responsável pela produção e liberação de oócitos (HAFEZ & HAFEZ, 2004). Essa função é determinada pela interação entre dois fenômenos que ocorrem no ovário, isto é, a oogênese e a foliculogênese (SAUMANDE, 1991). Figura 1. Representação esquemática do ovário de mamífero. Fonte: 17

18 2.2 Foliculogênese O folículo é a unidade morfofuncional do ovário, sendo constituído por um oócito circundado por células somáticas (células da granulosa e tecais) (FIGUEIREDO et al., 2008). Desta forma, é importante conhecer bem o processo de formação, crescimento e maturação folicular, iniciando com a formação do folículo primordial e culminando com o estádio de folículo de De Graaf ou pré-ovulatório (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005), em processo denominado foliculogênese. Didaticamente, podemos dividir este conjunto de eventos em duas fases: 1) Fase pré-antral, que corresponde à ativação dos folículos primordiais e ao crescimento dos folículos primários e secundários; e 2) Fase antral, subdividida em crescimento inicial e terminal dos folículos terciários e caracterizada pela presença de uma cavidade antral (HAFEZ & HAFEZ, 2004). Na fase pré-antral, o folículo primordial é formado quando o oócito começa a ser circundado por uma monocamada de células somáticas pavimentosas de origem celômica, denominadas células da pré-granulosa (RÜSSE, 1983). Ainda na vida pré-natal, alguns folículos primordiais são ativados e gradualmente adquirem células da granulosa de formato cúbico, tornando-se folículos de transição, caracterizados pela presença de células da granulosa com ambos os formatos pavimentoso e cúbico (SILVA et al., 2004). Em seguida, quando o oócito é circundado por uma camada completa de células da granulosa de formato cúbico, passam a ser chamados de folículos primários (GOUGEON & BUSSO, 2000). Os folículos são denominados secundários quando apresentam duas ou mais camadas de células da granulosa, células da teca organizadas em torno da membrana basal (BARNETT et al., 2006). Posteriormente, os folículos passam a ser denominados terciários ou antrais, caracterizados pela organização das células da granulosa em várias camadas e pela formação de uma cavidade repleta de líquido folicular, denominada antro. O fluido folicular que preenche esta cavidade contém água, eletrólitos, proteínas séricas e alta concentração de hormônios esteróides secretados pelas células da granulosa (BARNETT et al., 2006). As diferentes categorias de folículos ovarianos também estão representadas na Figura 1. 18

19 2.3 População e Atresia Folicular Em ruminantes e primatas, sugere-se que a população folicular é estabelecida ainda na vida fetal (BETTERIDGE et al., 1989), enquanto que em roedores ainda observa-se a formação de folículos ovarianos em um curto período após o nascimento (FORTUNE et al., 1994; HIRSHIFIELD, 1991). No entanto, alguns estudos demonstram a possibilidade de uma nova formação de células germinativas em fêmeas adultas (mulheres: BUKOVSKY et al., 2004; camundongas: JOHNSON et al., 2004). O número de folículos presentes no ovário de uma fêmea depende de diversos fatores. Além da variação individual, existe uma grande diferença com relação às espécies, o que impulsionou a realização de diversos estudos estimando a população folicular de camundongas (SHAW et al., 2000), cabras (LUCCI et al., 1999), ovelhas (DRIANCOURT et al., 1991), vacas (BETTERIDGE et al., 1989) e mulheres (ERICKSON, 1986). Outros fatores também podem ter grande influência, como raça (CAHILL et al., 1979), idade (RÜSSE, 1983), níveis hormonais (PETERS, 1976), herança genética (ERICKSON, 1966), estado reprodutivo (ERICKSON et al., 1976) e nutricional (SCARAMUZZI et al., 1993). Apesar do grande número, o percentual de folículos ovarianos que geralmente chega ao estádio ovulatório é muito pequeno. Estima-se que aproximadamente 99,9% destes folículos sejam eliminados em conseqüência de um processo natural conhecido como atresia (FIGUEIREDO et al., 2008), que pode ocorrer por via degenerativa necrótica (BRAS et al., 2005) ou apoptótica (MARKSTRÖM et al., 2002). Além da perda folicular natural que ocorre no ovário, fatores externos como a aplicação de radio e/ou quimioterapia para o tratamento de tumores malignos também podem causar a depleção dos folículos ovarianos, tornando a fêmea infértil. Atualmente, a medicina reprodutiva, tem tentado evitar esse prejuízo, principalmente em mulheres jovens, criopreservando o tecido ovariano antes do tratamento para posterior reimplantação após a cura da doença. 2.4 Criopreservação A criopreservação de tecido ovariano tem como objetivo implantar um banco de oócitos e/ou folículos pré-antrais, os quais estão localizados no córtex ovariano, e representam a reserva principal de gametas femininos (DEMERCI et al., 2003).Diversos estudos têm relatado que a criopreservação de tecido ovariano pode ser utilizada para preservar gametas, 19

20 restaurando a fertilidade de fêmeas de diversas espécies (humana: DEMEESTERE et al., 2007; ovina: ALMODIN et al., 2004; murina: CARROLL et al., 1991). Em humanos, a criopreservação tem sido considerada como uma importante ferramenta para a clínica reprodutiva, haja vista a constatação da retomada da função ovariana pelo transplante de tecido ovariano previamente criopreservado, após o tratamento quimio e/ou radioterápico (AUBARD et al., 2001; LEE et al., 2001; OKTAY et al., 2004). No caso da reprodução de animais domésticos, a criopreservação também é muito importante, uma vez que o tecido ovariano de fêmeas que vêm a óbito de forma inesperada ou de fêmeas oriundas de raças ou espécies em risco de extinção pode ser preservado, salvaguardando a capacidade reprodutiva desses indivíduos. Neste caso, o tecido ovariano previamente criopreservado pode ser usado em auto ou xenotransplantes, ou submetidos ao cultivo in vitro, visando promover o crescimento e a maturação dos oócitos inclusos nos folículos pré-antrais (DEMIRCI et al., 2003) para sua posterior utilização em programas de fertilização in vitro (FIV) e transferência embrionária Métodos de criopreservação Existem dois métodos de criopreservação comumente utilizados para células e tecidos: a congelação lenta e a vitrificação. A congelação lenta consiste na exposição do tecido à baixas concentrações de agentes crioprotetores (ACP) (PAYNTER et al., 2000), seguida por resfriamento lento e gradual, utilizando freezer programável (OSKAM et al., 2011). A vitrificação consiste em uma alternativa prática à congelação lenta (RALL & FAHY, 1985), através do qual o material biológico é exposto a altas concentrações de ACP por um curto período, seguido de resfriamento ultra-rápido e transformação da água extracelular em um meio altamente viscoso com organização sólida amorfa, denominada estado vítreo. Além disso, nesse método não se exige a necessidade de equipamentos caros e sofisticados (Wowk, 2010). Apesar das vantagens apresentadas pela vitrificação, até o momento a congelação lenta tem se mostrado mais eficiente para criopreservação de tecido ovariano. Em bovinos, os resultados obtidos têm sido bastante animadores, demonstrando que até 88% dos folículos pré-antrais podem sobreviver ao processo de criopreservação (CELESTINO et al., 2008). Dentre outros resultados importantes, podemos destacar o nascimento de cordeiros (SALLE et 20

