UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS FRANCISCA TUELLY BANDEIRA DE OLIVEIRA ANÁLISE DO DESENVOLVIMENTO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS E DA MATRIZ EXTRACELULAR OVARIANA APÓS VITRIFICAÇÃO DE TECIDO OVARIANO OVINO FORTALEZA 2013

2 FRANCISCA TUELLY BANDEIRA DE OLIVEIRA ANÁLISE DO DESENVOLVIMENTO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS E DA MATRIZ EXTRACELULAR OVARIANA APÓS VITRIFICAÇÃO DE TECIDO OVARIANO OVINO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes. Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues. FORTALEZA 2013

3 O48a Oliveira,Francisca Tuelly Bandeira de. Análise do desenvolvimento de folículos pré-antrais e da matriz extracelular ovariana após vitrificação de tecido ovariano ovino/francisca Tuelly Bandeira de Oliveira CD-ROM 70f. : il. (algumas color.) ; 4 ¾ pol. CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slin (19 x 14 cm x 7 mm). Dissertação (mestrado) Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária, Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias, Fortaleza, Orientação: Profª.Drª.Ana Paula Ribeiro Rodrigues. Co-orientador: Profª. Drª. Claudio Cabral Campello. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. 1. Criopreservação. 2. Ovelha. 3. Foliculogênese. 4. Matriz extracelular ovariana. I. Título. CDD:

4 FRANCISCA TUELLY BANDEIRA DE OLIVEIRA ANÁLISE DO DESENVOLVIMENTO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS E DA MATRIZ EXTRACELULAR OVARIANA APÓS VITRIFICAÇÃO DE TECIDO OVARIANO OVINO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Aprovada em / / BANCA EXAMINADORA Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues Universidade Estadual do Ceará (UECE) Orientadora Dr. Claudio Cabral Campello Universidade Federal do Ceará (UECE) Co-Orientador/Examinador Dra. Ana Beatriz Graça Duarte Universidade Federal do Ceará (UFC) Examinadora

5 Pai, mãe, irmãos, demais familiares e amigos, Pelo apoio, confiança e amor, a vocês dedico.

6 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por ser a luz que me guia estando presente em cada segundo da minha vida me dando força, proteção e coragem para continuar a caminhada. À Universidade Estadual do Ceará (UECE) e ao Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) pela oportunidade e contribuição que deram para a minha formação profissional. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo incentivo concedido na forma de bolsa de estudo e pelo financiamento dessa pesquisa. À New Route, na pessoa do Dr. Mário José dos Santos Pereira por ter sido bastante gentil, solícito e responsável ao me auxiliar na realização de algumas análises. À minha orientadora Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues, muito obrigada pela oportunidade dada a mim em fazer uma pós-graduação de qualidade, por ter sido uma profissional sempre dedicada, ética e presente em todos os momentos. Ao professor Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo, por ter-me aceitado no laboratório, pelo apoio e por toda a sabedoria que a mim foi transmitida. Ao meu Co-orientador, Prof. Dr. Claudio Cabral Campello por toda a sua ajuda e contribuição neste trabalho, por ter se mostrado sempre disponível a me ajudar. Aos professores Daniel de Araújo Viana e Janaína Serra Azul Monteiro Evangelista por todo o conhecimento transmitido sobre histologia, pela ajuda e pelos momentos agradáveis de convivência. Aos atenciosos membros da banca pela atenção e disponibilidade em analisar este trabalho contribuindo para a sua melhoria. Aos colegas que fazem e que fizeram parte do LAMOFOPA por terem me recebido com muita atenção, obrigada pelo carinho e convivência durante todo esse período. Agradeço a todos

7 os professores, pós-doutores, doutores, doutrandos, mestres, mestrandos, alunos de iniciação científica e técnicos. Em especial ao Cleidson Manoel, Aglailson Pinheiro, Rebeca Rocha, Anelise Alves, Francisco Léo, Hudson Henrique, Naiza Sá, Denise Guerreiro, Johana Leiva, Ana Clara, Débora Sales, Franciele Lunardi, Carlos Lobo, Valdevane Araújo, Rafael Rosseto, Gerlane Modesto, Ivina Rocha, Priscila Campos e Deborah Magalhães. As doutoras Giovana Quintino Rodrigues pela contribuição na tradução do artigo e Luciana Rocha Faustino por todo o conhecimento teórico e prático sobre imunohistoquímica, etapas essenciais no desenvolvimento dessa pesquisa. Agradecimento especial às companheiras Adeline de Andrade Carvalho, Simone Vieira Castro e Laritza Ferreira de Lima que contribuíram efetivamente com essa pesquisa, muito mais que obrigado eu às dedico esse trabalho, pelas noites no laboratório, pela troca de conhecimentos, pelo carinho e principalmente por toda a experiência e companheirismo. Aos amigos que a Pós graduação me proporcionou conhecer, Allana Ferreira e Aline Maia, e aqueles que em outros momentos da vida Deus me permitiu escolher. Agradecimento especial a toda a minha família desde os pais até os primos mais distantes, por toda a força, ajuda, confiança e amor que tem por mim. Por fim agradeço a todos que contribuíram, direta ou indiretamente, para que eu chegasse até aqui. Muito Obrigada!

8 RESUMO O objetivo do presente estudo foi avaliar a vitrificação, por superfície sólida, utilizando duas técnicas, sendo uma convencional (VSS) e a outra por ovarian tissue cryosystem (OTC) sobre a matriz extracelular (MEC) ovariana e o desenvolvimento folicular. Para tanto, foram utilizados 10 pares de ovário de ovelhas. No laboratório cada par ovariano foi seccionado em 18 fragmentos e destinados aos tratamentos controle fresco, controle cultivado, vitrificados por OTC ou SSV e vitrificados (OTC ou SSV) seguidos de cultivo in vitro. Em todos os tratamentos, os folículos pré-antrais foram analisados quanto à morfologia, desenvolvimento e viabilidade pelas técnicas de histologia clássica, proliferação celular e azul de tripan, respectivamente. A MEC foi avaliada pela imunodetecção das proteínas, colágeno tipo I fibronectina e as as fibras colágenas e reticulares foram coradas por picrosírius red e sais de prata, respectivamente. Os dados de morfologia, desenvolvimento folicular e regiões organizadoras de nucléolo (NOR), foram avaliados pelos testes de Bartlett e Shapiro-Wilk, e Student-Newman-Keuls e Dunnet s. Para análise de proliferação por PCNA e viabilidade foi aplicado o qui-quadrado. Os dados das fibras de colágeno (picorsírius red) foram analisados pelos testes de Kruskal -Wallis. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão e as diferenças foram significativas quando p <0,05. No tecido não cultivado OTC (80,00%) manteve um percentual de folículos morfologicamente normais superior à SSV (50,67%). O cultivo in vitro reduziu o percentual de folículos normais em todos os tratamentos a partir do dia 1. Após o cultivo houve um aumento no desenvolvimento folicular, quando comparado aos tratamentos não cultivados. A ativação folicular aumentou no decorrer do período de cultivo nos fragmentos não vitrificados, mantevese inalterada nos fragmentos vitrificados por OTC enquanto que nos vitrificados por SSV, reduziu do dia 1 para o dia 7 de cultivo. O número de NORs nas células da granulosa dos folículos frescos e vitrificados por OTC foram semelhantes e ambos maiores do que nos vitrificados por SSV. Após o cultivo os folículos vitrificados por OTC ou SSV apresentaram menos NORs do que o controle cultivado e o não cultivado. Na análise de PCNA os folículos não cultivados e cultivados apresentaram imunomarcação forte e fraca, respectivamente em todas as condições. O percentual de viabilidade folicular no tecido fresco e vitrificado por OTC foi similar e ambos foram superiores à SSV. Para a MEC, não houve aumento de fibras colágenas em nenhum dos tratamentos, independente do período de cultivo, no entanto, parece ter havido uma redução das fibras reticulares nos tratamentos vitrificados por SSV. Já na análise do colágeno tipo I observou-se que nos tratamentos vitrificados houve uma imunomarcação moderada após o cultivo. A fibronetina, permaneceu fracamente marcada em todos os tratamentos. Os resultados do presente estudo permitem concluir que a técnica de OTC preserva

9 melhor a morfologia, viabilidade e desenvolvimento folicular, além de manter, íntegros os componentes da MEC do ovário. Palavras-chave: Criopreservação. Ovelha. Foliculogênese. Matriz extracelular ovariana

