UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS SIMONE VIEIRA CASTRO EFEITO DO MÉTODO DE CRIOPRESERVAÇÃO E DO MEIO DE CULTIVO IN VITRO SOBRE A CAPACIDADE DE DESENVOLVIMENTO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS BOVINOS FORTALEZA CEARÁ 2015

2 SIMONE VIEIRA CASTRO EFEITO DO MÉTODO DE CRIOPRESERVAÇÃO E DO MEIO DE CULTIVO SOBRE A CAPACIDADE DE DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS BOVINOS Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de pesquisa: Reprodução e Sanidade de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves. Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues. FORTALEZA CEARÁ 2015

3 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará Sistema de Bibliotecas Castro, Simone Vieira Castro. Efeito do método de criopreservação e do meio de cultivo sobre a capacidade de desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais bovinos [recurso eletrônico] / Simone Vieira Castro Castro CD-ROM: il.; 4 ¾ pol. CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico com 149 folhas, acondicionado em caixa de DVD Slim (19 x 14 cm x 7 mm). Tese (doutorado) Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Fortaleza, Área de concentração: Reprodução e sanidade animal. Orientação: Prof.ª Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues. 1. Tecido ovariano. 2. M McCoy. 4. alfa- MEM. I. Título.

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5 À minha família, pelo amor e apoio incondicional. Dedico

6 AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual do Ceará, em especial ao Programa de Pós-Gaduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), que me proporcionou a realização de um curso de pósgraduação de reconhecida qualidade. À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo suporte financeiro por meio da concessão da bolsa. À banca examinadora, por ter aceitado prontamente o convite, sobretudo pela colaboração na correção deste trabalho. À Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues e Dr. José Ricardo de Figueiredo, pela orientação na realização deste trabalho, pela oportunidade e pela confiança em mim depositada. Obrigada por todos os ensinamentos. Ao professor Dr. Cláudio Cabral Campello, tanto pelo precioso auxilio na análise estatística, quanto pela dedicação e atenção sempre que solicitado. Ao Dr. Vilceu Bordignon e Dr. Hernan Baldassarre pela excelente acolhida durante o estágio de doutorado sanduiche. Aos amigos e colegas de trabalho Luke Currin, Karina Gutierrez, Werner Glanzer, Rodrigo Bohrer e Naomi Dicks, pela paciência, por compartilhar conhecimentos e principalmente por tornar a estadia em Montreal uma ótima experiência. Aos colegas do laboratório de manipulação de oócitos e folículos pré-antrais (LAMOFOPA) pela companhia e convivência diária durante todo este período. Aos meus queridos pais Diomar F. Castro e Maria Divina Vieira M. Castro, meus amados irmãos Diogo Vieira Castro e Eudes Vieira Castro e aos demais familiares, que mesmo à distância me deram apoio e incentivo para concluir esta etapa. Enfim, agradeço a todas as pessoas que contribuíram de alguma forma para esta conquista. Muito obrigada!

7 A ciência serve para nos dar uma ideia de quão extensa é a nossa ignorância. (Félicité Robert de Lamennais)

8 RESUMO A criopreservação tem se destacado como uma importante ferramenta para as técnicas de reprodução assistida, sendo investigada em diferentes espécies. Porém há pouca informação acerca da criopreservação de tecido ovariano e folículos pré-antrais bovinos. Desta forma, os objetivos deste estudo foram comparar a eficiência dos métodos de congelação e vitrificação, para o tecido ovariano bovino, bem como definir um meio de base ideal para o cultivo in vitro de folículos pré-antrais inclusos no tecido ovariano criopreservado por ambos os métodos. Fragmentos de córtex ovariano (fresco, congelado ou vitrificado) foram cultivados em diferentes meios (McCoy, M199 e αmem) e submetidos às análises morfológica, de viabilidade, proliferação celular, produção hormonal e integridade do estroma ovariano. Tanto após a congelação quanto à vitrificação, o percentual de folículos morfologicamente normais foi superior quando utilizado o meio McCoy. Já para o tecido fresco o meio M199 foi significativamente superior aos demais. A dosagem hormonal revelou que ao fim do cultivo de tecido previamente vitrificado (fase 1) houve um aumento de progesterona e estradiol quando o cultivo foi realizado com M199 e McCoy, respectivamente. Para o tecido congelado, não foram verificadas diferenças na produção hormonal, quando comparado ao tecido fresco (fase 2). Para o tecido congelado, o meio McCoy foi significativamente superior aos demais meios, no tocante à morfologia e proliferação celular. A fase 3 revelou que ambos os métodos de criopreservação reduziram o percentual de folículos normais quando comparado com o controle, porém mantiveram o percentual de folículos em crescimento, diâmetro e viabilidade folicular. A identificação do antígeno célula de proliferação celular (PCNA), por imunohistoquímica bem como por Western blot não diferiu entre os dois métodos de criopreservação. Contudo, a análise do estroma ovariano revelou uma redução na densidade de células estromais e na área ocupada por colágeno após a criopreservação por ambos os métodos, sendo as fibras colágenas mais afetadas pela vitrificação. Em conclusão, demostramos que o meio de base mais adequado para tecido ovariano bovino não criopreservado foi o M199. Já para tecido previamente criopreservado, por ambos os métodos, o meio mais indicado que pela congelação lenta foi o McCoy, o qual é capaz de manter a viabilidade e potencial de desenvolvimento folicular semelhante aos folículos frescos ou não criopreservados. Palavras-chave: Tecido ovariano. M199. McCoy. αmem.