21 al., 2003) e crianças (MEIROW et al., 2007) após a congelação e transplante de fragmentos do tecido ovariano Agentes Crioprotetores Agentes crioprotetores são solventes orgânicos utilizados sozinhos ou em associação visando proteger as células contra os danos causados durante a desidratação, resfriamento e pela redução extrema de temperatura (GUYADER-JOLY, 1998). Além disso, também moderam os efeitos letais da formação de gelo intracelular e gelo na matriz extracelular dos tecidos conjuntivos (ELMOAZZEN et al., 2005). Entretanto, para que a utilização de um ACP proporcione resultados satisfatórios é necessário que o mesmo apresente características desejáveis, como alta solubilidade em soluções salina aquosa, baixo peso molecular para proporcionar uma rápida e completa penetração na célula ou tecido; baixa toxicidade (PEGG et al., 1974) e alta estabilidade às temperaturas reduzidas (DE LA VEGA & WILDE, 1991). Esses agentes crioprotetores podem ser classificados como intracelulares ou extracelulares. Crioprotetores intracelulares possuem baixo peso molecular e a capacidade de substituir a água intracelular, penetrando na célula a fim de interagir e influenciar a dinâmica dos microfilamentos e microtúbulos (DOBRINSKY, 1996). Dentre os mais empregados, podemos destacar o etilenoglicol (EG), o dimetilsulfóxido (DMSO), o glicerol (GLI) e o propanodiol (PROH ou 1,2-propanodiol). Estudos demonstram que este último ACP tem sido bastante utilizado para a criopreservação de tecido ovariano, razão pela qual tem realizado vários experimentos utilizando essa substância como componente de soluções de congelação. O 1,2-propanodiol (Massa molar: 76,08 g/mol; densidade: 1,036 g/cm³) é um álcool diol sintetizado a partir da hidrólise direta do óxido de propileno ou ainda a partir do glicerol, através de uma reação de hidrogenólise (MOTA et al., 2009). Este ACP é considerado um crioprotetor de baixa toxicidade, capaz de proteger a célula contra a desidratação que ocorre durante a congelação (WUSTEMAN et al., 2008), sendo, portanto, um dos ACP mais utilizados para criopreservação de oócitos humanos (KÜÇÜK & BASER, 2007). No tocante à criopreservação de tecido ovariano, o PROH tem sido utilizado em diferentes concentrações (1,0 M: AMORIM et al., 2007; 1,5 M: OSKAM et al., 2011; 2,0 M: COMMIN, et al., 2010 e 3 M: RODRIGUES et al., 2004) e tempos de exposição (10 min.: DEMERCI et al., 2001; 14 min.: AMORIM et al., 2004; 20 min.: BORGES et al., 2009; 30 min.: OKTAM et al., 2011). Ainda com relação ao tecido ovariano, após a congelação lenta de tecido ovariano ovino, a 21

22 concentração de 1,5 M deste ACP não proporcionou danos morfológicos severos, sugerindo a possibilidade de aplicação desse protocolo para o autotransplante do tecido ovariano pósdescongelação (GUTIÉRREZ et al., 2000). No entanto, apesar dos efeitos benéficos do PROH na congelação do tecido ovariano, estudos têm demonstrado que o PROH pode ter uma variedade de efeitos metabólicos negativos, tais como inibição do transporte de Na+ independente de d-glicose (MORSHED et al., 1994), inibição do crescimento celular (MOCHIDA & GOMYODA, 1987) e liberação de lactato celular e consequente acidificação (SCHOLMERICH et al., 1989), que comprometeria a viabilidade dos folículos inclusos no tecido ovariano durante o processo de criopreservação (CELESTINO et al., 2008). Embora amplamente utilizado na criopreservação de diversas estruturas em diferentes espécies, os estudos aplicando o PROH como agente crioprotetor envolvem, principalmente, a técnica de congelação lenta, que sera abordada com maiores detalhes no tópico posterior. Já com relação aos crioprotetores extracelulares, sabe-se que estes são substâncias de baixo (galactose, glicose, sacarose e trealose) ou elevado (polivinilpirrolidona, álcool polivinílico, hialuronato de sódio, albumina sérica bovina e Ficoll 70) peso molecular que agem sem penetrar na célula, suplementando a solução de criopreservação e aperfeiçoando a ação dos crioprotetores intracelulares. Dentre esses, um dos mais utilizados é a sacarose, que age como um tampão osmótico contra o estresse causado durante a adição e remoção do crioprotetor intracelular (MANDELBAUM et al., 1988) Etapas da Congelação Lenta Os protocolos de congelação lenta podem ser divididos em cinco etapas: 1) período de equilíbrio ou exposição aos ACP; 2) resfriamento, indução da formação de gelo extracelular e a congelação propriamente dita; 3) estocagem em baixas temperaturas (normalmente em nitrogênio líquido); 4) descongelação; e 5) remoção ou diluição do crioprotetor (FAHNING & GARCIA, 1992). O período de equilíbrio consiste no tempo necessário para que o ACP penetre adequadamente nas células (ELMOAZZEN et al., 2005), o que pode ser considerado o primeiro passo para um processo de criopreservação eficiente. O tempo de exposição varia com o tipo de material biológico que será criopreservado, uma vez que a difusão do crioprotetor em um tecido constituído por diferentes tipos celulares necessita de uma 22

23 exposição mais prolongada do que no caso de células isoladas, permitindo assim que concentrações adequadas possam atingir o centro do tecido (NEWTON et al., 1998). À medida que a temperatura cai e se aproxima de 0 C, a célula e seu meio externo gradualmente atingem um estado de super-resfriamento que acarreta na formação de gelo no meio extracelular. A partir desse momento, os fenômenos físicos subsequentes vão depender diretamente da curva de resfriamento. Se a congelação ocorrer lentamente, a célula perde água, uma vez que a pressão de vapor d água na célula excede aquela do exterior celular congelado, e, com a progressiva redução da temperatura, a água se difunde do meio intracelular para a solução extracelular e é convertida em gelo na superfície das células (SANTOS, 2000). Quando o potencial hídrico das células parcialmente desidratadas se iguala àquele do gelo extracelular, um equilíbrio é estabelecido e uma desidratação adicional não ocorrerá contanto que a temperatura permaneça constante. Quando essa desidratação ocorre de forma muito intensa, a concentração da solução intracelular aumenta sensivelmente, o que pode ser prejudicial ao material criopreservado. Entretanto, se a célula for congelada muito rapidamente, a desidratação por congelação não ocorre, as células se tornam cada vez mais super-resfriadas e a solução intracelular, que contém alto teor de água livre, congela-se, formando cristais de gelo que causam injúrias mecânicas às células (STEPONKUS & WEBB, 1992). Para reduzir a formação dos cristais de gelo intracelulares durante essa fase, deve-se induzir a formação extracelular de gelo, através do processo denominado seeding, que previne o super-resfriamento e inicia o processo de desidratação (OKTAY et al., 2001). Isso pode ser realizado tocando-se a parede do recipiente que contém o material a ser congelado, utilizando uma pinça de metal previamente resfriada a -196 C (FABBRI et al., 2000). A desidratação celular continua durante o processo de resfriamento até -30 C. Neste ponto, a concentração de crioprotetor intracelular é alta o bastante para impedir a formação de gelo intracelular (STACHECKI & COHEN, 2004). Nesse estádio, o material está pronto para ser armazenado em nitrogênio líquido (-196 C). O processo de descongelação é um momento crítico para o sucesso da criopreservação. Neste momento, o aquecimento faz com que a água intracelular comece a descongelar. Assim, duas situações indesejáveis podem acontecer: primeiramente, a água descongelada pode congelar-se novamente antes que a temperatura ambiente seja atingida, formando novos cristais de gelo que vão lesar a célula; na segunda situação, microcristais de gelo que se formaram durante a congelação têm a oportunidade de coalescer, devido ao 23