10 ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the vitrification by solid surface using two techniques (OTC or SSV) on the extracellular matrix (ECM ) and ovarian follicular development. For this purpose, pairs (n=10) of sheep ovarian were used. In the laboratory ovarian pair was sectioned into 18 fragments and destined for treatments, fresh control, control cultured for 1 or 7 days, vitrified by SSV or OTC and vitrified by (OTC or SSV) followed by in vitro culture. In all treatments, preantral follicles were analyzed for morphology, development and viability of the classic histology techniques, PCNA/Ag-NOR and trypan blue, respectively. The extracellular matrix was assessed by immunodetection of type I collagen and fibronectin and staining of collagen and reticular fibers by picrosirius red and silver salts, respectively. The data of morphology, follicular development and nucleolus organizer regions (NOR), were subjected to Bartlett's and Shapiro-Wilk tests then were performed by ANOVA and finally, the Student- Newman-Keuls and Dunnets. For PCNA and viability analysis the chi-square test was applied. The data of collagen fibers (picorsírius red ) were analyzed by Kruskal-Wallis and Dunn. Results were expressed as mean ± standard error and differences were significant at p<0.05. In non culture tissue, OTC (80.00%) maintained a higher percentage of the morphologically normal follicles when compared to SSV (50.67 %). In vitro culture reduced the percentage of normal follicles in all treatments from day 1. After culture an increase in follicular development when compared to treatment no culture. The follicular activation increased during the period of culture in non- vitrified fragments, maintained unchanged in vitrified by OTC whereas the vitrified by SSV fragments decreased from day 1 to day 7 of culture. The number of NORs in granulosa cells of fresh follicles and vitrified by OTC were similar and both higher than in vitrified by SSV. After culture the follicles vitrified by SSV or OTC NORs showed less than the controls culture and non culture. In the analysis of the PCNA non cultured and cultured follicles showed strong and weak immunostaining respectively in all conditions. The percentage of follicular viability in fresh and vitrified tissue by OTC was similar and both were higher than the SSV. For ECM, no increase of collagen fibers in the treatments, regardless of the culture period, however, seems to have been a reduction of reticular fibers in treatments vitrified by SSV. In the analysis of type I collagen was observed that in the vitrified treatments had a moderate immunostaining after culture. The fibronetin remained poorly at all treatments. The results of this study showed that the OTC technique better preserves the morphology, viability and development follicular, and maintained integrity of ECM components of the ovary. Keywords: Cryopreservation. Sheep. Folliculogenesis. Ovarian extracellular matrix

11 LISTA DE FIGURAS Revisão de Literatura Figura 1. Representação esquemática do ovário mamífero...19 Capítulo 1 Fig. 1. Micrographs of sheep preantral follicles. Histological sections (A,) - primordial and development follicle normal note an oocyte centralized surrounded by a layer of shaped pregranulosa cells (B). Developing follicle showing shrinkage of the oocyte (*), characteristic of follicular degeneration. (C) Viable (not stained). (D) Non viable (stained) preantral follicle (stained by trypan blue). Cellular proliferation micrographs showing primordial (E) and developing (F) follicle, the arrows indicate the presence of NORs in granulosa cells. Gc: granulosa cells, Oo: Oocyte, Nu: nucleo of oocyte.44 Fig. 2. Percentage of developing preantral follicles (mean ± SEM) after 1 or 7 days of culture, before and after vitrification by OTC or SSV...44 Fig 3. Photomicrograph of immunohistochemistry for PCNA, showing strong labeling in non cultured treatments - (A) control, (B) OTC (C) SSV, and weak in the cultured treatments - (D) control, (E) OTC (F) SSV. Gc: granulosa cells, Oo: Oocyte, Nu: nucleo of oocyte Fig. 4. Percentage of viable follicles of control (fresh), vitrified (OTC or SSV) before and after in vitro culture...47 Fig. 5. Staining of reticular fibers by silver salts stained in black (left column) and collagen by picrosirius red stained in red (right column) in ovine ovarian tissue.48 Fig. 6. Percentage of collagen in the ovine ovarian tissue analyzed by picrosirius red technique...48

12 Fig. 7. Photomicrographs showing fibronectin immunoreactivity (left column) and collagen type I (right column). Arrows indicate marking... 48

13 LISTA DE TABELAS Capítulo 1 Table 1. Percentage of morphologically normal preantral follicles (mean ± SEM) included in ovine ovarian tissue fresh or vitrified by SSV or OTC before or after in vitro culture for 1 or 7 days...43 Table 2. Average of development NORs per nucleus of granulosa cells of preantral follicles (fresh or vitrified) before and after in vitro culture...45 Table 3. Intensity staining for PCNA, fibronectin and collagen type I in ovine ovarian tissue fresh or vitrified before and after 7 days of in vitro culture..46

14 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ACP - Agente crioprotetor (Cryoprotectant agents) Ag-NOR - Regiões Organizadoras de Núcleolo artentafins (argentaffin Nucleolus Organizer Regions) ANOVA - Análise de Variância BSA - Albumina Sérica Bovina CE - Ceará CGP - Células Germinativas Primordiais CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico CO 2 - Gás carbônico DAB - Diaminobenzidine DMSO - Dimetilsulfóxido (Dimethyl sulfoxide) DNA - ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid) ECM - Extracellular Matrix EG - Etilenoglicol (Ethylene glycol) Fig - Figure FSH - Hormônio Folículo Estimulante Gc - Células da granulosa (granulosa cell) H - Hora(s) H2AX Histona H2AX (Histone H2AX) HC - Histologia clássica IgG - Imunoglobulina G LAMOFOPA - Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré Antrais M - Mol por litro M II - Metafase II MEC - Matriz Exracelular MEM - Meio Essencial mínimo (Minimum Essential Medium) Min - Minutos ml - Mililitro mm - Milímetros MOIFOPA - Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais N - Número N 2 - Nitrogênio

15 Ng - Nanograma NL 2 - Nitrogênio Liquido N L2 - Nitrogênio líquido Nm - Nanômetros NOR- Regiões Organizadoras de núcleolo Nu - Núcleo (núcleo) Oo - Oócito (oocyte) OTC - Ovarian Tissue Cryosystem P - Probabilidade de erro PBS - tampão fosfato salino (Plhosphate-buffered saline) PCNA - Antigeno Nuclear de Proliferação Celullar ph - Potencial hidrogeniônico PPGCV - Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias RJ - Rio de Janeiro RT - Tempetura ambiente SEM - erro padrão da média (Standard Erros os means) SSV - Vitrificação por superfície sólida T - Tratamento UECE - Universidade Estadual do Ceará UFC - Univerdidade Federal do Ceará USA - Estados Unidos da América (United States of American) VC - Vitrificação Convencional (Conventional vitrification) VS - Solução (ões) de vitrificação (solution vitrifation) VSS - Vitrificação por superfície sólida (Solid-surface vitrification) WS - Washing Solutions α MEM - α Meio Essencial mínimo (Minimum Essential Medium α) % - Percentagem ~ - Aproximadamente ± - Mais ou menos C - Graus Celsius µg - Micrograma µl - Microlitro µm - Micrômetro 1000x - Mil vezes

16 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA ESTRUTURA E FUNÇÃO DO OVÁRIO DE MAMÍFEROS MATRIZ EXTRACELULAR OVARIANA DESENVOLVIMENTO FOLICULAR OVARIANO IMPORTÂNCIA DA CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO OVARIANO TÉCNICAS DE VITRIFICAÇÃO UTILIZADAS EM TECIDO OVARIANO AVANÇOS NA VITRIFICAÇÃO DE TECIDO OVARIANO OVINO TÉCNICAS PARA AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE CRIOPRESERVAÇÃO JUSTIFICATIVA HIPÓTESE CIENTÍFICA OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS CAPÍTULO I VITRIFICAÇÃO SEGUIDA DE CULTIVO IN VITRO: AVALIAÇÃO DESENVOLVIMENTO FOLICULAR E DA MATRIZ EXTRACELULAR OVARIANA CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...59

17 1 INTRODUÇÃO A criopreservação de oócitos e tecido ovariano permite preservar a fertilidade de mulheres que serão submetidas a tratamentos quimio-radioterápicos, ou ainda animais geneticamente superiores e em risco de extinção (GRISCHENKO et al., 1987; SILBER et al., 2008; WANDERLEY et al., 2011). Partindo desse princípio, alguns estudos usam modelos animais cuja fisiologia ovariana se assemelha com a espécie humana no intuito de desenvolver um protocolo ideal de criopreservação do tecido ovariano (SANTOS et al., 2007; JIN et al., 2010; MILENKOVIC et al., 2012). Dentre esses estudos pode-se destacar o de Gosden et al. (1994), que além de ter sido usado como modelo para os primeiros estudos com criopreservação de tecido ovariano humano, também resultou no primeiro nascimento de ovinos após criopreservação e transplante de tecido ovariano. Resultados satisfatórios após criopreservação do tecido ovariano de ovelhas por congelação lenta ou vitrificação seguidos de auto-transplante também já foram descritos na literatura (BAIRD et al., 1999, SALLE et al., 2003; BORDES et al., 2005). Esses estudos demonstraram que a restauração da função ovariana e reprodutiva é possível, no entanto, o processo de criopreservação compromete a arquitetura da matriz extracelular (MEC) ovariana, uma vez que danos e redução na densidade das células do estroma de tecido ovariano criopreservado e cultivado in vitro já foram observados (KEROS et al., 2009; FAUSTINO et al., 2010), o que pode levar à redução das taxas de sucesso. Independente do método empregado (congelação lenta ou vitrificação), a finalidade de criopreservar o tecido ovariano é restaurar ou salvaguardar a fertilidade da fêmea. Para tanto se faz necessário o uso de um protocolo ideal capaz de manter a morfologia e função da estrutura folicular (oócitos e células circundantes), bem como a preservação dos componentes e compartimentos da MEC. Esta matriz, além de fornecer um ambiente ideal para o desenvolvimento e especialização celular, promove a ligação de importantes fatores de crescimento, além de participar de fenômenos como a migração, divisão, diferenciação, recrutamento e morte celular (HAY., 1991). O processo de criopreservação pela vitrificação tem sido amplamente empregado como um método alternativo à congelação lenta, pois é considerada prática, de rápida execução e de baixo custo. Além disso, acredita-se que, fatores como o estresse osmótico e a taxa de resfriamento, elementos intimamente associados respectivamente à composição da solução e à técnica de vitrificação empregada, possam influenciar na manutenção da estrutura folicular após o aquecimento (HUANG et al., 2008). 17