9 ABSTRACT Cryopreservation has emerged as an important tool for assisted reproductive techniques, being investigated in different species. However there is little information about the ovarian tissue cryopreservation and preantral follicles in bovine. Thus, the objectives of this study were to compare the efficiencies of cryopreservation methods, slow freezing and vitrification, for bovine ovarian tissue and define an ideal base medium for the in vitro culture of preantral follicles included in bovine ovarian tissue, subjected to cryopreservation by both methods. Fresh, frozen and vitrified fragments of bovine ovarian cortex were cultured in different media and subjected to morphological, viability and cell proliferation analysis, hormone production and integrity of the stroma. For frozen and vitrified tissue, the percentage of morphologically normal follicles was higher when using McCoy medium. For the fresh tissue the M199 medium was significantly higher morphologically than the others. The hormonal dosage revealed an increase of progesterone in vitrified tissue when cultured in M199 and an increased estradiol in McCoy (phase 1). The frozen tissue has not showed differences in hormone production, compared to fresh tissue (phase 2). For frozen tissue, McCoy medium was significantly superior to other means, with respect to morphology and cell proliferation. The phase 3 revealed that both cryopreservation methods reduced the percentage of normal follicles compared to control, but maintained the percentage of growing follicles, follicular diameter and viability. The evaluation of cell proliferation by immunohistochemistry for PCNA, as well as protein quantification by western blot showed no difference between the cryopreservation methods and fresh tissue. However, the analysis of ovarian stroma showed a reduction on the density of stromal cells and on the area occupied by collagen after cryopreservation by both methods. The collagen fibers are more affected by vitrification as compared to slow freezing. In conclusion, we demonstrate that the M199 medium was more appropriate for fresh bovine ovarian tissue. For previously cryopreserved tissue, by both methods, the most suitable medium was McCoy, which is able to maintaining the viability and follicular development similar to the fresh follicles or not cryopreserved ovarian tissue. Key-words: Ovarian tissue. M199. McCoy. αmem

10 Revisão de literatura LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Representação esquemática da estrutura ovariana. Adaptado de _lab.htm Figura 2 Representação esquemática da classificação folicular ao longo da foliculogênese Figura 3 Número de artigos publicados sobre criopreservação de embriões, oócitos e tecido ovariano (A) e congelação lenta e vitrificação (B) com base nas palavras indexadoras do PUBMED <embryo+cryopreservation> <oocyte+cryopreservation> <ovarian+tissue+cryopreservation> <slow+freezing> <vitrification> Capitulo 1 Figura 1 Estrutura da Hsp70 com domínio de ligação ao substrato (SDB) e domínio ATPase (NBD) ligados por uma sequência hidrofóbica (KAMPINGA; CRAIG, 2010). 41 Figura 2 Representação esquemática do mecanismo de ativação gênica Hsf- Hse. Diversos fatores como estresse osmótico, oxidativo e exposição à radiação causam desnaturação protéica. As proteínas desnaturadas estimulam a trimerização do Hsf, que uma vez ativo liga-se ao Hse na região promotora do gene HSP70 e induz a produção da proteína Hsp70 43 Figura 3 Representação esquemática das vias apoptóticas extrínseca (linha pontilhada) e intrinseca (linha contínua), demonstrando os diferentes pontos em que a Hsp70 atua para inibir a desencadeamento da apoptose. 46

11 Capítulo 2 Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4 Figure 5 Morphological aspects of bovine preantral follicles after 5 d of in vitro culture. Secondary normal follicle in A, arising from frozen tissue cultured with the McCoy medium, and primary follicle degeneration in B, originating from vitrified tissue cultured with αmem. The figure shows the pyknotic oocyte (white arrow) and cytoplasmic retraction (black arrow) Percentage of morphologically normal follicles for in vitro cultures of bovine ovarian tissue (fresh or vitrified). FC: fresh control, VC: vitrified control. * Differs to the fresh control; differs from the vitrified control; AB differs significantly among culture media within the same group (cultured or vitrified cultured); ab difference between culture days; α β difference between cultured and vitrified cultures within each in vitro culture medium.. 68 Percentages (mean + SEM) of primary (A) and growing follicles (B) in non-cultured tissue (fresh control), vitrified tissue (vitrified control), and previously cultured tissue for 5 d (with and without prior vitrification) in the αmem, McCoy, or M199 medium. * Differs to the fresh control; differs significantly when compared to the vitrified control; A B represents a significant difference between media within the same group (cultured or vitrified cultured); and α β indicates differences between treatments (vitrified and non-vitrified) in the culture media. 69 Percentage of viable follicles in cultured bovine ovarian tissue on D5, with and without prior vitrification. Different letters indicate statistical differences Quantification of reactive oxygen species in the culture media. AB Represents a significant differs among the media on the same culture day (i.e., days 1 or 5) and analysis condition (i.e., with and without vitrification); ab differences between the days of culture in the same medium and condition analysis; and αβ represents the differences between treatments (with and without vitrification) for each medium and culture day.. 72