24 aumento da temperatura, formando cristais grandes, os quais podem causar rompimento e morte das células. Assim, geralmente recomenda-se uma descongelação rápida independente do processo de congelação empregado, utilizando uma faixa de temperatura entre 35 e 40 C (SANTOS, 2000). Finalmente, após a descongelação é necessária a remoção dos ACP, uma vez que estes são substâncias potencialmente tóxicas. Essa remoção ocorre através de seguidas lavagens em meio semelhante à solução de criopreservação com concentrações decrescentes de ACP ou na ausência total destes. Após esta fase, o material biológico, que pode ser o tecido ovariano contendo os folículos pré-antrais está teoricamente pronto para ser utilizado em técnicas de reprodução assistida. No entanto, é importante que sejam aplicadas técnicas que possam avaliar a morfologia e a viabilidade funcional desses folículos antes da sua utilização Avaliação de folículos pré-antrais criopreservados Como destacado anteriormente, o processo de criopreservação pode acarretar severos danos às células. Dentre estes, destacamos alterações ocasionadas pela formação de gelo intracelular, que promovem o rompimento de membranas basais, membranas plasmáticas e organelas, e o efeito solução, que promove desidratação celular excessiva e consequente destruição de componentes das membranas e injúrias de proteínas intracelulares. Associado a este, a toxicidade do crioprotetor também pode provocar severas injúrias às células, uma vez que favorece a ocorrência de alterações osmóticas e bioquímicas, como o estresse oxidativo, através da peroxidação lipídica que destrói a membrana plasmática celular. Neste contexto, é necessário que se avalie o material criopreservado de modo que se possa garantir a eficiência do protocolo e ainda elucidar possíveis falhas e aprimoramentos cabíveis ao protocolo utilizado. Nesse contexto, a histologia clássica é o método preferencialmente empregado por diversos pesquisadores. Através da associação de corantes (Hematoxilina e Eosina - HE; Ácido Periódico de Schiff e Hematoxilina - PAS-Hematoxilina), é possível identificar alterações morfológicas significativas, como a picnose nuclear, indicativo de atresia da célula, danos citoplasmáticos, destacamento das células da granulosa e danos na membrana basal (DEMIRCI et al., 2003), os quais comprometem a função e desenvolvimento folicular normal. Contudo, estudos mostraram que a análise morfológica nem sempre pode ser correlacionada com a viabilidade e capacidade de desenvolvimento folicular (SCHOTANUS 24

25 et al., 1997; MARTINEZ-MADRID et al., 2004). Dessa forma, alguns métodos são empregados para avaliar outros aspectos relativos à preservação eficiente do folículo. Além da ultraestrutura (RODRIGUES et al., 2004a,b), avaliada através da microscopia eletrônica de transmissão, pode-se predizer a viabilidade folicular através dos marcadores fluorescentes calceína-am e etídio homodímero (SANTOS et al., 2006b). A utilização do corante vital Azul de Trypan (JEWGENOW et al., 1998) também pode ser uma ferramenta bastante eficiente na identificação de rupturas nas membranas plasmáticas das células foliculares, uma vez que este corante penetra apenas células que apresentam este tipo de lesão, marcando-as em azul. Paralelamente, o cultivo (RODRIGUES et al., 2005) e o transplante (SEGINO et al., 2007) dos fragmentos de tecido ovariano criopreservado podem servir como uma maneira segura de avaliar a capacidade do tecido de retomar sua atividade normal após o estresse osmótico e oxidativo causado pelo procedimento de criopreservação. Paynter et al. (1999) propuseram a realização de um cultivo de curta duração após a descongelação e remoção do ACP com a finalidade de recuperar a normalidade térmica e metabólica de folículos préantrais bovinos, uma vez que normalmente se observa uma notória retração dos folículos avaliados após a criopreservação. Nesse estudo, constatou-se o benefício do cultivo in vitro por até quatro horas. Adicionalmente, Borges et al.(2009) realizaram cultivo in vitro após a criopreservação de tecido ovariano da espécie suína, verificando também influência positiva sobre normalidade morfológica dos folículos pré-antrais inclusos neste tecido. Embora já exista vasta literatura abordando o sucesso na obtenção de crias de diferentes espécies após o transplante de tecido ovariano criopreservado, os resultados obtidos com o cultivo após a criopreservação ainda são passíveis de ajustes, sendo necessários mais estudos para ultrapassar essa barreira e explorar o potencial máximo da criopreservação de tecido ovariano. 25

26 3 JUSTIFICATIVA A criação de pequenos ruminantes na região Nordeste brasileira tem tido grande destaque nas últimas décadas, o que tem impulsionado grandes esforços para melhorar a produção dessas espécies. No entanto, a realidade sócio-econômica dessa região associada à dificuldade de abastecimento de água provocada pelas secas periódicas na região acarreta severos problemas sanitários e nutricionais, que afetam negativamente a função reprodutiva desses animais. Assim, com o intuito de aproveitar o potencial reprodutivo de animais de alto valor zootécnico e genético, tem se proposto a aplicação de diversas biotécnicas da reprodução. Neste contexto, a manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos préantrais (MOIFOPA), especificamente pela criopreservação de tecido ovariano, destaca-se pela capacidade de preservar a função reprodutiva de animais de grande valor, inclusive após sua morte, uma vez que possibilita a conservação dos milhares de oócitos inclusos nos folículos pré-antrais presentes no córtex do ovário, permitindo a implantação de bancos de germoplasma. No entanto, apesar dos esforços empreendidos para aperfeiçoar os protocolos de criopreservação de modo a manter a funcionalidade de folículos pré-antrais semelhantes à observada no tecido ovariano fresco ou não criopreservado, ainda necessitam de determinados ajustes. Conforme abordado anteriormente, para a criopreservação são utilizadas substâncias crioprotetoras visando minimizar a ocorrência de danos ao tecido criopreservado. Dentre essas substâncias, o 1,2-propanodiol (PROH) tem sido bastante utilizado em diferentes concentrações e tempos de exposição para congelação lenta de tecido ovariano, por apresentar baixa toxicidade e alta capacidade de proteger as células contra as crioinúrias. No entanto, conforme demonstrado na revisão de literatura, ainda não há um protocolo estabelecido para a criopreservação de tecido ovariano ovino utilizando PROH, explorando diferentes concentrações e tempos de exposição. Assim, é fundamental que, ao lançar mão do uso desta substância, isto seja realizado após ajustes minuciosos no protocolo, evitando exposição desnecessária das células a condições que agridam a homeostasia celular. Após análise histológica ou procedimentos de isolamento folicular a partir de fragmentos de córtex ovariano criopreservados, várias equipes relatam a retração dos folículos avaliados, o que dificulta a visualização e análise destes, e também não acontece normalmente com aqueles obtidos a partir do tecido fresco. Conforme demonstrado anteriormente, autores realizaram o cultivo in vitro do tecido ovariano criopreservado após a descongelação, 26

27 verificando melhorias na morfologia e viabilidade folicular, o que pode ter sido proporcionado por uma melhor visualização destes folículos como conseqüência de sua recuperação térmica e metabólica, o que não seria possível de outra forma. Assim, é de fundamental importância avaliar a eficácia de uma incubação de curta duração seguida do processo de descongelação, seja no intuito de melhorar a qualidade dos folículos recuperados para posterior análise ou para revelar danos provocados precocemente por um sistema de cultivo insuficiente para as necessidades do tecido criopreservado. Além disso, esta etapa foi testada com sucesso nas espécies suína e bovina, mas ainda não se sabe sua eficiência para o tecido ovariano ovino criopreservado. 27

28 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA Diante do exposto na revisão de literatura, foram formuladas as seguintes hipóteses científicas: 1) A criopreservação de tecido ovariano ovino utilizando o 1,2-propanodiol (PROH) como agente crioprotetor é capaz de manter a morfologia e a viabilidade de folículos pré-antrais; 2) É possível definir um protocolo para a criopreservação de tecido ovariano ovino utilizando o PROH, estabelecendo concentração e tempo de exposição, ótimos; 3) A realização de um cultivo in vitro de curta duração como etapa imediatamente posterior à descongelação do tecido ovariano melhora a qualidade dos folículos obtidos. 28

29 5. OBJETIVOS Geral Definir um protocolo eficiente de criopreservação por congelação lenta do tecido ovariano ovino usando o PROH como agente crioprotetor Específicos Determinar a(s) melhor(es) concentração(ões) e tempo(s) de exposição ao PROH para congelação lenta de tecido ovariano ovino; Verificar as alterações sobre a morfologia e viabilidade folicular após a congelação lenta do tecido ovariano ovino utilizando o PROH; Avaliar a eficácia de diferentes períodos de incubação ou cultivo in vitro de curta duração do tecido ovariano após descongelação sobre a morfologia e a viabilidade de folículos pré-antrais ovinos. 29