18 Para uma melhor compreensão da relevância desse trabalho, os aspectos relacionados à estrutura do ovário, foliculogênese, criopreservação de folículos préantrais presentes no tecido ovariano, técnicas de análise de tecido ovariano após criopreservação e a importância da MEC ovariana serão abordados a seguir na revisão de literatura. A contribuição deste trabalho para a criobiologia também será demonstrada através de um artigo técnico científico. 18

19 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ESTRUTURA E FUNÇÃO DO OVÁRIO DE MAMÍFEROS O ovário é um dos órgãos mais importantes do sistema reprodutivo das fêmeas, sendo em todas as espécies mamíferas constituído por duas regiões distintas, uma cortical e outra medular, e é circundado por uma superfície epitelial, conhecida como epitélio germinativo. Como mostrado na Figura 1, a região cortical, localizada mais externamente (com exceção dos equídeos, nos quais é localizada internamente), é composta de tecido conjuntivo (fibroblastos, colágeno e fibras reticulares), folículos ovarianos em diferentes estágios de desenvolvimento, bem como corpos lúteos, albicans e hemorrágicos. Já a região medular, a mais interna do ovário (exceto em equídeos), é constituída por células musculares lisas, nervos, artérias e veias que se estendem para o córtex ovariano, responsáveis pela nutrição e sustentação do ovário (HAFEZ & HAFEZ, 2004). O ovário desempenha duas funções essenciais para a manutenção da fertilidade das fêmeas, isto é, uma função endócrina, responsável pela síntese e secreção de hormônios esteróides e diversos peptídeos essenciais para a ciclicidade e desenvolvimento folicular (HIRSHFIELD, 1991) e outra exócrina ou gametogênica que está relacionada com a produção e liberação de oócitos fertilizáveis (SAUMANDE, 1991). No entanto, para que estas funções sejam desempenhadas com sucesso, é fundamental a manutenção da matriz extracelular ovariana uma vez que ela estabelece uma interação entre fatores endócrinos, parácrinos e autócrinos, que atuam coordenando todo processo de foliculogênese. Figura 1. Representação esquemática do ovário mamífero. Adaptado de 19

20 2.2 MATRIZ EXTRACELULAR OVARIANA A MEC é uma rede complexa composta por uma variedade de moléculas como, colágenos, laminina, fibronectina e outros proteoglicanos e polissacarídeos (BERKHOLTZ et al., 2006). Essas moléculas proporcionam um arcabouço físico para a sustentação da estrutura tecidual, determinando a hidratação e, consequentemente, o volume do tecido, criando espaços para o transporte de moléculas, a organização dinâmica e a resistência às forças de compressão (RODGERS et al., 2000). A fibronectina, a laminina e certos tipos de colágeno têm sido localizados no ovário de várias espécies e têm sido demonstrados seus efeitos positivos sobre o desenvolvimento folicular (WOODRUFF & SHEA, 2007). A MEC é considerada o substrato natural que suporta os processos celulares como a adesão, migração, sobrevivência e proliferação, os quais resultam de uma combinação de sinais mecânicos e químicos. A estrutura da MEC fornece um suporte mecânico para os tecidos, enquanto que a composição bioquímica pode interagir diretamente com células através de receptores específicos ou pode ligar fatores de crescimento que são liberados pela degradação da matriz. A caracterização total da MEC ovariana não é totalmente conhecida, sabe-se que em camundongos o colágeno I está presente em todo o ovário, com maiores concentrações nos compartimentos foliculares. O colágeno IV é abundante nas células da teca e na membrana basal, com menor expressão nas células do estroma e da granulosa e a laminina é localizada principalmente na membrana basal e, com menor expressão, no estroma e nas células da granulosa (BERKHOLTZ et al., 2006). Em bovinos, os colágenos I e III estão presentes em todo o ovário, mas uma maior densidade foi imunohistoquimicamente identificada na túnica albugínea e na porção medular. A fibronectina também está presente na porção medular, incluindo a túnica albugínea, mas também é encontrada de forma significativa no estroma circundante de folículos pré-antrais, bem como nas células da granulosa. (FIGUEIREDO et al., 1995). Apesar do desenvolvimento folicular ser controlado por diversos fatores, sendo os hormônios e fatores de crescimento os primeiros a serem mencionados, a MEC também assume grande relevância, pois regula numerosos processos celulares associados ao desenvolvimento do folículo (RODGERS e RODGERS, 2005). A MEC é requerida para a manutenção das interações célula-célula e comunicações necessárias para a formação do folículo, desenvolvimento e migração dentro do ovário. A adesão 20

21 celular suportada pela MEC leva a mudanças na forma da célula e motilidade, as quais são necessárias para funções celulares durante a foliculogênese (WOODRUFF & SHEA, 2007). As funções desempenhadas pela MEC ovariana estão intimamente relacionadas com a sua diversidade de compartimentos e componentes. Dentre os principais, têm a lâmina basal folicular, o fluido folicular, a zona pelúcida, e o estroma ovariano (RODGERS et al., 2000). Em cada um deles, existem diferentes substâncias encontradas de maneira difusa pelo tecido ovariano, como a fibronectina e o colágeno I e III (FIGUEIREDO et al., 1995) e o ácido hialurônico e versicana (RODGERS et al., 2003). A MEC ovariana também é importante para a sobrevivência e proliferação das células da granulosa durante a foliculogênese. In vitro, vários estudos têm demonstrado que a presença de componentes da MEC como o colágeno tipo IV, laminina e fibronectina melhora a proliferação de células da granulosa, aumenta o número de folículos primordiais que entram na fase de crescimento, bem como influenciam a ação dos fatores de crescimento necessários para o desenvolvimento folicular (WOODRUFF & SHEA, 2007). 2.3 DESENVOLVIMENTO FOLICULAR OVARIANO A foliculogênese pode ser definida como o processo de formação, crescimento e maturação folicular, iniciando-se com a formação do folículo primordial e culminando com o estágio de folículo pré-ovulatório (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). O folículo ovariano é a unidade morfológica e funcional do ovário mamífero, sendo este formado por um oócito circundado por células somáticas (células da granulosa e da teca). A formação dos folículos ovarianos tem início ainda na vida fetal, na maioria das espécies, e como verificado recentemente, pode se prolongar durante toda a vida reprodutiva da fêmea (WHITE et al., 2012). Em mamíferos os estádios iniciais do desenvolvimento ovariano, ainda no período pré-natal, ocorrem com a migração das células germinativas primordiais (CGP) do saco vitelino para a gônada primitiva e sua posterior colonização (BRISTOL-GOULD; WOODRUFF, 2006). Imediatamente após a diferenciação das gônadas, ocorre a transformação das CGP em oogônias meioticamente ativas, marcadas pela replicação final do DNA durante o estádio de pré-leptóteno, preparando a célula para divisão meiótica. Posteriormente, estas oogônias se tornam então, oócitos primários ou imaturos, os quais sofrem uma parada no seu 21

22 desenvolvimento em prófase I, no estádio vesícula germinal (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). Os oócitos primários são circundados por uma camada de 4-8 células da pré-granulosa, de formato pavimentoso, formando os folículos primordiais (FAIR, 2003). Em alguns folículos estão presentes tanto células pavimentosas quanto cúbicas, dando origem à classe de folículos de transição (VAN DEN HURK et al., 1998). Após a evolução folicular, passam a ser categorizados em primários, quando todas as células da granulosa que circundam o oócito imaturo central tornam-se cuboides, aumentando em número e em volume (VAN DEN HURK et al., 1998). Durante o crescimento dos folículos primários, as células da granulosa sofrem proliferação e há um aumento do oócito em tamanho e conteúdo proteico (PICTON et al., 1998). Quando duas ou mais camadas de células da granulosa cuboides estão circundando o oócito e as células da teca já estão formadas os folículos são chamados secundários (SILVA et al., 2004). Nesse estádio folicular a zona pelúcida passa a ser bem definida circundando o oócito (PARROT; SKINNER, 2000). Com a intensa proliferação das células da granulosa, uma área preenchida por fluido folicular é identificada e, então, os folículos passam a ser chamados de antrais ou terciários. Estes folículos possuem oócito ainda imaturo, que serão considerados maturos apenas quando o folículo alcançar um estádio mais avançado, conhecido como pré-ovulatório ou de Graaf (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). A quantidade total de folículos presentes no ovário de uma fêmea depende de diversos fatores. Além da variação individual, existe uma grande diferença com relação às espécies, o que impulsionou a realização de diversos estudos estimando a população folicular que é de no camundongo fêmea (SHAW; ORANRATNACHAI; TROUNSON, 2000); na cabra (LUCCI et al., 1999); na ovelha (AMORIM et al., 2000a); na vaca (BETTERIDGE et al., 1989) e, aproximadamente, na mulher (BAKER, 1963). Apesar da grande população folicular presente no ovário mamífero, durante a vida reprodutiva das fêmeas, ocorre uma redução ordenada e significativa no número de folículos pré-antrais. Essa redução é devido a dois fenômenos que ocorrem naturalmente no ovário: (i) a ovulação e (ii) a atresia ou morte folicular. Somente uma pequena parte (0,1%) dos folículos primordiais chega à ovulação (NUTTINCK et al., 1993) e a quase totalidade dos folículos, ou seja, 99,9%, não chegam à ovulação, morrendo pelo processo de atresia, o qual ocorre por via degenerativa e/ou apoptótica (FIGUEIREDO et al., 2008). A atresia, apesar de ser um fenômeno natural, reduz significativamente o número de oócitos que seriam ovulados, 22