12 Capítulo 3 Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4 Figure 5 Morphological aspects of bovine preantral follicles after 5 days of in vitro culture. Images show a morphologically intact primordial follicle in the frozen-cultured fragment in McCOy (a) and degenerated growing follicles in the fresh-cultured fragment in αmem (b) presenting picnose oocytes (white arrow) and cytoplasmic shrinkage (black arrow) Percentage of morphologically normal bovine preantral follicles in fresh, frozen, and cultured ovarian tissues. C1, fresh control; C2, frozen control; * significant difference from the fresh control; significant difference from fresh and frozen control. Different uppercase letters (AB) indicate a significant difference between days of culture. Different lowercase letters (ab) indicate significant differences among media within the same day (1 or 5) and treatment (fresh or frozen). Different Greek symbols (αβ) indicate differences between treatments (fresh or frozen) within each medium and day of culture.. 91 Percentage of growing preantral follicles before and after in vitro culture for up to 5 days. C1, fresh control; C2, frozen control; * significant difference from the fresh control; significant difference from fresh and frozen control. Different uppercase letters (AB) indicate a significant difference between days of culture. Different lowercase letters (ab) indicate significant differences among media within the same day (1 or 5) and treatment (fresh or frozen). Different Greek symbols (αβ) indicate differences between treatments (fresh or frozen) within each medium and day of culture.. 92 Bovine growing preantral follicles stained using the AgNOR technique, showing the nucleolar organizer regions (NOR) stained black by silver nitrate (white arrows).. 93 Quantification of reactive oxygen species from the media of the fresh-cultured and frozen-cultured tissues. Different uppercase

13 letters (AB) indicate a significant difference between days of culture. Different lowercase letters (ab) indicate significant differences among media within the same day (1 or 5) and treatment (fresh or frozen). Different Greek symbols (αβ) indicate differences between treatments (fresh or frozen) within each medium and day of culture.. 96 Capítulo 4 Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4 Histological evaluation of bovine preantral follicles in fresh and cryopreserved ovarian tissue before and after in vitro culture. A: Percentage of morphogically nomal follicles. B: Percentage of growing preantral follicles. C: Follicular diameter. Different uppercase letter (AB) indicate significant difference between days. Different lowercase letter (ab) indicate significant difference among treatments (control, slow freezing and vitrification) Preantral follicles stained to PCNA showing a follicle negative to PCNA (A) with less then 50% of cells stained (B) and more then 50% of cells PCNA positive(c) Relative Bcl2/Bax mrna expression in control, frozen and vitrified ovarian tissue before and after in vitro culture. AB Indicate significant difference before and after culture Quantification of PCNA and RAD51 proteins in bovine ovarian tissue fresh, frozen and vitrified, followed or not by in vitro culture. Representative immunoblots and protein quantification of PCNA (A) and RAD51 (B). The abundance of each protein was calculated in relation to the loading control, β actin (β-actin). Asterisk indicates statistical difference from between groups (P < 0.05).. 120

14 LISTA DE TABELAS Capítulo 2 Table 1 Table 2 Capítulo 3 Representation of the amino acid and vitamin content for the McCoy, M199, and αmem media Progesterone and estradiol levels (mean + SE) at 1 and 5 d of culture, produced by bovine ovarian tissue culture with and without prior vitrification.. 72 Table 1 Table 2 Capítulo 4 Average number of nucleolar organizer regions (NOR) per nucleus of granulosa cells derived from bovine growing preantral follicles from fresh and frozen ovarian tissues that were subjected to in vitro culture.. 94 Percentage of viable preantral follicles from fresh and frozen ovarian tissues that were subjected to in vitro culture for 5 days 95 Table 1 Table 2 Table 3 Table 4 Table 5 Oligonucleotide primers form PPIA, BCL-2 and BAX used in gene expression analysis Percentage of viable preantral follicles in fresh and cryopreserved ovarian tissue before and after in vitro culture 117 Percentage of PCNA staining in fresh or cultured preantral follicles before or after cryopreservation Progesterone and estradiol levels (mean + SE) at 2 or 4 days of in vitro culture Percentage of area occupied by collagen fibers and stromal cell density present on fresh, frozen or vitrified bovine ovarian tissue, before and after in vitro culture

15 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS % C < > ~ ACPs Ag ANOVA Bax Bcl2 BSA cdna CGP CO 2 ecg DCF DCHF-DA DMSO DNA EG FCS g h H 2 O 2 HE HEPPES HMEM IgG IVF M Percentual Graus Celsius Menor Maior Aproximadamente Agentes crioprotetores Prata Análise de variância BCL2-Associated X Protein B-cell lymphoma 2 Bovine serum albumin (albumina sérica bovina) DNA complementar Células germinativas primordiais Gás carbônico Gonadotrofina coriônica equina Dichlorofluorescein 2,7 - dihydrodichlorofluorescein diacetate Dimetilsulfóxido Ácido desoxirribonucleico Etileno glicol Fetal calf serum (soro fetal bovino) Gramas Hora(s) Peróxido de hidrogênio hematoxilina eosina Ácido (N-[2-Hidroximetil] Piperazina-N`-[2-Etanosulfônico]4-(2- hydroxythyl) Meio essencial mínimo tamponado com HEPES Imunoglobulina G In vitro fertilization (fertilização in vitro) Molar