30 6 CAPÍTULO 1 Congelação lenta de tecido ovariano ovino utilizando PROH seguida de incubação de curta duração Sheep ovarian tissue slow freezing using PROH as cryoprotectant followed by short-term in vitro culture Períodico: Ciência Animal (Submetido em Outubro, 2011) 30

31 Congelação lenta de tecido ovariano ovino utilizando PROH seguida de incubação de curta duração Sheep ovarian tissue slow freezing using PROH as cryoprotectant followed by short-term in vitro culture Raphael Fernando Braga GONÇALVES 1*, Franciele Osmarini LUNARDI 1, Anelise Maria Costa Vasconcelos ALVES 1, Valdevane Rocha ARAÚJO 1, José Ricardo de FIGUEIREDO 1, Cláudio Cabral CAMPELLO 1, Ana Paula Ribeiro RODRIGUES 1 1 Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária, Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-antrais (LAMOFOPA) * - Para correspondência: raphaelfbg@gmail.com 31

32 Resumo A criopreservação de tecido ovariano tem como principal objetivo preservar este tecido até posterior utilização, garantindo a conservação do material biológico de mulheres e animais de alto valor genético. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivos definir um protocolo eficiente para criopreservação de tecido ovariano ovino utilizando PROH como agente crioprotetor e avaliar a resposta do tecido criopreservado incubado in vitro por curtos períodos. Assim, o tecido ovariano foi exposto (5, 10 ou 20 minutos) e/ou congelado utilizando PROH em duas diferentes concentrações (1,0 ou 1,5 M). Em seguida, após a definição do protocolo mais adequado, realizou-se a incubação deste tecido por 2 ou 4 horas. Em ambas as etapas, o tecido ovariano foi avaliado por Histologia Clássica, para análise da morfologia folicular, ou com o corante Azul de Tripan, para avaliação da viabilidade folicular. Verificou-se que a exposição por 5 minutos seguida de criopresevação do tecido em solução de 1,5 M de PROH garantiu percentual de folículos viáveis semelhantes ao tecido fresco (P>0,05). Com relação ao material criopreservado e cultivado in vitro por curtos períodos, foi demonstrado que, com o decorrer do cultivo, os folículos sofrem redução gradual no percentual de folículos morfologicamente normais em comparação ao tecido fresco, o que foi confirmado pela análise de viabilidade (P<0.05). Assim, o presente trabalho conclui que é possível congelar eficientemente o tecido ovariano ovino utilizando 1,5 M de PROH e exposição por 5 minutos, embora ocorra redução gradual na qualidade folicular do tecido criopreservado e submetido a curtos períodos de incubação. Palavras-chave: Criopreservação, Cultivo in vitro, PROH, Tecido ovariano, Ovinos. Abstract Ovarian tissue cryopreservation aims to maintain the tissue for later use, ensuring the preservation of biologic material from women and high genetic valuable animals. In this context, this work aimed to define an optimum protocol for sheep ovarian tissue cryopreservation using PROH as crioprotectant and to evaluate the responsiveness of cryopreservated tissue to a short-term in vitro culture. Then, the ovarian tissue was exposed (5, 10 or 30 minutes) and/or cryopreservated using PROH (1,0 or 1,5M). After the definition of the most appropriate protocol, the tissue was cultured for 2 or 4 hours. In both stages, 32

33 ovarian tissue was analyzed by Classic Histology, in order to evaluate follicular morphology, or viability analyzes by Trypan blue staining. We observed that the exposure for 5 minutes followed by cryopreservation in 1,5M PROH maintained similar percentages of viable follicles than fresh tissue (P>0,05). Thereafter, cryopreserved ovarian fragments were cultured for 2 or 4 hours. This procedure showed that, as in vitro culture goes on, cryopreservated ovarian tissue suffered gradual reduction in percentages of morphological normal follicles, what was confirmed by viability analysis (P<0,05). Thus, this work concludes that is possible to properly cryopreservate sheep ovarian tissue using 1,5M PROH and 5 minutes exposure. Moreover, it occurs a gradual quality reduction in follicles obtained from short-term cultured tissue after cryopreservation procedure. Keywords: Cryopreservation, In vitro culture, PROH, Ovarian tissue, Ovines. 1. Introdução Atualmente, diversos estudos têm sido realizados com o objetivo de maximizar o potencial reprodutivo de machos e fêmeas, empregando técnicas de reprodução assistida como a inseminação artificial, fecundação in vitro (FIV), a transferência de embriões e, em caráter mais experimental, a Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Préantrais (MOIFOPA). Essa técnica consiste em retirar os folículos ovarianos pré-antrais do ambiente fisiológico da fêmea, com a finalidade de cultivá-los in vitro até sua completa maturação (FIGUEIREDO et al., 2007). A MOIFOPA também envolve a criopreservação dos folículos ovarianos (inclusos ou não no tecido ovariano), objetivando assim conservar e difundir o material genético de fêmeas de alto valor zootécnico ou econômico que possam vir a óbito inesperadamente em plena fase reprodutiva. Além disso, pode ainda, restaurar a capacidade reprodutiva de mulheres jovens submetidas à quimio/radioterapia (CHOI et al., 2008). A criopreservação do tecido ovariano pode ser realizada tanto pelo método de congelação lenta ou convencional, como pelo método de vitrificação. Especificamente, no que concerne à técnica de congelação lenta, este método tem sido amplamente aplicado, garantindo a preservação eficiente de folículos pré-antrais de fêmeas suínas (BORGES et al., 2009), caprinas (RODRIGUES et al., 2004a,b), ovinas (SANTOS et al., 2006a,b), bovinas 33

34 (CELESTINO et al., 2008) e humanas (ISACHENKO et al., 2009). No entanto, a congelação lenta pode levar a danos letais e irreversíveis às células, causados pelos fenômenos da formação de cristais de gelo intracelulares e/ou efeito solução e choque osmótico (STACHEKI & COHEN, 2004). Com a finalidade de reduzir as injúrias causadas por esses fenômenos, muitos estudos têm sido realizados para aperfeiçoar os protocolos de criopreservação de tecido ovariano. Nesses estudos, aspectos como a concentração; tempo de exposição para a perfusão de crioprotetores (AMORIM, et al., 2003; RODRIGUES et al., 2004 a,b; SANTOS et al., 2006, 2007; CELESTINO et al., 2008; PINTO et al., 2008; LUZ et al., 2009) têm sido analisados no tocante à sua influência sobre a morfologia e viabilidade de folículos ovarianos após a descongelação ou aquecimento do tecido ovariano quando congelado ou vitrificado, respectivamente. A escolha do agente crioprotetor intracelular, bem como de sua concentração e tempo de exposição, consiste em ponto inicial para desenvolvimento de um protocolo eficaz para criopreservação de tecidos. Dentre os crioprotetores intracelulares, o PROH é considerado de baixa toxicidade, sendo capaz de proteger a célula contra a desidratação que ocorre durante a congelação (WUSTEMAN et al., 2008), sendo, portanto, um dos agentes crioprotetores mais utilizados para criopreservação de oócitos humanos (KÜÇÜK & BASER, 2007). Embora extensamente estudado em diversas espécies, ainda não se estabeleceu um protocolo definido para sua utilização em ovinos, envolvendo a concentração e o tempo de exposição, mais adequados para a criopreservação do tecido ovariano ovino que evite a ocorrência de crioinjúrias. Dentre as alterações observadas em folículos pré-antrais logo após a descongelação ou aquecimento do tecido ovariano, destacam-se a baixa densidade folicular na suspensão, bem como a visualização de folículos extremamente retraídos, fatores que dificultam o resgate e a análise da viabilidade/morfologia folicular, respectivamente. Neste contexto, Paynter et al. (1999) testaram diferentes tempos de cultivo após a descongelação e verificaram uma melhora no percentual de folículos normais obtidos quando o tecido era incubado por até quatro horas. Posteriormente, Borges et al. (2009), após realizar a criopreservação de tecido ovariano suíno, submeteram este material a um breve cultivo de 120 minutos após a descongelação, verificando, após o procedimento, melhores percentuais de folículos viáveis. No entanto, ainda não existem estudos abordando a resposta do tecido ovariano ovino criopreservado a este tipo de cultivo in vitro de curta duração, o que poderia também ser aplicado como um 34