23 diminuindo assim o potencial reprodutivo do animal. A atresia folicular ocorre também por diversos fatores externos, como por exemplo, a radio e/ou quimioterapia, utilizadas nos tratamentos anticâncer ou outras enfermidades. Felizmente, intervenções como a criopreservação do tecido ovariano antes do tratamento pode preservar o folículo da morte por atresia. 2.4 IMPORTÂNCIA DA CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO OVARIANO A criopreservação do tecido ovariano tem se tornado o método de escolha para preservar a fertilidade das fêmeas em comparação com a criopreservação de embriões ou oócitos, por evitar questões como a estimulação hormonal nas fêmeas para a coleta do oócito e a necessidade de um parceiro ou mesmo um doador de sêmem. A criopreservação de tecido ovariano tem a finalidade de preservar principalmente os folículos pré-antrais, os quais estão localizados no córtex ovariano e representam a reserva principal de gametas femininos (DEMIRCI et al., 2003) que futuramente podem ser resgatados para restauração da fertilidade de fêmeas de diversas espécies (humanos: DEMEESTERE et al., 2007; ovinos: ALMODIN et al., 2004; murinos: CARROLL et al., 1991). Dentre os folículos prá-antrais, os primordiais são as estruturas de escolha para se criopreservar no tecido ovariano, por representar a quase totalidade dos folículos ovarianos (95%), contendo o oócito imaturo, o que os tornam mais tolerantes às crioinjúrias inerentes ao processo de criopreservação. (CORTVRINDT & SMITZ, 2002; NEWTON, 1996; OKTAY et al., 1998). Muitas características devem ser consideradas quando se trata da utilização de folículos primordiais nos procedimentos de criopreservação. Primeiro, estes folículos possuem um pequeno diâmetro folicular e oocitário, devido à pequena quantidade de células da granulosa que circundam o oócito. Além disso, esses folículos permanecem em quiescência até o início do desenvolvimento folicular, sendo então menos diferenciados do que os das demais categorias. Os folículos primordiais também possuem poucas organelas, não apresentam zona pelúcida e nem grânulos corticais (LUCCI et al., 2001), atividade metabólica baixa e o núcleo não apresenta fuso meiótico, uma vez que o mesmo está parado na prófase da primeira divisão meiótica (FRIEDLER et al., 1988). Já o oócito maturo oriundo de folículos antrais apresenta o núcleo em metáfase II (MII) e os cromossomos arranjados 23

24 no fuso meiótico. Portanto a criopreservação nesta fase pode ocasionar anomalias, como a ruptura do citoesqueleto, uma vez que a organização do fuso meiótico é essencial para o alinhamento correto, bem como para a segregação dos cromossomos. Estes danos durante a criopreservação contribuem para a baixa competência do desenvolvimento de oócitos maturos (FABBRI et al., 2001). A criopreservação do tecido ovariano pode ser realizada por dois métodos principais, isto é, a congelação lenta e a vitrificação. A congelação lenta é considerada o método convencional de criopreservação e tem sido largamente utilizada para a conservação de tecido ovariano em diferentes espécies. Este método caracteriza-se pela exposição do tecido a baixas concentrações de agentes crioprotetores (PAYNTER et al., 2000), seguida por resfriamento lento e gradual, utilizando freezer programável (JONDET et al., 1984). No método de vitrificação os meios de criopreservação sofrem uma passagem direta do estado líquido para um estado amorfo ou vítreo, sem que haja uma cristalização do meio, evitando, portanto a formação de cristais de gelo (RALL e FAHY, 1985). Isso acontece devido às altas concentrações de ACP utilizadas, que age aumentando a viscosidade da solução. Com isso, mesmo submetida a uma redução súbita de temperatura (~ a C/min), a água é transformada do estado líquido para o estado vítreo. Após a formação do estado vítreo, o material biológico deve ser armazenado em nitrogênio liquído até o momento do aquecimento, o qual deve ser realizado de forma rápida à temperatura ambiente no intuito de evitar a formação de cristais de gelo (WOWK et al., 2000). A vitrificação tem como principais vantagens a não utilização de máquinas de congelação e a redução do tempo de processamento. Além disso, a vitrificação quando comparada à congelação lenta, apresenta menores danos no resfriamento, visto que as amostras passam rapidamente pelos intervalos mais críticos de temperatura (15 C e - 5 C). Essas características têm tornado a vitrificação uma alternativa bastante promissora para a criopreservação de tecido ovariano. Neste sentido, vários investigadores têm tentado definir uma técnica ideal visando anular ou minimizar os danos causados pelas altas concentrações de agentes crioprotetores, os quais são tóxicos para as células e tecidos. Dentre as principais estratégias empregadas, pode-se destacar as técnicas desenvolvidas baseadas na utilização de um mínimo volume de solução, com a finalidade de reduzir os efeitos tóxicos, bem como os danos causados pelo choque osmótico. 24

25 2.5 TÉCNICAS DE VITRIFICAÇÃO UTILIZADAS EM TECIDO OVARIANO Devido às vantagens que a vitrificação tem sobre a congelação lenta que é a de atingir temperaturas criogênicas sem danos químicos e sem formação de gelo intracelular (Rubinsky, 2003), diversas técnicas de vitrificação foram desenvolvidas e empregadas na criopreservação de tecido ovariano. As técnicas de vitrificação são basicamente divididas em três grupos, ou seja, as que têm contato direto com o Nitrogênio líquido (N 2 ) e as que não tem contato direto com o N 2 e as que tem contato parcial com o N 2. O contato direto com o N 2 faz com que haja uma redução mais rápida da temperatura o que pode favorecer o processo de vitrificação (CHEN et al., 2000; 2006), no entanto esse contato pode contaminar a amostra e torná-la inútil quando o objetivo for cultivar in vitro ou in vivo o material biológico (GROUT e MORRIS, 2009). Apesar das técnicas de vitrificação que não têm contato direto com o nitrogênio líquido serem teoricamente mais ineficientes, ainda assim, são as técnicas de escolha dos pesquisadores para criopreservar tecido ovariano por serem mais seguras. Dentre essas técnicas, a vitrificação por macrotubo resultou na preservação da ultraestrutura oocitária, bem como da viabilidade folicular (LUNARDI et al., 2012). No entanto, a técnica de superfície sólida é mais utilizada provavelmente pelo baixo custo, pela facilidade do procedimento, bem como pela forma de condução do calor. Esta técnica consiste na sobreposição da amostra em um cubo de metal, esse cubo é posicionado acima do N 2. O cubo de metal pode ser até mesmo um papel alumínio ou um material de metal, ambos são conhecidos por serem excelentes condutores de calor, o que facilita a vitrificação (SANTOS et al., 2007). A técnica de superfície sólida foi utilizada com sucesso em diversos estudos com murinos, o que gerou resultados bastante satisfatórios no que diz respeito ao nascimentos de crias viáveis (TAKAHASHI et al., 2001; MIGISHIMA et al., 2003; CHEN et al., 2006; HANI et al., 2006). Tais resultados foram obtidos após vitrificação do ovário inteiro e autotranplante. Apesar de existirem poucos estudos que utilizem a vitrificação por superfície para criopreservar tecido ovariano em pequenos ruminantes, na nossa equipe a utilização dessa técnica resultou na preservação da morfologia folicular semelhante ao tecido fresco (SANTOS et al., 2007) e da viabilidade folicular (CARVALHO et al., 2011). 25

26 2.6 AVANÇOS NA VITRIFICAÇÃO DE TECIDO OVARIANO OVINO O primeiro estudo relacionado à criopreservação de tecido ovariano na espécie ovina, o qual empregou a congelação lenta como método escolhido está prestes a comemorar duas décadas, (GOSDEN et al., 1994). No entanto, pesquisas envolvendo a vitrificação são bem mais recentes e resultados animadores já foram relatados. Em 2005 Bordes et al., obtiveram o nascimento de três crias saudáveis após criopreservação de hemiovários de ovelhas pela técnica de vitrificação convencional seguida de autotransplante ortotópico. Nesta técnica o material biológico, que neste caso foram metades de ovários, é imediatamente transferido para criotubos após a etapa de equilíbrio ou exposição aos crioprotetores, e em seguida imerso em nitrogênio líquido para a vitrificação e estocagem. Resultados semelhantes foram obtidos por Lornage et al. (2006) que obtiveram três gestações, com nascimentos de quatro cordeiros saudáveis após criopreservação do córtex ovariano utilizando o mesmo protocolo de Bordes et al., (2005). Adicionalmente Lornage et al. (2006) testaram duas soluções crioprotetoras e observaram que a solução que rendeu uma melhor viabilidade e morfologia folicular foi a mesma que foi usada para a vitrificação do córtex ovariano que resultou em nascimentos. Ao utilizar a vitrificação por superfície sólida foram obtidos resultados encorajadores no que diz respeito a uma alta taxa de maturação folicular (70%) (Al- AGHBARI & MENINO, 2002) e a um percentual de folículos morfologicamente normais, semelhante ao observado no tecido ovariano fresco (SANTOS et al., 2007). Resultados animadores também foram obtidos empregando a vitrificação por macrotubo. Nesse estudo, Lunardi et al. (2012) relataram viabilidade folicular e ultraestrutura oócitária após vitrificação e cultivo in vitro por 48 horas, similares àquelas verificadas no tecido ovariano fresco ou não vitrificado. 2.7 TÉCNICAS PARA AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE CRIOPRESERVAÇÃO Para avaliar a eficiência da criopreservação de tecido ovariano, os folículos préantrais podem ser investigados quanto à sua morfologia, viabilidade e capacidade de desenvolvimento in vitro. Além disso, considerando a importância da MEC ovariana para o desenvolvimento folicular, a aplicação de técnicas com a finalidade de avaliar a 26