16 McCoy MCM MEIA MEM Min ml mm mm mm 3 MOIFOPA mrna n ng NOR PCNA Pg ph PPIA qpcr RNA ROS RT SD SDS-PAGE TRAs U v/v X α-mem µg µl µm µm 2 Meio McCoy 5A Methylmalonyl-CoA mutase Microparticle enzyme immunoassay Minimum essential medium (meio essencial mínimo) Minutos Microlitros Milímetro Micromolar Milímetro cúbico Manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais RNA mensageiro Número Nanogramas Região organizadora de nucléolos Proliferating cell nuclear antigen Picogramas Potencial hidrogeniônico Peptidylprolyl Isomerase A Quantitative PCR (PCR quantitativa) Ácido ribonucleico Espécies reativa de oxigênio Room temperature (temperature ambiente) Standard deviation (desvio padrão) Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Técnicas de reprodução assistida Unidades Relação volume/volume Vezes (400X) Alfa Minimum essential medium Micrograma Microlitros Micrômetro Micrômetro quadrado

17 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA ORGANIZAÇÃO MORFOLÓGICA OVARIANA E FOLICULAR PRINCÍPIOS BÁSICOS E MÉTODOS DE CRIOPRESERVAÇÃO CRIOPRESERVAÇÃO NA REPRODUÇÃO ASSISTIDA Criopreservação aplicada a folículos pré-antrais DANOS PROVOCADOS PELA CRIOPRESERVAÇÃO MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DO TECIDO OVARIANO APÓS CRIOPRESERVAÇÃO JUSTIFICATIVA HIPÓTESE CIENTÍFICAS OBJETIVOS GERAL ESPECÍFICOS CAPÍTULO 1 ARTIGO DE REVISÃO CAPÍTULO 2 ARTIGO CIENTÍFICO I CAPÍTULO 3 ARTIGO CIENTÍFICO II CAPÍTULO 4 ARTIGO CIENTÍFICO III CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

18 16 1 INTRODUÇÃO Técnicas de Reprodução de Assistida (TRAs) têm sido grandes aliadas tanto para o tratamento de infertilidade em humanos, quanto para a multiplicação de animais de grande valor genético. Dentre as TRAs em pleno desenvolvimento podemos citar a Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-Antrais (MOIFOPA). A técnica consiste no resgate dos folículos a fim de que possam ser cultivados in vitro até o completo desenvolvimento e maturação do oócito, visando a fertilização e produção in vitro de embriões. Entretanto, a utilização de milhares desses folículos em uma única manipulação não é prática e compromete drasticamente a viabilidade folicular. Além disso, até o momento, ainda não está estabelecido um sistema de cultivo capaz de promover o completo desenvolvimento de folículos pré-antrais in vitro. Portanto, a criopreservação do córtex ovariano no qual, encontra-se a totalidade de folículos pré-antrais, é considerada uma importante aliada da MOIFOPA, pois permite a flexibilização dessa biotécnica mantendo a viabilidade folicular por tempo indeterminado. A criopreservação pode ser realizada por dois métodos distintos: congelação lenta ou vitrificação. O primeiro método baseia-se na utilização de baixas concentrações de agentes crioprotetores (ACPs) e na redução lenta e gradual da temperatura, porém, pode acarretar severos danos celulares ocasionados pela formação intracelular de gelo e danos osmóticos. Já a vitrificação, utiliza altas taxas de resfriamento, apresenta maior praticidade e rapidez para a sua execução. Porém, tem como desvantagem a utilização de altas concentrações de ACPs, ocasionando uma alta toxicidade ceulular. A criopreservação de tecido ovariano tem sido largamente investigada em humanos (FABBRI et al., 2014; SUZUKI et al., 2015), primatas não humanos (TING et al., 2011, 2013) e diferentes espécies animais como, murinos (LIU et al., 2008; YOUM et al., 2014), ovinos (PINTO et al., 2008; LUNARDI et al., 2012) e caprinos (FAUSTINO et al., 2010; CARVALHO et al., 2011) com resultados bastante animadores. Considerando que cada espécie é única e que possui suas particularidades, é razoável prever que a eficácia dos métodos possuam uma dependência espécie específica. Em bovinos, os estudos ainda são escassos e predominantemente com congelação lenta. Ademais, considerando os avanços nos protocolos de vitrificação já obtidos em outras espécies, é possível que este método possa ser mais adequado ao tecido ovariano bovino.

19 17 A associação entre a criopreservação e o cultivo in vitro de folículos pré-antrais, traz uma grande perspectiva para a reprodução e preservação do material genético de animais de grande valor econômico e comercial, como os bovinos, ou mesmo de raças bovinas ameaçadas de extinção. Estudos avaliando o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais comumente revelam menor potencial de desenvolvimento dos folículos criopreservados quando comparado aos folículos não criopreservados. Vale ressaltar, no entanto, que a maioria dos sistemas de cultivo in vitro disponíveis atualmente foram desenvolvidos para folículos não criopreservados e podem não ser suficientes para atender as necessidades de folículos oriundos de tecidos criopreservados. Com o intuito de esclarecer as razões e a contribuição científica desta tese, a revisão de literatura a seguir apresenta de forma sucinta a organização morfológica ovariana e folicular, princípio básico e métodos de criopreservação, o emprego da criopreservação na reprodução assistida, dando destaque a criopreservação de folículos pré-antrais, e por fim os danos provocados pela biotécnica.