35 indicativo do sucesso e adequação deste protocolo de cultivo à realidade do tecido criopreservado. O presente estudo foi realizado com o objetivo de definir um protocolo eficiente para a criopreservação do tecido ovariano ovino usando o PROH como agente crioprotetor e, avaliar a viabilidade de folículos pré-antrais após congelação seguida de cultivo in vitro de curta duração. 2 Metodologia 2.1 Comitê de Ética O presente trabalho foi submetido ao Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade Estadual do Ceará (CEUA-UECE) sob o número de registro /61, tendo sido aprovado em 28 de janeiro de 2011, estando de acordo com os princípios éticos de experimentação animal estabelecidos pelo comitê em questão. 2.1 Experimento I: Determinação do tempo de exposição e concentração do PROH para a congelação de folículos pré-antrais ovinos Origem, coleta e transporte dos ovários Para cada etapa, ovários de ovelhas sem raça definida (SRD) foram obtidos em abatedouros locais. Imediatamente após a coleta, os ovários foram lavados uma vez em álcool 70%, seguida por duas lavagens em Meio Essencial Mínimo (MEM) tamponado com HEPES (Sigma). Após a lavagem, os ovários foram transportados ao laboratório em tubos contendo 15 ml de MEM, em recipientes térmicos à temperatura de 20 C Exposição e congelação lenta do tecido ovariano na presença de PROH Nesta etapa do estudo foram utilizados 5 (cinco) pares de ovários. Um total de 13 fragmentos (3x3x1 mm) foi obtido a partir de cada par ovariano, sendo um destes fragmentos, imediatamente fixado em Carnoy por 12 horas (controle fresco). Os demais fragmentos (n=12) foram então colocados em macrotubos (MINITUB do Brasil Ltda., Porto Alegre, RS, 35

36 Brasil) de 2 ml e expostos a um volume de 1,8 ml de solução composta por MEM acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB), constituindo o MEM+, adicionado de PROH (1,2- propanodiol; 76 kda) nas concentrações de 1,0 ou 1,5 M. Os fragmentos ovarianos foram então mantidos a 20 C por 5, 10 ou 20 minutos a fim de se avaliar possíveis efeitos tóxicos da solução de criopreservação sobre a morfologia folicular. Após o término do período de exposição, um fragmento de cada tratamento (condição de exposição ao PROH) foi submetido à remoção do crioprotetor, enquanto o outro foi submetido à congelação lenta. Os fragmentos destinados à congelação foram transferidos para um freezer biológico programável (Freeze control, Cryobiologic Pty. Ltd., Warverley, Austrália), previamente estabilizado a uma temperatura de 20 C, e resfriados a uma taxa de 2 C/min até -7 C. Nesta temperatura, a formação de cristais de gelo (seeding) foi induzida utilizando-se uma pinça pré-resfriada em nitrogênio líquido. Em seguida, as amostras foram resfriadas a uma taxa de 0,3 C/min até -40 C e depois a 10 C/min até atingir -70 C quando então, os macrotubos foram removidos do freezer e imediatamente mergulhados em nitrogênio líquido (-196 C) Descongelação e remoção do agente crioprotetor Após um período mínimo de uma semana de armazenamento, os macrotubos contendo os fragmentos de ovário foram retirados do nitrogênio líquido e expostos à temperatura ambiente por 1 min., sendo, posteriormente, imersos em banho-maria a 37 C até a completa descongelação da solução crioprotetora. Em seguida, foi realizada a remoção do crioprotetor. Para tanto, todos os fragmentos foram retirados de seus respectivos macrotubos e lavados em 3 soluções compostas por MEM+ contendo concentrações decrescentes (0,5, 0,25 e 0,0 M) de Sacarose (Sigma) por 5 minutos cada. Após a remoção do agente crioprotetor, os fragmentos de todos os grupos foram destinados para à análise por histologia clássica, como será descrito a seguir Histologia clássica (HC) Após a fixação por 12 horas em Carnoy, os fragmentos ovarianos foram desidratados em série gradualmente mais concentrada de etanol, diafanizados em xilol, e incluídos em blocos de parafina para montagem de secções seriadas de tecido com espessura de 7 µm. Os cortes obtidos foram montados em lâminas e corados pelo método do Ácido Periódico de 36

37 Schiff (PAS) Hematoxilina. Para análise das lâminas, utilizou-se um microscópio de luz (Nikon), e foram contados 150 folículos pré-antrais por tratamento. Quanto ao aspecto morfológico os folículos, foram avaliados com base na integridade do oócito, das células da granulosa e da membrana basal. Neste sentido, os folículos foram classificados como morfologicamente normais (aqueles contendo oócito e células da granulosa, intactos) e degenerados (folículos com retração citoplasmática e/ou núcleo do oócito picnótico, podendo ainda apresentar ou não desorganização das células da granulosa, bem como destacamento da membrana basal). Para evitar a contagem de um mesmo folículo foram analisados somente aqueles folículos que apresentavam o núcleo do oócito visível na secção observada. Os tratamentos que apresentaram maiores percentuais de folículos pré-antrais morfologicamente normais foram repetidos e, a análise da viabilidade folicular foi realizada Viabilidade folicular por coloração com Azul de Tripan (AT) Para análise da viabilidade folicular, foram utilizados 5 (cinco) pares de ovários. De cada par ovariano, foram obtidos 20 fragmentos (3x3x1 mm), dos quais 5 foram destinadas ao isolamento dos folículos não criopreservados (controle fresco). Os demais fragmentos foram submetidos à congelação lenta após exposição por 5 (n=5), 10 (n=5) ou 20 (n=5) minutos em solução contendo 1,5 M de PROH. Após um período mínimo de 7 dias de armazenamento no nitrogênio líquido, os fragmentos foram destinados à descongelação, remoção do crioprotetor e finalmente, isolamento folicular para a análise da viabilidade após a procedimento de congelação lenta. Para a análise de viabilidade, todos os fragmentos oriundos das cinco repetições em cada tratamento constituíram um pool e submetidos ao isolamento folicular utilizando o procedimento mecânico descrito previamente para FOPA ovinos (AMORIM et al., 2000). De cada pool de tecido ovariano, os folículos foram isolados com o auxílio de um tissue chopper (The Mickle Laboratory Engineering CO, Gomshal, Surrey, England), regulado para a realização de cortes seriados a intervalos 87,5 µm. Em seguida, a suspensão obtida foi transferida para tubos de 50 ml, contendo 2 ml de MEM-HEPES adicionado de 3 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA), e submetida à dissociação mecânica com o auxílio de pipetas Pasteur de 1600 e 600 µm de diâmetro, nessa ordem. A suspensão resultante contendo os folículos pré-antrais isolados em cada pool foi então filtrada em malhas de nylon de 500 e 100 µm. Os folículos pré-antrais (FOPA) isolados foram analisados imediatamente após o término do procedimento de isolamento. Para análise utilizando o corante vital AT, 37