27 integridade, bem como a presença de componentes da matriz representa também uma excelente abordagem. As características morfológicas dos folículos ovarianos têm sido amplamente avaliadas empregando-se a histologia clássica, a qual é considerada de baixo custo e de fácil execução. Além disso, tem grande relevância por ser um método quantitativo, no qual um grande número de folículos pode ser avaliado. Com isso vários trabalhos têm utilizado essa técnica após a criopreservação de tecido ovariano em pequenos ruminantes. Em cabras, Luz et al. (2009) observaram a manutenção da morfologia folicular semelhante ao controle fresco ao utilizar o Dimetilsulfóxido (DMSO) como agente crioprotetor. Resultados similares foram relatados por Pinto et al. (2008) para a congelação de ovário de ovelhas. Entretanto esta técnica permite identificar somente sinais avançados de atresia, como a picnose nuclear, danos citoplasmáticos, destacamento das células da granulosa e danos na membrana basal (DEMIRCI et al., 2002), não revelando alterações mais profundas. Estudos demonstraram que a análise morfológica também apresenta suas limitações, pois nem sempre pode ser correlacionada com a viabilidade e capacidade de desenvolvimento folicular (MARTINEZ-MADRID et al., 2004). É conhecido que a criopreservação pode induzir a ruptura da membrana celular, levando à morte dos folículos. Dessa forma, estudos sobre a integridade da membrana utilizando corantes vitais como o azul de Trypan (MERDASSI et al., 2011; CARVALHO et al., 2011; SANFILIPPO et al., 2013) são ferramentas importantes para análise da viabilidade folicular após criopreservação do tecido ovariano. Esses autores observaram que a viabilidade folicular após criopreservação se mantém semelhante ao tecido fresco ou não criopreservado. O cultivo in vitro de tecido ovariano também é uma ferramenta importante para avaliar a eficiência da criopreservação, uma vez que lesões foliculares não detectadas após a descongelação ou aquecimento podem evoluir e serem manifestadas após um período de incubação. Com isso pode haver redução da viabilidade folicular quando se compara tecido apenas criopreservado (71%) com tecido criopreservado seguido de cultivo (63%), como demonstrado por Rodrigues et al. (2005) na espécie caprina. Além disso, tem sido observado que quanto maior o período de cultivo, maior é a diferença entre o percentual de folículos viáveis oriundos de tecido apenas criopreservado (65%) e criopreservado seguido de cultivo in vitro (36,5%), como podemos observar pelos resultados obtidos por Lunardi et al. (2012) após vitrificação de ovário de ovelhas. Esse 27

28 efeito também pode ser observado sobre a morfologia folicular, como mostrado por Carvalho et al. (2013) também para a espécie caprina. Esses autores relataram 58,1% de folículos morfologicamente normais no tecido apenas criopreservado contra apenas 36,1% no tecido criopreservado seguido de cultivo in vitro. A ativação folicular é caracterizada não apenas por mudança da forma das células da granulosa de planas para cúbicas, mas também pela proliferação dessas células. Esse último evento pode ser avaliado por técnicas de histologia clássica e coloração de Ag-NOR. Um estudo realizado por Silva et al. (2003) mostrou que essa técnica detecta o número de regiões organizadoras de nucléolos (NOR) em células da granulosa e que o aumento da quantidade de NOR nessas células é um sinal de proliferação celular. Outra forma de avaliar a proliferação celular é através da detecção do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), que pode ser realizado por imunohistoquímica (SILVA et al., 2004). Em um estudo com crioprservação, Sanfilippo et al., 2013 observaram que não houve marcação para PCNA nos folículos de tecido ovariano não cultivado, no entanto houve marcação nos folículos após o cultivo in vitro por 6 ou 12 dias em tecido ovariano de mulheres previamente criopreservado. Técnicas que avaliem a manutenção da arquitetura tecidual, especificamente, sobre as proteínas da matriz extracelular são de grande valia para se empregar na avaliação dos protocolos de criopreservação, uma vez que a criopreservação pode causar danos a MEC ovariana, como demonstrado por Faustino et al. (2010). Dentre as técnicas, destacam-se as colorações de proteínas da matriz como os diferentes tipos colágenos. Como exemplo, destaca-se a coloração picrosírius red e a coloração de sais de prata que coram as fibras colágenas e as fibras reticulares, respectivamente. Adicionalmente, técnicas de biologia molecular como a imunohistoquímica também podem ser destacadas, as quais têm como principio a ligação antígeno-anticorpo. Ao utilizar essa técnica Berkholtz et al. (2006) identificaram que o colágeno tipo IV e a fibronectina eram mais abundantes nas células da teca, com baixa expressão nas células da granulosa e no estroma de tecido ovariano de ratas. Figueiredo et al. (1995) observaram que o os colágenos tipo I e III e a fibronectina estão presentes na túnica albugínea, no estroma e na região medular de ovário bovino. Portanto, a utilização dessas técnicas poderão ser de grande valia para comparar a condição dos componentes da MEC antes e após a vitrificação do tecido ovariano. 28

29 3 JUSTIFICATIVA A criopreservação é uma excelente alternativa para conservar a integridade e a viabilidade dos folículos presentes no ovário, oriundos de animais de produção, geneticamente superiores que venham a óbito, ou até mesmo de espécies ou raças em risco de extinção. Além do grande valor que a criopreservação representa para a Medicina Veterinária, especialmente para a Reprodução Animal, a criopreservação do ovário ovino pode servir também como modelo animal para a espécie humana. Estudos indicam que o ovário ovino é um candidato pontencial para pesquisas com humanos, tendo em vista a grande similaridade do órgão entre essas duas espécies (DEMIRCI et al., 2003), incluindo critérios como a arquitetura, uma única ovulação a partir de folículos primordiais distribuídos superficialmente na superfície do córtex (GERRITSE et al., 2008), dentre outros. A criopreservação pode ser realizada basicamente por dois métodos, isto é, a congelação lenta e a vitrificação. A congelação lenta é considerada o método convencional de criopreservação e tem sido largamente utilizada para a conservação de tecido ovariano em diferentes espécies. Este método caracteriza-se pela exposição do tecido a baixas concentrações de ACP (PAYNTER et al., 2000), seguida por resfriamento lento e gradual, utilizando freezer programável (JONDET et al., 1984). Já no método de vitrificação, os meios de criopreservação sofrem uma passagem direta do estado líquido para um estado amorfo ou vítreo, sem que haja uma cristalização do meio, evitando, portanto a formação de cristais de gelo (RALL e FAHY, 1985). Essa técnica tem como principais vantagens a não utilização de máquinas de congelação e a redução do tempo de processamento. Além disso, a vitrificação quando comparada à congelação lenta, resulta em menos danos durante o resfriamento, pois as amostras passam rapidamente pelos intervalos mais críticos de temperatura (15 C e -5 C). No entanto, lesões estruturais podem ocorrer em ambos os processos (YEOMAN et al., 2005). Diante disso, diversas técnicas de vitrificação vêm sendo desenvolvidas, dentre as quais destacam-se a vitrificação convencional (VC) e a vitrificação por superfície sólida (VSS) por não permitirem o contato direto com o nitrogênio líquido e, por serem de fácil manuseio. Partindo desse princípio, na presente pesquisa realizou-se a vitrificação por superfície sólida seguindo dois protocolos. Um dos protocolos foi a vitrificação por Ovarian Tissue Cryosystem (OTC), que é uma variação da técnica de 29

30 superfície sólida, desenvolvida por Carvalho et al. (2013) para o tecido ovariano de cabras. Nesse estudo, os autores obtiveram resultados satisfatórios no que diz respeito à morfologia e ultraestrutura, as quais foram similares ao tecido não vitrificado. O outro protocolo foi a VSS com cubos de alumínio utilizando os protocolos de exposição, aquecimento e remoção dos crioprotetores semelhantes aos aplicados por Bordes et al. (2005), cuja equipe foi a primeira a relatar nascimento após vitrificação do tecido ovariano ovino seguido de transplante. Apesar dos resultados animadores obtidos em estudos utilizando o OTC, bem como com a SSV, esse trabalho se justifica pela importância da avaliação da viabilidade folicular avaliada por corante vital. O foco principal do presente trabalho foi avaliar a o desenvolvimento de folículos pré-antrais e a arquitetura da matriz extracelular do tecido ovariano ovino submetido à vitrificação, seguida por sete dias de cultivo in vitro. Para isso, foi de vital importância. a utilização de análises precisas e já estabelecidas na literatura capazes de fornecer um resultado seguro. O cultivo in vitro foi utilizado como ferramenta para estimular os folículos a retomarem o seu metabolismo normal e avaliar a capacidade de desenvolvimento folicular após vitrificação.técnicas de histologia clássica através da coloração de HE ou especiais (picrosírius red e sais de prata) e imunohistoquímica para a verificação da MEC e proliferação celular (PCNA e Ag- NOR) também foram empregadas. 30