20 18 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ORGANIZAÇÃO MORFOLÓGICA OVARIANA E FOLICULAR O desenvolvimento e estabelecimentos da organização básica das gônadas femininas em mamíferos ocorre durante a vida fetal, com exceção dos roedores, nos quais a formação de folículos ovarianos é verificada até um curto período de tempo após o nascimento (FORTUNE, 1994). Os ovários se desenvolvem a partir de um espessamento do epitélio celomático que reveste a cavidade corporal na superfície ventromedial do mesonefro. Contudo, as células germinativas primordiais (CGP) que dão origem aos gametas, são originadas no epiblasto proximal, adjacente ao ectoderma extra embrionário. As CGP migram para as cristas genitais, onde diferenciam-se em oogônias e se multiplicam formando agregados celulares circundados por células somáticas provenientes do mesonefro. Posteriormente as ovogônias iniciam a meiose, originando os oócitos I, e segregam da massa celular sendo acompanhada por células somáticas, originado desta forma os folículos primordiais (DUDEK; FIX, 2005). Os ovários dos mamíferos contêm o suprimento de células germinativas para produzir as próximas gerações (função exócrina ou gametogênica), além de controlar alguns aspectos do desenvolvimento e fisiologia da fêmea, como a produção de esteróides sexuais - esteroidogênese (EDSON et al., 2009). Na maioria das espécies, histologicamente, são observadas duas regiões, uma interna (medular) e uma região externa, denominada cortical. A região medular é constituída por tecido fribroelástico distribuído de forma irregular, algumas células musculares lisas, feixes nervosos, vasos linfáticos e sanguíneos que adentram o córtex ovariano e são responsáveis pela nutrição e sustentação do ovário (HAFEZ; HAFEZ, 2004). A região cortical contém inúmeros folículos ovarianos em diferentes estádios de desenvolvimento, corpos hemorrágicos, lúteos, albicans e uma população de células mesenquimais pouco diferenciadas, muito semelhantes às células mesenquimatosas embrionárias, que podem sofrer grandes e complexas modificações durante a vida reprodutiva. Estas últimas se diferenciam em células da teca interna e externa e são de fundamental importância na esteroidogênese (Figura 1).

21 19 Figura 1. Representação esquemática da estrutura ovariana. Adaptado de Os folículos ovarianos representam a unidade morfológica e funcional do ovário e é constituído basicamente por um oócito parado na prófase I da meiose, circundado por células foliculares (granulosa) e demarcado por uma membrana basal que os separa do estroma ovariano (FORTUNE, 1994). A principal função do folículo é propiciar um ambiente adequado e ideal para o crescimento e maturação do oócito (GORDON, 1994). Os folículos são divididos de acordo com suas características morfológicas em folículos pré-antrais e antrais (GONÇALVES et al., 2002). Os folículos pré-antrais são caracterizados pela ausência de cavidade antral e podem ser ainda subclassificados em primordiais, primários e secundários de acordo com o estádio de desenvolvimento. Os folículos primordiais, que se encontram em um estágio de quiescência (CORTVRINDT; SMITZ, 2001), são considerados reservatórios de gametas femininos (QU et al., 2000) e são caracterizados pela presença de uma camada de células da granulosa em formato pavimentoso. Já os primários e secundários são considerados folículos em estágios iniciais de crescimento e, são caracterizados pela presença do oócito circundado por uma ou mais camadas de células de granulosa de formato cúbico, respectivamente (FIGUEIREDO et al., 2008). Por outro lado, os folículos que apresentam uma cavidade repleta de líquido folicular, denominada antro, são denominados folículos antrais, sendo subdivididos em folículos terciários e pré-ovulatórios (Figura 2). Em ambos os casos, os folículos possuem um oócito circundado pela zona pelúcida, células foliculares, uma cavidade contendo líquido folicular, membrana basal e as

22 20 camadas de células da teca interna e externa. Especificamente, os folículos pré-ovulatórios apresentam uma ampla cavidade antral e um oócito apto a retomar a meiose, ou seja, passar do estádio de prófase I para metáfase II (BARNETT et al., 2006). Figura 2. Representação esquemática da classificação folicular ao longo da foliculogênese. De acordo com a literatura, cerca de 90% dos folículos ovarianos encontram-se na fase de folículos pré-antrais, sendo ainda 95% destes representados por folículos primordiais (SAUMANDE, 1991). Os folículos antrais, por sua vez, representam apenas aproximadamente 10% de toda a população folicular do ovário, e são extremamente susceptíveis à morte folicular (FIGUEIREDO et al., 1995). De maneira geral, em humanos e na grande maioria das espécies domésticas, é possível encontrar já ao nascimento, a presença de folículos em estádios iniciais de desenvolvimento (primário e secundário), porém, devido à não funcionalidade do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal, não progridem para estádios mais avançados antes da puberdade (BETTERIDGE et al., 1989). Apesar da controvérsia acerca da formação de novos folículos, sabe-se que o número total de folículos por ovário varia entre espécies, sendo estimado em aproximadamente em camundongos (SHAW et al., 2000); na ovelha (AMORIM et al., 2000); aproximadamente na mulher (ERICKSON et al., 1986) e folículos pré-antrais na cabra (LUCCI et al., 1999). Em bovinos foi demonstrado ser possível isolar de apenas um par de ovário, mais de folículos pré-antrais (BASSO; ESPER, 2002). Além da espécie, a população de folículos pode variar também em função de fatores como raça, genética (SMITH et al., 1993), idade (ROY; TREACY, 1993) e estado reprodutivo do animal (ERICKSON et al., 1986). Considerando a