38 cada 100 µl de meio contendo FOPA foi adicionado de 5 µl do corante, diluído a 0,4%, para classificação dos folículos em viáveis ou não-viáveis, quando não corados ou corados em azul, respectivamente. 2.2 Experimento II: Avaliação folicular após congelação lenta por meio de curto período de incubação Protocolo experimental Para este experimento, a melhor concentração de PROH, associada ao melhor tempo de exposição definido no experimento I, foi empregada como protocolo de congelação lenta do tecido ovariano ovino. Para isso, foram utilizados 5 (cinco) pares de ovários obtidos em abatedouro local e transportados ao laboratório como descrito previamente. De cada par ovariano foram obtidos 20 fragmentos (3x3x1 mm), dos quais, 2 (dois) foram fixados imediatamente em Carnoy para análise por HC (controle fresco - morfologia) e 3 (três) foram destinados ao isolamento folicular e análise de viabilidade por AT (controle fresco - viabilidade). Os demais fragmentos foram distribuídos em três grupos: controle criopreservado (tecido congelado e folículos analisados imediatamente após a descongelação e remoção do crioprotetor); incubação por 2 (INC 2) ou 4 horas (INC 4), correspondendo, respectivamente, ao tecido congelado/descongelado seguido por incubação em estufa por um período de 2 ou 4 horas antes da avaliação morfológica e de viabilidade Incubação do tecido ovariano ovino após a criopreservação Após a descongelação e remoção do crioprotetor, os fragmentos ovarianos foram então transferidos para 1 ml de meio de cultivo em placas de 24 poços, sendo um fragmento por poço, e mantidos em estufa a 38,5 C em uma atmosfera úmida com 5% de CO2 em ar durante duas (BORGES et al., 2009) ou quatro (PAYNTER et al., 1999) horas. O meio de cultivo utilizado foi o meio controle normalmente empregado para o cultivo de folículos préantrais em estudos anteriores (ROSSETTO et al., 2009), sendo composto por α-mem (ph ) adicionado de 3 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA), ITS (10 µg/ml de insulina, 38

39 5,5 µg/ml de transferrina e 5 ng/ml de selênio), 50 µg/ml de ácido ascórbico, 2mM de glutamina e 2 mm de hipoxantina. 2.3 Análise estatística Os dados relativos ao percentual de folículos morfologicamente normais avaliados por HC em ambos os experimentos foram submetidos inicialmente aos testes de Kolmogorov- Smirnov e Bartlett para confirmar a distribuição normal e homocedasticidade dos dados, respectivamente. Para o primeiro experimento foi realizada Análise de variância (ANOVA) utilizando procedimento GLM do SAS (2002) seguido de teste t de Student para identificar diferenças entre os grupos testados. No segundo experimento após ANOVA, as diferenças entre os grupos foram avaliadas utilizando o teste Student-Newman-Keuls (SNK). No tocante à análise de viabilidade, em ambos os experimentos foi utilizado teste de Qui-Quadrado para avaliar a dispersão das freqüências. Os dados referentes à HC foram expressos como percentual médio de folículos morfologicamente normais ± DP, enquanto os dados de viabilidade por AT foram expressos como percentual de folículos viáveis dentro de cada grupo testado, com os resultados considerados significativamente diferentes quando P < 0,05. 3 Resultados 3.1 Experimento I: Determinação do tempo de exposição e concentração do PROH para a congelação de folículos pré-antrais ovinos Morfologia folicular Um total de folículos foi analisado após exposição e/ou congelação lenta dos fragmentos de tecido ovariano ovino (150 folículos por tratamento). Com base na análise morfológica (Tab. 1), pôde-se verificar que todos os grupos testados apresentaram percentuais de folículos pré-antrais morfologicamente normais significativamente inferiores ao controle (88,00%), com exceção dos fragmentos somente expostos a 1,5 M de PROH por 5 min ou a 1,0 M por 10 min. Quando comparado os diferentes tempos de exposição (5, 10 ou 20 min) entre si dentro de cada concentração testada (1,0 ou 1,5 M) e cada procedimento aplicado (exposição e/ou congelação), não foram observadas diferenças significativas entre os 39

40 tratamentos. Ao comparar as diferentes concentrações, dentro de cada tempo de exposição, não houve diferença significativa quando os fragmentos foram somente expostos ao PROH. Entretanto, quando foi realizada a congelação, pôde-se verificar que em todos os tempos de exposição a concentração de 1,0 M de PROH apresentou percentuais de folículos pré-antrais morfologicamente normais inferiores aos observados na concentração de 1,5 M. Finalmente, quando comparados os diferentes procedimentos (exposição e congelação) dentro do mesmo tempo de exposição e concentração de PROH, verificou-se que apenas o tratamento 1,5 M por 5 min foi capaz de manter o percentual de folículos morfologicamente normais após a congelação semelhante aquele encontrado nos fragmentos somente expostos ao crioprotetor. Esses achados permitiram a escolha da concentração de 1,5 M como a mais adequada para a sequência dos experimentos realizados Viabilidade por Azul de Tripan Nesta etapa, foi avaliado um total de 198 folículos pré-antrais oriundos de tecido ovariano fresco ou congelados após exposição por 5, 10 ou 20 minutos em solução de criopreservação contendo 1,5 M de PROH. Observou-se que, no grupo controle, 77,78% dos folículos avaliados não apresentavam-se corados pelo AT. Percentual semelhante (P<0,05) foi observado no grupo exposto por 5 minutos a 1,5 M de PROH, que apresentou 80% de folículos viáveis. Tais resultados foram significativamente superiores aos demais grupos testados (Tab. 2). 3.2 Experimento II: Avaliação folicular após congelação, seguida de um curto período de incubação Para a análise através da HC (Fig. 1), foram avaliados 600 folículos, distribuídos de forma semelhante entre os quatro grupos testados (Controle fresco, controle criopreservado, INC 2 e INC 4). Com base na análise morfológica, pôde-se observar que após a criopreservação ocorreu uma redução significativa no percentual de folículos normais após o procedimento de criopreservação comparado ao grupo controle fresco (85,33%). Quando comparado o efeito de diferentes períodos de incubação sobre a morfologia de folículos ovarianos ovinos congelados, observou-se que não houve diferença significativa entre o grupo controle criopreservado (71,37%) e o grupo incubado por 2 horas (INC 2; 64,67%). No 40

41 entanto, com a progressão do período de incubação para 4 horas, verificou-se uma redução significativa no percentual de folículos morfologicamente normais (INC 4; 51,33%) em comparação com o grupo controle criopreservado (Tab. 3). Para avaliação da viabilidade folicular (Fig. 2 e 3) foi analisado um total de 232 folículos (frescos ou congelados seguidos, ou não, de incubação por 2 ou 4 horas). Corroborando com os resultados obtidos na primeira etapa, a criopreservação não reduziu significativamente o percentual de folículos viáveis em comparação ao controle (70,0%). No entanto, verificou-se que, tanto no grupo INC 2 quanto no grupo INC 4, o percentual de folículos viáveis caiu drasticamente em relação ao controle, diferindo significativamente deste (46,67% em ambos os grupos) (Tab. 3). 4 Discussão No presente estudo foram analisados os efeitos de diferentes tempos de exposição e concentrações de PROH e de curtos períodos de incubação sobre a morfologia e viabilidade de folículos pré-antrais ovinos criopreservados. Estudos realizados anteriormente mostraram que a concentração de 1,5 M PROH apresentou melhores resultados para a criopreservação de tecido ovariano de caprinos (RODRIGUES et al., 2004a,b) e ovinos (SANTOS et al., 2006a) em relação à 3,0 M. Além disso, após utilização de diferentes crioprotetores para congelação de tecido ovariano bovino, o PROH a 1,5 M por 20 min mostrou-se eficiente para preservação das células somáticas e reprodutivas (LUCCI et al., 2004). HOVATTA et al. (1996) demonstraram também que a criopreservação de tecido ovariano humano com 1,5 M de PROH acrescido de 0,1 M de sacarose por 10 min, não apresentou diferenças morfológicas significativas em relação ao controle, não sendo observada necrose após esse procedimento. Desta forma, para melhorar o protocolo de criopreservação no tecido ovariano ovino, testamos as concentrações de 1,5 M, que se destacou em diversos trabalhos, e uma concentração mais baixa, no caso 1,0 M. Como curtos períodos de exposição (10 e 20 min) foram capazes de garantir bons resultados em estudos anteriores com outras espécies, realizamos portanto, a exposição à solução durante 5, 10 ou 20 minutos, no intuito de verificar se menores tempos de exposição são capazes de garantir a criopreservação adequada de folículos pré-antrais. No primeiro experimento, foi verificado que, após a exposição do tecido ovariano ovino a diferentes concentrações de PROH (1,0 e 1,5 M) por diferentes períodos (5, 10 ou 20 41