31 4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS O grau de crioinjúrias nos folículos pré-antrais e na matriz extracelular ovariana varia com o protocolo de vitrificação aplicado. 31

32 5. OBJETIVOS 5.1 OBJETIVO GERAL Determinar um protocolo de vitrificação por superfície sólida adequado para o tecido ovariano de ovinos 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Comparar duas diferentes técnicas de vitrificação por superfície sólida para o tecido ovariano ovino; 2. Avaliar a viabilidade, morfologia e o desenvolvimento de folículos pré-antrais ovinos inclusos no tecido ovariano antes e a após a vitrificação seguida do cultivo in vitro; 3. Avaliar a proliferação celular em folículos pré-antrais cultivados in vitro, após vitrificação do tecido ovariano; 4. Analisar componentes da matriz extracelular ovariana (colágeno e fibronectina) após vitrificação seguida do cultivo in vitro do tecido ovariano ovino. 32

33 6 CAPITULO I VITRIFICAÇÃO SEGUIDA DE CULTIVO IN VITRO DE OVÁRIO OVINO: AVALIAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO FOLICULAR E MATRIZ EXTRACELULAR OVARIANA (Vitrification followed by in vitro culture of ovine ovary: evaluation of follicular development and ovarian extracellular matrix) Periódico: Theriogenology (Submetido em novembro de 2013) 33

34 Vitrification followed by in vitro culture of ovine ovary: evaluation of follicular development and ovarian extracellular matrix F.T. Bandeira a, A.A. Carvalho a, S.V. Castro a, L.F. Lima a, D.A. Viana b, J.S.A.M. Evangelista c, M.J.S. Pereira d, C.C. Campello a, J.R. Figueiredo a, A.P.R. Rodrigues * a a Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles, Veterinary of Faculty, State University of Ceará, Fortaleza, Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza , CE, Brazil. b Laboratory of histology of effects caused by poisons of snakes and plants,, Veterinary of Faculty, State University of Ceará, Fortaleza, Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza , CE, Brazil. c Laboratory veterinary pathology,, Veterinary of Faculty, State University of Ceará, Fortaleza, Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza , CE, Brazil. d Laboratory of Neurophysiology, Institute of Biology Roberto Alcântara Gomes, State University, R. São Francisco Xavier, 524, Maracanã, Rio de Janeiro , CE, Bazil. *Corresponding author: Universidade Estadual do Ceará (UECE) Faculdade de Veterinária Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA); Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi; Fortaleza CE Brasil. CEP: ; Tel.: ; Fax: ; address: (Ana Paula Ribeiro Rodrigues) 34

35 ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the influence of two vitrification techniques for solid surface on the extracellular matrix (ECM) and ovarian follicular development. Ten pairs of sheep ovaries were cut into small fragments (9 mm3), a part of which was destined to immediate techniques of follicular and ECM analysis (fresh control), the remainder was cultured for 1 or 7 days (control cultured), vitrified by ovarian tissue cryossystem (OTC) or solid surface (SSV), or vitrified/cultured. Follicles from all the fragments were analyzed for morphology and growth / development (histology), viability (trypan blue) and cell proliferation (PCNA and Ag-NOR). The extracellular matrix was evaluated by the condition of collagen and reticular fibers by picrosirius red, silver salts and the immunolocalization of type I collagen and fibronectin. The data of morphology, development and average of NOR were submitted to ANOVA followed by tests Student-Newman-Keuls and Dunnets. In respect of data to the collagen fibers, this were subjected to the Kruskal-Wallis test followed by Dunn's multiple comparison. Differences were considered significant when P<0.05. After 7 days of culture, the tissue vitrified by OTC resulted in a higher percentage of morphologically normal follicles (30.66%) and viable (60.00%) when compared to SSV (21.33% and 23.00%). In all cultured fragments, regardless of vitrification technique, was observed a significantly higher percentage of developing follicles when compared to non-cultured tissue. By the Ag-NOR technique it was found that the SSV immediately after warming promotes a significant reduction of average NOR/cell in comparison to other treatments. The analysis of type I collagen showed that in the fragments that were vitrified there was an increased immunostaining after in vitro culture. In conclusion, the technique of OTC better preserves the follicular viability and morphology and to maintain the integrity of the extracellular matrix components of ovary in ovine. Keywords: Solid Surface Vitrification, ovarian tissue, collagen, fibronectin, folliculogenesis. 35

36 1. Introduction Nearly 20 years it has been shown that the ovarian tissue cryopreservation preserves fertility of production animals [1,2] as well as women undergoing chemoradiotherapy treatments using the slow freezing as the preferred method [3,4,5,6]. However, currently, the vitrification method has been highlighted in the scientific community, which unlike slow freezing prevents or reduces the formation of intracellular ice [7,8], which is extremely damaging to the structure and consequently to cellular function. Thus, several vitrification techniques have been proposed and employed with satisfactory results that range from the simple maintenance of morphology [9] and follicular viability by conventional vitrification [10], until the birth of healthy offspring by cryotube [11]; fiberplug [12] or conventional vitrification [13]. Recently, our team has developed a technique for solid surface for caprine ovarian tissue, called ovarian tissue cryosystem (OTC). This technique not only maintained the morphology and viability of vitrified preantral follicles similar to fresh [14], and also did not increase the rate of apoptosis and the expression of phosphorylated H2AX, which is damage to the molecule DNA (Carvalho et al, unpublished data). Nevertheless, there is still no reports on extracellular matrix (ECM) after vitrification procedure of ovarian tissue, which is extremely important in follicular development [15,16,17]. The ovarian ECM is a set of compartments and components that provides the microenvironment necessary for the cells growth and specialization in a tissue. It is known that it influences the fluid dynamics in tissues, promoting osmotic forces and filtering substances (hormones and nutrients) that reach the cells. Another important function of the ECM, is participation in various phenomena such as migration, division, differentiation, anchoring and cell death, since all these phenomena occur amid their different compartments [15]. Specifically, to the ovary, the ECM is required for the maintenance of cellular interactions, whether paracrine, autocrine or endocrine, thereby providing the necessary communications for the formation, development and migration of follicle within the ovary [17]. The major components of the ECM ovarian are adhesion proteins such as fibronectin and protein support, such as different types of collagen. These molecules have the capacity to interact with each other through defined amino acid sequences and thus being recognized by membrane receptors, the integrins. These proteins form the 36

37 collagen and reticular fibers, respectively responsible for the support and elasticity of the organs [18]. Considering the importance of the ECM for follicular development, recent studies have used alginate, a synthetic extracellular matrix, during procedures of cryopreservation and in vitro culture of isolated ovarian follicles. This matrix, besides maintaining the three dimensional structure of the follicle, allows interaction between granulosa cells and oocytes and also facilitates handling of follicles during these procedures [19,20]. However, for this matrix being inert, does not provide the main functions of the natural ECM, which is to promote follicular development through its remodeling and nutrient supply [15]. Therefore, it is believed that for normal follicular development after cryopreservation is essential the preservation of natural ECM. The aim of this study was to evaluate the influence of the vitrification by solid surface using two different techniques (OTC or SSV) on the extracellular matrix and ovarian follicular development. 2. Material and methods This experiment was approved by the Ethics Committee for Animal Use at the State University of Ceará with process number Unless mentioned otherwise, the culture media and other chemicals used in the present study were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA) Collection, transport and preparation of ovarian tissue from sheep Ovaries (n = 10) from adult mixed-breed were collected from a local slaughterhouse. Immediately after collection, pairs of ovaries were washed once in 70% alcohol for 10 seconds and then twice in Minimum Essential Medium buffered with HEPES (MEM-HEPES) and supplemented with antibiotics (100 ng/ml penicillinstreptomycin). The ovaries were transported to the laboratory in this same medium at 20 C within one hour. In the laboratory, from each pair the ovarian cortex was fragmented and obtained 18 fragments with 9 mm 3 thick. (3 mm x 3 mm x 1 mm). One fragment was immediately fixed and destined to the morphological analysis and the other for the analysis of follicular viability, both consisting the fresh control (n=2 - T1). Four fragments were used for in vitro culture for 1 (n=2 - T2) or 7 (n=2 - T3) days 37