23 21 abundância de folículos pré-antrais presentes no ovário, aliada às características intrínsecas que favorecem à criotolerância, como baixa taxa metabólica, tamanho reduzido e ausência de zona pelúcida, a criopreservação de oócitos nesta fase representa uma alternativa promissora para a preservação de gametas femininos (AMORIM et al., 2003). 2.2 PRINCÍPIOS BÁSICOS E MÉTODOS DE CRIOPRESERVAÇÃO A criopreservação consiste na preservação do material biológico, por tempo indefinido, em temperatura criogênica ou ultrabaixa (comumente a -196 C em nitrogênio líquido), para que quando se faça necessário ou desejado este material possa ser descongelado e retomar seu desenvolvimento normal (RUBINSKY, 2003; PEGG, 2007). Na temperatura criogênica acredita-se que todas as reações químicas, processos biológicos, bem como as atividades intra e extracelulares estejam suspensas. Portanto, teoricamente, uma célula ou tecido podem ser mantidos criopreservados indefinidamente (SHEIKHI et al., 2011). Porém, para que não haja danos letais às células, é necessária a utilização de compostos orgânicos, os ACPs na composição da solução de criopreservação, a fim de proteger as células dos danos provocados pela redução da temperatura fisiológica para a criogênica e, subsequente aquecimento. Contudo, a concentração e tempo de exposição de um material biológico aos ACPs variam de acordo com o método de criopreservação empregado, assim como o tipo de célula ou tecido, bem como a espécie, fonte do material biológico. A criopreservação pode ser realizada através de dois métodos distintos: congelação lenta ou vitrificação. Estes dois métodos divergem entre em si, principalmente, quanto à taxa de redução de temperatura empregada. A congelação lenta é caracterizada por uma redução gradual da temperatura, com o objetivo de reduzir o estresse térmico na fase de transição das soluções do estado líquido para o estado sólido (SANCHES, 2009) e uso de baixas concentrações de ACPs. Além disso, é caracterizada também por uma desidratação celular gradual que evita ou reduz a formação de cristais de gelo. Na vitrificação os fluidos passam do estado líquido diretamente para um estado sólido amorfo denominado vítreo (YAMAKI et al., 2002). Para que esta transição ocorra é necessária uma alta viscosidade, a qual é obtida pela elevada concentração de ACPs, e rápida redução da temperatura (WOWK, 2010). A congelação lenta é considerada o método convencional de criopreservação e tem sido largamente utilizada para a conservação de tecido

24 22 ovariano em diferentes espécies (CASTRO et al. 2011; FAHEEM et al. 2011). Contudo, atualmente a vitrificação tem se destacado, revelando-se uma alternativa prática e eficiente para a criopreservação de células germinativa isoladas ou inclusas no tecido (SANTOS et al., 2007; ISACHENKO et al., 2009; BANDEIRA et al., 2015; SUZUKI et al., 2015). Independente do método (congelação lenta ou vitrificação), a criopreservação é constituída basicamente por cinco etapas principais: 1) exposição ao ACP; 2) resfriamento; 3) estocagem ou armazenamento em nitrogênio líquido; 4) descongelação ou aquecimento e 5) remoção do ACP (SANTOS et al., 2007). A exposição ao crioprotetor ou período de equilíbrio consiste no tempo necessário para penetração ou perfusão do ACP nas células e/ou tecidos (ELMOAZZEN et al., 2005). Esta etapa é fundamental, pois são os ACP que vão substituir parcialmente a água no interior da célula, ligar-se à moléculas de água estrutural e reduzir o ponto de fusão da solução. Na congelação lenta estas funções são de extrema importância para evitar a formação de cristais de gelo intracelular. Já na vitrificação, os ACP contribuem ainda com o aumento de viscosidade da solução, que é um pré-requisito para obtenção de um estado vítreo. A etapa de resfriamento diverge entre os dois métodos, enquanto na congelação lenta a redução da temperatura é gradual, para propiciar tempo hábil para uma eficiente desidratação celular, o estado vítreo é obtido com o emprego de altas taxas de resfriamento, da ordem de C/ minuto (MAZUR; SEKI, 2011). Ao fim do processo de criopreservação, as amostra são armazenadas comumente em nitrogênio líquido, até o momento de sua descongelação ou aquecimento. No momento em que se faça necessário, ou que se deseje recuperar as células para que elas prossigam seu desenvolvimento normal, a descongelação ou aquecimento é feita de forma suficientemente rápida para impedir a recristalização ou crescimento de microcristais (FRIEDLER et al., 1988), e em seguida é feita a remoção dos ACPs através de uma ou várias lavagem normalmente com concentrações decrescentes de sacarose ou do ACP utilizado para evitar a brusca entrada de água nas células. 2.3 CRIOPRESERVAÇÃO NA REPRODUÇÃO ASSISTIDA A possibilidade de manter células vivas em um estado de animação suspensa, e posteriormente recuperá-las a fim de retomar suas funções normais, torna a criopreservação uma