42 minutos), todos os tratamentos mantiveram elevados percentuais de folículos morfologicamente normais, embora apenas os tratamentos 1,5 M por 5 minutos e 1,0 M por 10 minutos tenham mantido percentual semelhante ao grupo controle. Esse dado corrobora com WUSTEMAN et al. (2008) que afirmaram que o PROH é um crioprotetor de baixa toxicidade. Além disso, embora a literatura indique que o tempo de exposição utilizado para o PROH seja normalmente de 20 minutos (SANTOS et al., 2006a; CELESTINO et al., 2008), os resultados obtidos neste trabalho indicaram percentuais de folículos morfologicamente normais elevados já em períodos mais curtos, sugerindo que o PROH não necessita de um longo tempo de exposição para penetrar de maneira satisfatória no tecido, protegendo a célula dos danos causados pelo processo de congelação lenta. Quando apenas expostos ao PROH, os folículos pré-antrais ovinos foram capazes de manter a morfologia normal independente da concentração do crioprotetor utilizada. Entretanto, após a congelação foi possível verificar que, independente do tempo de exposição empregado, os fragmentos submetidos à concentração de 1,5 M de PROH apresentaram maiores percentuais de folículos pré-antrais morfologicamente normais em comparação à concentração de 1,0 M. LIM et al. (1999) constataram que quando utilizadas concentrações acima de 1,5 M de PROH, este apresenta intensa ação citotóxica, sendo portanto esta a concentração ótima para evitar toxicidade celular e conferir proteção aos folículos criopreservados. O resultado obtido no presente trabalho corrobora com aqueles obtidos por diversos autores, os quais realizaram a criopreservação do tecido ovariano de diversas espécies com relativo sucesso utilizando a concentração de 1,5 M de PROH (caprinos: RODRIGUES et al., 2004a,b; ovinos: SANTOS et al., 2006a; bovinos: LUCCI et al., 2004; humanos: HOVATTA et al., 1996; camundongos: CANDY et al., 1997). Além disso, essa mesma concentração foi utilizada com sucesso na criopreservação de oócitos (GUALTIERI et al., 2009; MAGLI et al., 2009) e embriões (EMILIANI et al., 2000) humanos. Com o intuito de definir o tempo de exposição mais adequado para 1,5 M de PROH, concentração que, nas condições testadas no presente trabalho, conferiu melhor preservação da morfologia folicular, foi realizada a análise da viabilidade dos folículos criopreservados nesta concentração após exposição por 5, 10 ou 20 minutos, utilizando a técnica de AT. Foi observado que, no menor tempo de exposição testado, foi possível a obtenção de um percentual de folículos viáveis semelhantes ao observado no controle fresco, o que não se repetiu nos períodos mais longos de exposição. Em experimentos prévios realizados em nosso laboratório, Luz et al (Dissertação de mestrado, 2010) e Castro et al (dados não publicados) 42

43 demonstraram que, para o tecido ovariano caprino, o PROH pode ser exposto ao tecido por curtos períodos sem prejuízo para a qualidade folicular após a criopreservação. A segunda etapa deste experimento avaliou a resposta do tecido ovariano ovino criopreservado a um curto período de cultivo in vitro (2 ou 4 horas). Segundo Paynter et al. (1999), o alvo dessa incubação pós-descongelação seria apenas permitir que o tecido retornasse à sua normalidade térmica e metabólica, sem intenção de promover crescimento, possibilitando que as células expressassem morfologicamente o dano molecular que possa ocorrer durante a criopreservação. Verificou-se que ambos os períodos de incubação testados após a criopreservação afetou negativamente a viabilidade e morfologia dos folículos ovarianos congelados em comparação ao controle fresco. Paralelamente, pôde-se observar que, com o decorrer do período de incubação, houve uma redução significativa no percentual de folículos morfologicamente normais. Embora a incubação tenha cumprido o papel de evidenciar possíveis alterações foliculares, a redução gradual no percentual de folículos normais mostra que, malgrado o sistema de cultivo empregado tenha vislumbrado a mimetização de condições adequadas, este não foi apropriado para tanto. Em trabalho realizado anteriormente, Oskam et al. (2011) também não obtiveram resultados satisfatórios utilizando curtos períodos de cultivo in vitro (4 ou 24 horas) de tecido ovariano ovino previamente submetido à congelação lenta utilizando 1,5 M de PROH com tempo de exposição de 30 minutos. Este estudo demonstrou que, nas condições utilizadas, a associação da criopreservação com o cultivo provocou dano irreversível ao tecido ovariano. Ainda para a espécie ovina, Bordes et al. (2005) obtiveram, após transplante de tecido ovariano vitrificado, o nascimento de crias saudáveis. Desta forma, embora saibamos que o tecido ovariano é plenamente capaz de recuperar sua normalidade funcional e metabólica após procedimentos de criopreservação, acredita-se que as exigências deste tecido são diferentes das necessárias para o cultivo de tecido fresco. No ambiente in vivo, essas exigências seriam desconsideráveis, uma vez que o organismo ofereceria todas as condições adequadas para o desenvolvimento celular. Assim, podemos sugerir que é necessário um sistema de cultivo bastante particular para assegurar o desenvolvimento do tecido ovariano criopreservado, de modo que seja possível o pleno aproveitamento do material biológico após criopreservação. 43

44 5 Conclusão Concluiu-se que é possível realizar a criopreservação eficiente do tecido ovariano após exposição por 5 minutos em solução contendo 1,5 M de PROH, mantendo-se a morfologia e a viabilidade folicular semelhante à observada no tecido fresco. Além disso, observou-se que, quando este tecido é submetido a curtos períodos de cultivo in vitro, ocorre uma redução na qualidade dos folículos presentes, sugerindo a necessidade de um protocolo de cultivo mais adequado para tecido ovariano previamente criopreservado. 6 Referências Bibliográficas AMORIM, C.A., LUCCI, C.M., RODRIYES, A.P.R., CARVALHO, F.C.A., FIGUEIREDO, J.R., RONDINA, D., CECCHI, R., GIORGETTI, A., MARTINI, A., GONÇALVES, P.B.D. quantitative and qualitative analysis of the effectiveness of a mechanical method for the isolation of preantral follicles from ovine ovaries Theriogenology, v. 53, p , 2000 AMORIM, C.A., RONDINA, D., RODRIGUES, A.P.R., COSTA, S.H.F., GONÇALVES, P.B.D., FIGUEIREDO, J.R. Isolated ovine primordial follicles cryopreserved in different concentrations of ethylene glycol. Theriogenology, v.60, p , BORDES, A., LORNAGE, J., DEMIRCI, B., FRANCK, M., COURBIERE, B., GUERIN, J.F., SALLE, B. Normal gestations and live births after orthotopic autograft of vitrifiedwarmed hemi-ovaries into ewes Human Reproduction, v.20, p , BORGES, E.N., SILVA, R.C., FUTINO, D.O., ROCHA JÚNIOR, C.M.C., AMORIM, C.A., BAÓ, S.N., LUCCI, C.M. Cryopreservation of swine ovarian tissue: Effects of differents cryoprotectants on the structural preservation of preantral follicles oocytes Cryobiology, v. 59, p , CANDY, C.J., WOOD, M.J., WHITTINGHAM, D.G. Effect of cryoprotectants on the survival of follicles in frozen mouse ovaries Journals of Reproduction and Fertility v. 110, p 11-19,