38 corresponding to the cultured controls (follicular morphology and viability). The remaining fragments were used for vitrification followed (n=8 T4 to T7) or not (n=4 T8 to T9) by in vitro culture, thus totaling nine treatments, as described for the fresh control (T1), treatments from 2 to 9 were also subjected to analysis of morphology and viability. Two techniques were used for vitrification: 1) Ovarian Tissue cryossystem (OTC) technique, developed by Carvalho et al. [14] and 2) vitrification by solid surface (SSV) based on protocol described by Bordes et al. [21] with some modifications Vitrification and warming procedures Vitrification by solid surface (SSV) For this technique, it was used a vitrification solution (VS) consisted of MEM plus 2.62 M dimethylsulfoxide (DMSO), 2.60 M acetamide, 1.31 M propanediol and M polyethylene glycol. The exposure of the ovarian tissue to cryoprotectants agents (CPAs) was performed in four steps, using increasing concentrations of cryoprotectants based on protocol from Bordes et al. [21]. In summary, the fragments were exposed for 5 minutes to step 1 (12.5% VS) and 2 (25% VS) at room temperature (RT ~ 20 ºC). Subsequently, the fragments were exposed to step 3 (50% VS) and 4 (VS 100%) for 15 min at 4 C and vitrified by SSV. The fragments were transferred to a metal cube partially immersed in liquid nitrogen (LN 2 ), and to the observe vitrification tissue, the fragments were transferred to cryotubes previously cooled, and then stored in liquid N 2 for up to 1 week. For warming, the cryotubes were exposed to RT for 20 seconds and immersed in a water bath (37 ºC) for 10 minutes. Soon after, it was performed the removal of CPAs by immersion of ovarian fragments in washing solutions (WS) formed by decreasing concentrations of VS (WS1: 50% VS; WS2: 2.25% VS; WS3: 12.5 % of VS and WS4: MEM only). Each wash was performed for a period of 5 min at RT Vitrification by ovarian tissue cryosystem (OTC) In this technique, the exposure to CPAs was performed in two steps. In the first, one the fragments were exposed for 4 minutes at RT in a solution consisting of MEM supplemented with 10 mg/ml of bovine serum albumin (BSA), 0.25 M sucrose, 10% 38

39 ethylene glycol (EG) (Dynamic - Dynamic Chemistry, Diadema, Brazil) and 10% DMSO (Dynamic). In the second step, the fragments were exposed for 1 min at RT in a solution consisting of MEM supplemented with 10 mg/ml BSA, 0.25 M sucrose, 20% EG and 20% DMSO. To both solutions were adjusted to ph All the procedure of exposure to CPAs was carried inside the OTC and after exposure, the solution was removed and the device was closed, transferred to liquid N 2 and stored for up to 1 week. For warming, the OTC was kept at room temperature for 1 minute and then immersed in a water bath (37 C) for 30 seconds. The CPAs removal was performed by in a three-step equilibrium (5 min each) in (i) MEM + 3 mg/ml BSA M sucrose, (ii) MEM + 3mg/mL BSA M sucrose, and finally (iii) MEM + 3 mg/ml BSA. 2.3 In vitro culture of ovarian fragments Fresh or vitrified/warmed fragments were cultured for 1 (d1) or seven (d7) days in 24-well plates containing 1 ml medium in a incubator pre-calibrated at 39 C with 5% CO 2 in air. The medium consisted of α-mem supplemented with 1.25 mg/ml bovine serum albumin (BSA), 5.5 µg/ml transferrin, 5.0 ng/ml selenium, 2 mm glutamine, 2 mm hypoxanthine, 10 ng/ml insulin, bovine recombinant FSH at 100 ng/ml (rbfsh - Nanocore - Brazil), penicillin and streptomycin (100 µg/ml). Every other day, the culture media was replaced with fresh media (prepared and maintained for equilibration in a CO 2 incubator for 4 h prior to use). 2.4 Follicular morphology evaluation Fragments from fresh tissue, vitrified or vitrified followed by in vitro culture were fixed in Carnoy s solution, dehydrated in increasing concentrations of alcohol, diaphanized, included in paraffin and serially sectioned at a thickness of 7µM. To evaluate follicular morphology, slides were stained with hematoxylin - eosin (HE), mounted and examined under a light microscope (Nikon, Tokyo, Japan). It was evaluated a total of 150 preantral follicles per treatment (30 per animal). Only preantral follicles with visible nuclei were counted. According to the qualitative aspect, preantral follicles were classified as morphologically normal only when they contained intact oocyte and granulosa cells and degenerated when they showed nuclear pyknosis, cytoplasmic retraction or disorganization of granulosa cells [22]. According to the stage 39

40 of follicular development, follicles were classified as primordial, those who had oocyte surrounded by a layer of flattened squamous pre-granulosa cells or developing follicles when they had oocytes surrounded by cuboid granulosa cells and absence of antrum. 2.5 Assessment of cell proliferation The rate proliferation of follicular cells in all treatments was evaluated by immunohistochemical detection of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and by quantifying the number of nucleolus organizer regions (NORs) argentaffin (Ag). For immunohistochemistry, the fragments of ovarian tissue were fixed in 4% paraformaldehyde overnight (4 C) and subjected to histological processing described above. Sections of 5 µm were mounted on slides coated with poly-l-lysine positively charged (Starfrost, Knittel, Germany). Epitopes were activated by incubation in 0.01 M citric acid buffered (ph 6.0) supplemented with Tween 20 and hydrogen peroxide in a pressure cooker for 5 minutes. Then, were performed the blockages of endogenous peroxidase activity, endogenous biotin and blocking nonspecific by incubation in 5% normal goat serum and 3% triton x 1000 diluted in PBS. After the epitopes activation, slides were incubated overnight at 4 C with anti- PCNA (1: AB2426, ABCAN, Inc., USA). Thereafter, the slides were washed in PBS and incubated with the biotinylated anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) secondary antibody (1:500 - AB97049, ABCAN, Inc., USA). After that the slides were washed, the location of the protein was developed with diaminobenzidine (DAB 1 drop of DAB for 1 ml of substratum - K ; Dako, Inc, Carpinteria, CA, USA). Finally, the sections were counterstained with hematoxylin. The negative controls were carried out by replacing the primary antibody. Once mounted, the slides were visualized under a light microscope. In all treatments, were evaluated primordial and developing follicles so that were considered for the analysis those follicles that had at least one granulosa cell stained for PCNA. The scores attributed to immunostaining varied from weak to strong according to the signal intensity indicated by brown staining (Fig. 3). The immunostaining was classified weak (+) to strong (+++). For NORs marking, after reduction with potassium iodide 1%, slides containing tissue sections were stained with silver nitrate solution 50% in a colloid solution (2:1) in a darkroom and counterstained with safranin 0.1%. To quantify the NORs, 30 developing follicles were visualized under a light microscope (1000x) and counted 40

41 NORs of all nuclei of visible granulosa cells according to the protocol used by Silva et al. [23]. 2.6 Follicular viability analysis For viability analysis, the preantral follicles were mechanically isolated using a procedure described by Amorim et al. [24] with some modifications. Briefly, samples were cut into small pieces with a tissue chopper adjusted to a sectioning interval of 87.5 μm. Samples were placed in MEM supplemented with 3 mg/ml BSA, and suspended 100 times with a large Pasteur pipette (inner diameter ~1600 μm), followed by 100 times with a smaller Pasteur pipette (inner diameter ~600 μm) to dissociate preantral follicles from stroma. The obtained material was then passed through a 200 μm nylon mesh filter. This procedure was performed within 10 min at room temperature (RT; approximately 25 C). The viability of preantral follicles was assessed by the trypan blue, a dye exclusion test. Briefly, 5 μl of 0.4% trypan blue was added to 100 μl of isolated and suspended preantral follicles, which were incubated for 1 minute at RT. Afterwards, follicles were examined with an inverted microscope and classified as viable if the oocyte and granulosa cells remained unstained [14]. 2.7 Analysis of the extracellular matrix In order to evaluate the effect of vitrification protocols followed by in vitro culture on extracellular matrix fibers from ovarian córtex, picrosírius red and silver salts staining were performed, as well as immunohistochemical detection of fibronectin and collagen type I Staining of collagen and reticular fibers The collagen and reticular fibers were evaluated by picrosirius red and silver salts staining, respectively. For picrosirius red staining, 7 µm ovarian sections were stained with Sirius Red (0.1%) diluted with picric acid (1.2%) and analyzed by polarized light microscopy (Nikon, Tokyo, Japan). For each treatment, we evaluated the percentage of the area occupied by collagen fibers in nine different fields (area 1280 π 2 ) measured with the aid of a DS Cooled Camera Head DS-Ri1 coupled with a Nikon 41

42 Eclipse 80i microscope and analyzed by Nikon NIS-Elements software (Nikon NIS- Elements 3.0, 2008) under 400x magnification. For silver salts staining, the slides containing histological sections with 5 µm were stained with a 50% solution of silver salts and incubated for 1 h at 50 C. The stained slides were evaluated by light microscopy (Nikon, Tokyo, Japan) for the presence of reticular fibers (predominantly type III collagen) near to preantral follicles Detection of type I collagen and fibronectin by immunohistochemistry Immunohistochemistry was performed as previously described. We used primary polyclonal rabbit antibodies to detect fibronectin (1:300 - AB24131, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) and collagen type I (1:300 - AB34710, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA). The slides were mounted and visualized under a light microscope, and considered marked the ovarian fragments that had the brown color in the stroma. Finally, scores were assigned to the markup that ranged from weak to strong according to the intensity of the marking. 2.8 Statistical analysis Data were initially evaluated for homocedasticity and normal distribution of the residues by Bartlett s and Shapiro-Wilk tests, respectively, to confirm requeriments underlying analysis of variance. ANOVA was then carried out according to a 3x2 factorial arrangement of treatments with procedure (cryopreservation by OTC, SSV or none) and time culture (one or seven days) as the main effects. The model used was Y ij =µ+p i +T j +(P i T j )+e ij, where Y ij = dependent variable, µ= general mean; P i = procedure, T j = time culture, P i T j = interaction between procedure and time culture, and e ij = residual error. When any main effect or interactions were significant, means were separated by Student-Newman-Keuls test. Dunnets s test was applied to compare experimental treatments against control groups, i.e. fresh (non-cultured) samples. For NOR/nucleus analysis, factorial arrangement included also follicular category (primordial or developing follicles) and its interaction with other main effects. Regarding to PCNA and follicular viability analysis, follicles were taken as a pool and analyzed by dispersion of frequency with Chi-square test. For analysis of collagen fibers, the data were analyzed by Kruskal-Wallis test followed by Dunn's Multiple 42