25 23 biotécina de grande relevância. No que tange especificamente à reprodução, a criopreservação de espermatozoides foi impulsionada após a descoberta da ação crioprotetora do glicerol (POLGE et al., 1949), sendo atualmente amplamente difundida. A criopreservação de embriões e de gametas femininos, seja de oócitos oriundos de folículos antrais ou pré-antrais, embora não seja completamente estabelecida em diversas espécies, tem sido alvo de constantes estudos. Desde a primeira tentativa de criopreservar o tecido ovariano em 1950 visando restaurar a fertilidade de camundongos fêmeas, ovariectomizadas (PARKS; SMITH, 1953), e com o relato de nascimento de animais de laboratório a partir do transplante de ovário criopreservado (PARROT et al., 1960), a criopreservação de oócitos e tecido ovariano tem despertado crescente interesse. Dos anos 60 até a atualidade, conforme mostrada na imagem abaixo (figura 3), pode-se observar um crescente aumento na publicação de artigos científicos relacionados à criopreservação de tecido ovariano e oócitos, evidenciando ainda a intensificação nas investigações utilizando protocolos de vitrificação

26 24 Figura 3. Número de artigos publicados sobre criopreservação de embriões, oócitos e tecido ovariano (A) e congelação lenta e vitrificação (B) com base nas palavras indexadoras do PUBMED <embryo+cryopreservation> <oocyte+cryopreservation> <ovarian+tissue+cryopreservation> <slow+freezing> <vitrification> Criopreservação aplicada a folículos pré-antrais A conservação do tecido ovariano, e consequentemente dos folículos pré-antrais nele presente, tem atraído o interesse de clínicos e pesquisadores, pois alberga em seu interior o grande potencial oocitário presente no ovário mamífero. Tanto em humanos quanto em animais, o tecido ovariano previamente criopreservado pode ser utilizado em auto e/ou xenotransplante, possibilitando a retomada das funções endócrina e gametogênica (LIU et. al., 2008). Além disso, pode ainda ser destinado ao cultivo in vitro dos folículos pré-antrais isolados (GOSDEN et. al., 2002), pois evita a reintrodução de células malígnas, o que é possível ocorrer após transplante

27 25 (AMORIM et al., 2009), sendo uma crescente preocupação na clínica reprodutiva após o tratamento de doenças oncológicas. O método de congelação lenta tem sido aplicada para preservar folículos pré-antrais de humanos (HERRAIZ et al., 2014), murinos (WANG et al., 2009) e ruminantes domésticos (MAFFEI et al., 2014). Em humanos, há relatos de nascimentos após autotransplante de córtex ovariano previamente congelado em pacientes que superaram o câncer (DONNEZ et al., 2013), incluindo o relato do nascimento de duas crianças saudáveis, de gestações diferentes, oriundas dos mesmos fragmentos transplantados (ERNST et al., 2010), e do nascimento de outra criança cuja paciente era pré-pubere no momento da criopreservação do córtex ovariano (IMBERT et al., 2014). Já com a vitrificação e posterior transplante do tecido ovariano, com auxílio da fertilização in vitro, até o momento há o relato de dois nascimentos em humanos (KAWAMURA et al. 2013; SUZUKI et al., 2015). Em pequenos ruminantes diversos trabalhos já foram desenvolvidos a fim de estabelecer protocolos eficientes, adequando concentrações de agentes crioprotetores e tempos de exposição (PINTO et al., 2008; LUZ et al., 2009; FAUSTINO et al., 2010). Em caprinos a utilização de DMSO e soro fetal bovino na composição da solução de congelação foi capaz de manter a morfologia e ultraestrutura dos folículos pré-antrais mesmo após cultivo in vitro do tecido ovariano (CASTRO et al., 2011). Nesta espécie, já foi demonstrado que fragmentos congelados/descongelados quando autotransplantados foram capaz de retomar as funções endócrina e gametogênica, sendo possível identificar folículos pré-ovulatórios e corpos lúteos, bem como o reestabelecimento dos níveis hormonais após 3 meses do transplante (SANTOS et al., 2009). Em ovinos já foi relatado a obtenção da retomada das funções ovarianas a pós o transplante (GOSDEN et al., 1994; SALLE et al., 2003; BORDES et al., 2005) com o nascimento de crias saudáveis após o transplante de ovários inteiros submetidos a congelação lenta (CAMPBELL et al., 2014), bem como a restauração da função ovariana com gestação e nascimento após o transplante de tecido ovariano imaturo para ovelhas pré-puberes e adultas (SAUVAT et al., 2013). Em bovinos, desde a década de 90 (PAYNTER et al., 1999), utilizando DMSO como agente crioprotetor, demonstraram que é possível congelar fragmentos de tecido ovariano bovino preservando um percentual razoável de folículos morfologicamente normais. Celestino et al.