45 CELESTINO, J.J.H., SANTOS, R.R., LOPES, C.A.P., MARTINS, F.S., MAOS, M.H.T., MELO, M.A.P., BÁO, S.N., RODRIGUES, A.P.R., SILVA, J.R.V., FIGUEIREDO, J.R. Preservation of bovine preantral follicle viability and ultra-structure after cooling and freezing of ovarian tissue. Animal Reproduction Science, v. 108, p , CHAVES, R.N., MARTINS, F.S., SARAIVA, M.V.A., CELESTINO, J.J.H., LOPES, C.A.P., CORREIA, J.C., LIMA VERDE, I.B., MATOS, M.H.T., BÁO, S.N., NAME, K.P.O., CAMPELLO, C.C., SILVA, J.R.V., FIGUEIREDO, J.R. Chilling ovarian fragments during transportation improves viability and growth of goat preantral follicles cultured in vitro. Reproduction, Fertility and Development, v. 20, p , 2008 CHOI, J.Y., LEE, B., LEE, E., YOON, B., BAE, D., CHOI, D. Cryopreservation of ovarian tissue temporarily suppresses the proliferation of granulose cells in mouse preantral follicles. Cryobiology, v. 56, p , EMILIANI, S., VAN DEN BERGH, M., VANNIN, A.S., BIRAMANE, J., ENGLERT, Y. Comparison of ethyle glycol, 1,2-propanediol and glycerol for cryopreservation of slow cooled mouse zygotes, 4-cell embryos and blastocysts Human Reproduction v.15, nº4, p , FAUSTINO, L.R., SANTOS, R.R., SILVA, C.M.G., PINTO, L.C., CELESTINO, J.J.H., CAMPELLO, C.C., FIGUEIREDO, J.R., RODRIGUES, A.P.R. Goat and sheep ovarian tissue cryopreservation: Effects on the morphology and development of primordial follicles and density of stromal cell. Animal Reproduction Science, v. 122, p , 2010 FIGUEIREDO, J.R., CELESTINO J.J.H, RODRIGUES, A.P.R., SILVA, J.R.V. Importância da biotécnica de MOIFOPA para o estudo da foliculogênese e produção in vitro de embriões em larga escala. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.31, n.2, p , GUALTIERI, R., IACCARINO, M., MOLLO, V., PRISCO, M., IACCARINO, S., TALEVI, R. Slow cooling of human oocytes: ultrastructural injuriesand apoptotic status. Fertility and Sterility v. 91, No. 4, p ,

46 GUNASENA, K.T., VILLINES, P.M., CRITSER, E.S., CRITSE, J.K. Live births after autologous transplant of cryopreserved mouse ovaries. Human Reproduction, v. 12, p , HOVATTA, O. Methods for cryopreservation of human ovarian tissue. Reproductive Biomedicine Online, v. 10, p , ISACHENKO, V., LAPIDUS, I., ISACHENKO, E., KRIVOKHARCHENKO, A., KREIENBERG, R., WORIEDH, M., BADER, M., WEISS, J.M. Human ovarian tissue vitrification versus conventional freezing: morphological, endocrinological, and molecular biological evaluation. Reproduction, v. 138, p ,2009. JEWGENOW, K., PENFOLD, L.M., MEYER, H.H.D., WILDT, D.E. Viability of small preantral ovarian follicles from domestic cats after cryoprotectant exposure and cryopreservation. Journal of Reproduction and Fertility, v.112, p.39-47, KÜÇÜK, T., BASER, I. Cryopreservation of female fertility: A review on the basics of cryobiology for obstetrics and gynecology residents. European Clinics in Obstetrics and Gynaecology., v. 3, p , Review. LIM, J.M., KO, J.J., HWANG, W.S., CHUNG, H.M., NIWA, K. Development of in vitro matured bovine oocytes after cryopreservation with different cryoprotectants. Theriogenology, v. 51, p , LUCCI, C., KACINSKIS, M.A., RUMPF, R., BAO, S.N. Effects of lowered temperatures and media on short-term preservation of zebu (Bos indicus) preantral ovarian follicles. Theriogenology, v. 61, p , LUZ, H.K.M. Determinação de uma solução para congelação lenta de tecido ovariano caprino: utilização de propanodiol e agentes antioxidantes. 2010, 115p. Dissertação (Mestrado) Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias 46

47 LUZ, V.B., SANTOS, R.R,, PINTO, L.C., SOARES, A.A.X., CELESTINO, J.J.H., MAFEZOLI, J., CAMPELLO, C.C., FIGUEIREDO, J.R., RODRIGUES, A.P.R. Dimethyl sulfoxide perfusion in caprine ovarian tissue and its relationship with follicular viability after cryopreservation. Fertility and Sterility, v. 91, p , MAGLI, C., LAPPI, M., FERRARETTI, A.P., CAPOTI, A., RUBERTI, A., GIANAROLI, L. Impact of oocyte cryopreservation on embryo development Fertility and sterility, v. 93(2), p , PAYNTER, S.J., COOPER, A., FULLER, B.J., SHAW, R.W. Cryopreservation of Bovine Ovarian Tissue: Structural Normality of Follicles after Thawing and Culture in Vitro Cryobiology, v. 38, p , PINTO, L.C., SANTOS, R.R., FAUSTINO, L.R., DA SILVA, C.M.G., LUZ, V.B., MAIA JÚNIOR, J.E., SOARES, A.A.X., CELESTINO, J.J.H., MAFEZOLI, J.; CAMPELLO, C.C., FIGUEIREDO, J.R., RODRIGUES, A.P.R.. Quantification of Dimethyl Sulfoxide Perfusion in Sheep Ovarian Tissue: A Predictive Parameter for Follicular Survival to Cryopreservation. Biopreservation and Biobanking, v. 6, p , RODRIGUES, A.P.R., AMORIM, C.A., COSTA, S.H.F., MATOS, M.H.T., SANTOS, R.R., LUCCI, C.M., BÁO, S.N., OHASHI, O.M., FIGUEIREDO, J.R. Cryopreservation of caprine ovarian tissue using glycerol and ethylene glycol. Theriogenology, v. 61, p , 2004a. RODRIGUES, A.P.R., AMORIM, C.A., COSTA, S.H.F., MATOS, M.H.T., SANTOS, R.R., LUCCI, C.M., BÁO, S.N., OHASHI, O.M., FIGUEIREDO, J.R. Cryopreservation of caprine ovarian tissue using dimethylsulphoxide and propanediol. Animal Reproduction Science, v. 84, p , 2004b. ROSSETTO, R., LIMA-VERDE, I.B., MATOS, M.H.T., SARAIVA, M.V.A., MARTINS, F.S., FAUSTINO, L.R., ARAÚJO, V.R., SILVA, C.M.G., NAME, K.P.O., BÁO, S.N., CAMPELLO, C.C., FIGUEIREDO, J.R., BLUME, H. Interaction between ascorbic acid and 47

48 follicle-stimulating hormone maintains follicular viability after long-term in vitro culture of caprine preantral follicles Domestic Animal Endocrinology, v. 37, p , 2009 SANTOS, R.R., RODRIGUES A.P.R., COSTA S.H.F., MATOS M.H.T., BAO S.N., LUCCI C.M., VAN DEN HURK R., FIGUEIREDO J.R. Histological and ultrastructural analysis of cryopreserved sheep preantral follicles. Animal Reproduction Science, v.91, p , 2006a. SANTOS, R.R., THARASANIT, T., FIGUEIREDO, J.R., VAN HAEFTEN, T., VAN DEN HURK, R. Preservation of caprine perantral follicle viability after cryopreservation in sucrose and ethylene glycol. Cell Tissue Research, v. 325, p , 2006b. SANTOS, R.R., VAN DEN HURK, R., RODRIGUES, A.P.R., COSTA, S.H.F., MARTINS, F.S., MATOS, M.H.T., CELESTINO, J.J.H., FIGUEIREDO, J.R. Effect of cryopreservation on viability, activation and growth of in situ and isolated ovine early-stage follicles. Animal Reproduction Science, v.99, p.53-64, WUSTEMAN, M., RAUEN, U., SIMMONDS, J., HUNDS, N., PEGG, D.E. Reduction of cryoprotectant toxicity in cells in suspension by use of a sodium-free vehicle solution. Cryobiology, v. 56, p ,

49 ANEXO I Tabelas 49

50 50

51 ANEXO II FIGURAS 51

52 52