43 Comparison. Differences were considered to be significant when P < 0.05 and results were expressed as mean ± standard error of means (SEM). 3. Results 3.1 Percentage of morphologically normal preantral follicles In the present study, were analyzed by histology 150 follicles per treatment, totaling 1,350 follicles, whose normal characteristics (oocyte with central nucleus and intact and organized granulosa cells) and degeneration (nuclear pyknosis, cytoplasmic retraction or disorganization of granulosa cells) are shown in Fig 1. The percentage of morphologically normal follicles in all treatments is presented in Table 1. Regardless of the method of vitrification (OTC or SSV), in groups of non cultured fragments there was a reduction in the percentage of morphologically normal follicles compared to control (99.33%). However, the vitrification by OTC maintained a percentage of morphologically normal follicles (80.00%) significantly higher than the vitrification by SSV (50.67%). It was also observed that, from the first day of culture there was a reduction in the percentage of normal follicles, both in the vitrified as well non vitrified tissue, with a higher decrease on day 7 of culture. The percentage of morphologically normal follicles observed after 1 day of culture was similar between the two techniques of vitrification (OTC: 38.67% and SSV: 34.00%), however, after 7 days of culture, the OTC (30.66%) showed a percentage of normal follicles significantly higher than SSV (21.33%). Table 1. Percentage of morphologically normal preantral follicles (mean ± SEM) included in ovine ovarian tissue fresh or vitrified by SSV or OTC before or after in vitro culture for 1 or 7 days. Cultured follicles Treatment Non cultured Day 1 Day 7 Control ± 0.66 Aa 66,00 ± 3.24 Ba 52,00 ± 2.00 Ca OTC ± 2.36 Ab 38,67 ± 3.09 Bb 30,66 ± 2.21 Cb SSV ± 4.40 Ac 34,00 ± 1.63 Bb 21,33 ± 1.70 Cc A,B, C Differs among columns. a,b,c Differs among lines (P < 0.05). In all treatments in which the ovarian tissue was cultured, it was a significant 43

44 increase in the percentage of developing follicles, when compared to non cultured fragments (Fig. 2). The comparison between days of culture showed that in the vitrified tissue, the percentage of developing follicles significantly increased from day 1 (68.05%) to day 7 (84.75%). The opposite was observed for the fragments vitrified by SSV (day 1: 60.81% vs. day 7: 49.43%), whereas for the OTC, the results were similar between day 1 (63.21%) and 7 (63.46) in vitro culture. Fig. 1. Micrographs of sheep preantral follicles. Histological sections (A,) - primordial and development follicle normal note an oocyte centralized surrounded by a layer of shaped pre-granulosa cells (B). Developing follicle showing shrinkage of the oocyte (*), characteristic of follicular degeneration. (C) Viable (not stained). (D) Non viable (stained) preantral follicle (stained by trypan blue). Cellular proliferation micrographs showing primordial (E) and developing (F) follicle, the arrows indicate the presence of NORs in granulosa cells. Gc: granulosa cells, Oo: Oocyte, Nu: nucleo of oocyte. 44

45 Fig. 2. Percentage of developing preantral follicles (mean ± SEM) after 1 or 7 days of culture, before and after vitrification by OTC or SSV. A,B, C Differs between days of culture within the same treatment (P < 0.05). a,b,c Differs among treatments within the same day of culture (P < 0.05). 3.2 Cell proliferation during the in vitro culture of preantral follicles To evaluate the proliferative capacity of granulosa cells of preantral follicles were used the Ag-NOR technique for marking of nucleolar organizer regions and immunohistochemistry for PCNA. The data are shown in Table 2. By the technique of Ag-NOR (Fig. 1.F) it was observed that prior to in vitro culture, the follicles present in the fresh ovarian tissue or vitrified by OTC maintained an average of NOR by nucleus of granulosa cells similar to each other (P > 0.05). However, follicles vitrified by SSV showed a mean of NORs significantly lower than the control or vitrified by OTC (P < 0.05). Follicles vitrified by SSV or OTC, followed by in vitro cultured showed average of NORs significantly lower than the cultured and non cultured control. Table 2. Average of development NORs per nucleus of granulosa cells of preantral follicles (fresh or vitrified) before and after in vitro culture. Development follicles Treatment Non cultured Cultured Control 1.95 ± 0.11 Aa 1.65 ± 0.28 Aa OTC 1.87 ± 0.12 Aa 1.18 ± 0.16 Bb SSV 1.54 ± 0.06 Ab 1.04 ± 0.12 Bb A,B, C Differs among columns. a,b,c Differs among lines (P < 0.05). The results of the immunohistochemistry for PCNA showed that the fresh or vitrified preantral follicles exhibited a strong immunoreactivity (Fig. 3.A, 3.B and 3.C). However, after in vitro culture, was observed a decrease in cell proliferation, characterized by a weak immunoreactivity (Fig. 3.D, 3.E and 3.F) (Table 3). 45

46 Fig 3. Photomicrograph of immunohistochemistry for PCNA, showing strong labeling in non cultured treatments - (A) control, (B) OTC (C) SSV, and weak in the cultured treatments - (D) control, (E) OTC (F) SSV. Table 3. Intensity staining for PCNA, fibronectin and collagen type I in ovine ovarian tissue fresh or vitrified before and after 7 days of in vitro culture. Protein Groups Control OTC SSV Fresh Cultured Non Cultured Non Cultured (d7) cultured (d7) cultured (d7) PCNA Fibronectin Collagen I Immunoreactivity: (+) weak, (++) moderate, (+++) strong 3.3 Follicular viability by trypan blue Images of viable (unstained) and non-viable (stained in blue) follicle are shown in Fig, 1 (C and D). Before the in vitro culture, the trypan blue assay showed that the 46

47 percentage of viability for follicles originating from fresh tissue and tissue vitrified by OTC was similar between them (P > 0.05), but both were significantly higher than those follicles derived from the vitrified tissue by SSV (P < 0.05). Similar results were obtained after 7 days of in vitro. The follicular viability was significantly reduced (P < 0.05) in all cultured treatments, when compared to non cultured fragments (Fig. 4). Fig. 4. Percentage of viable follicles of control (fresh), vitrified (OTC or SSV) before and after in vitro culture. A, B, C Differs among all treatments (P<0,05). 3.4 Assessment of ovarian extracellular matrix The ovarian ECM was analyzed by staining with silver salts (qualitative evaluation), picrosirius red staining as well as by immunodetection of fibronectin and collagen type I proteins (Fig. 5). The analysis by silver salts showed that reticular fibers were well preserved in fresh ovarian tissue (control), and vitrified by OTC, followed or not by in vitro culture. However, in the fragments vitrified by SSV had a reduction of reticular fibers. The analysis of collagen by picrosirius red showed that the percentage of collagen in fragments vitrified by SSV or OTC was similar to control. In addition, the in vitro culture did not alter the amount of collagen when the treatments were compared to each other and to the fresh control. 47

48 Fig. 5. Staining of reticular fibers by silver salts stained in black (left column) and collagen by picrosirius red stained in red (right column) in ovine ovarian tissue. Fig. 6. Percentage of collagen in the ovine ovarian tissue analyzed by picrosirius red technique. The data showed weak immunostaining for fibronectin in all treatments, regardless of in vitro culture (Fig. 7 - left column). This result was similar to collagen type I for both the fresh control (Fig. 7.A - right column), as for the cultured control (Fig. 7.B - right column). On the other hand, after culture, the staining for type I collagen in vitrified treatments was more evident, characterized as moderate (Fig. 7.D 48

49 and 7.F - right column) compared to non cultured treatments, in which the staining was weak (Fig. 7.C and 7.F - right column). Fig. 7. Photomicrographs showing fibronectin immunoreactivity (left column) and collagen type I (right column). Arrows indicate marking. 4. Discussion The technique of solid surface, which has as the main strategy, the use of a minimum volume of solution to reduce damage caused by the solution effect and osmotic shock, has been widely used for vitrification of ovarian tissue from different species as murine [25], caprine [26] and human, Fatehi [in press]. Therefore, in this study, we investigated the influence of two different protocols (OTC and SSV) on follicular development based on the proliferation of the granulosa cells, as well as on the ovarian ECM, which plays an important role on folliculogenesis [16,17]. The SSV technique was based on the protocol from Bordes et al [21], whose study resulted in the birth of lambs after transplantation of vitrified ovarian tissue. Adopting, therefore, the same vitrification solution, and the procedure of adding and removing of cryoprotectants agents used for vitrification of ovarian tissue. The OTC technique, on the other hand, refers to a new system designed for the vitrification of caprine ovary. In this system, among other characteristics, it is used a manufactured 49