28 26 (2008) avaliando os crioprotetores, propanodiol, etilenoglicol, DMSO e glicerol para a congelação lenta de fragmentos de tecido ovariano bovino, indicaram que etilenoglicol e DMSO, na concentração de 1,5 M, foram mais eficientes. Em um estudo conduzido para avaliar o efeito da exposição aos ACP e vitrificação de tecido ovariano bovino, suíno e humano, foi demonstrado que os folículos pré-antrais bovinos apresentam comportamento similar aos folículos humanos, quando expostos a diferentes crioprotetores, sendo portando um bom modelo animal para humanos (GANDOLFI et al., 2006). Kagawa et al. (2009) relataram o autotransplante de tecido vitrificado para quatro vacas, em que foi observado a retomada das funções ovarianas com dois estros consecutivos dois meses pós-transplante, posterior à administração de ecg. Apesar dos diversos estudos com ambos os métodos de criopreservação, não há um consenso sobre a eficiência dos mesmos quando comparados entre si. Enquanto alguns estudos demonstram equivalência entre a congelação lenta e a vitrificação em termos de preservação da morfologia folicular, ultraestrutura e produção hormonal in vitro (KEROS et al., 2009), existem trabalhos que sugerem que a congelação lenta seria mais eficiente (AERTS et al., 2008; ISACHENKO et al., 2009), enquanto outros indicam a vitrificação como método de escolha (TING et al., 2011). No entanto, independente do método de criopreservação utilizado, há a possibilidade de ocorrerem danos celulares letais ou subletais. 2.4 DANOS PROVOCADOS PELA CRIOPRESERVAÇÃO. O procedimento de criopreservação ainda é apontado como uma técnica potencialmente prejudicial às células, podendo lesar diferentes estruturas celulares, como por exemplo, a membrana (OLDENHOF et al., 2013), as organelas celulares (GUALTIERI et al., 2011; LEI et al. 2014) e o núcleo (MARTINO et al., 2013). O conhecimento e a caracterização desses danos são de grande relevância para a criobiologia. Uma vez identificado os tipos de lesões provocadas pelo processo, convém buscar alternativas para minimiza-las, quer seja produzindo estruturas mais resistentes ao procedimento, ajustando os protocolos de criopreservação propriamente dito, e/ou adequando os sistemas de cultivo para atender às necessidades específicas de células criopreservadas.

29 27 Por ser a primeira barreira celular E responsável pelo fluxo (efluxo/influxo) de água e ACPs, acredita-se que a membrana plasmática seja também a primeira estrutura a sofrer os efeitos deletérios causados pela criopreservação. Além da possibilidade de perda de porções da membrana celular como resultado da interação da bicamada lipídica em função da retração que ocorre durante o processo de desidratação celular (CARVALHO et al., 2012), a própria característica lipofílica da membrana, a torna mais susceptível aos danos provocados pela redução da temperatura (MELVILLE et al., 2012) Contudo, não somente a membrana plasmática é afetada pela criopreservação, alterações nas membranas de organelas como mitocôndrias (JONES et al., 2004) e retículo endoplasmático (LOWTHER et al., 2009), bem como na carioteca (CASTRO et al., 2011) já foram descritas. Dentre as organelas que podem sofrer danos durante a criopreservação, as mitocôndrias têm sido bastante investigadas por ser a provedora de energia para a célula. Estudos têm observado uma redução na função (DALCIN et al., 2013; LEI et al., 2014) e alteração no padrão de distribuição das mitocôndrias em células criopreservadas (MARTINO et al., 2013; HENDRIKS et al., 2014). Apesar de indispensável para garantir o sucesso dos protocolos de criopreservação, os ACPs podem apresentar efeitos tóxicos, prejudicando as funções celulares. A toxicidade dos ACPs é decorrente da ação de metabólitos secundários, como por exemplo a formação de oxalatalo com a metabolização do etilenoglicol e o lactato proveniente do propanodiol (CASTRO et al., 2011). Além da toxicidade, os danos celulares podem ser decorrentes também do chamado efeito solução, que compreende a exposição aos efeitos nocivos da concentração elevada dos eletrólitos celulares, e inclui alterações de ph, aumento na concentração e precipitação de solutos resultando em alterações no citoplasma, causando injúrias nas proteínas celulares (JAIN; PAULSON, 2006). Considerando que, como qualquer outra proteína, as histonas e demais proteínas responsáveis pela estabilidade da cromatina são susceptíveis ao estresse provocado pela criopreservação, podendo expor o DNA às ações nocivas de radicais livres e de endonucleases (KOPEIKA et al., 2014), é possível a ocorrência de lesões de DNA significativas. Contudo, a manutenção da integridade genômica ainda é pouco avaliada em folículos pré-antrais criopreservados. De maneira geral, todas as células possuem mecanismos específicos contra agressões e condições estressantes. Um dos mecanismos mais conservados, ativado em resposta a diversos

30 28 tipos de estresse, compreende as proteínas de choque térmico (Heat shock protein Hsp). Os níveis de Hsp são aumentados em situações de estresses,auxiliando na síntese e maturação de novas proteínas que irão substituir aquelas afetadas pelo estresse metabólico, bem como também fornecem subsídio às células para identificar e facilitar o redobramento de proteínas danificadas ou destiná-las a um sistema proteolítico adequado, facilitando a eliminação de proteínas cujos danos não são passíveis de restauração. Há relato que o primeiro gene desse mecanismo, a ser expresso em resposta a diversos fatores estressantes é o que codifica as proteínas da família Hsp70 (MUKHOPADHYAY et al., 2003), cujos maiores detalhes a cerca da estrutura e função, estão disponíveis no capitulo I desta tese. 2.5 MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DO TECIDO OVARIANO APÓS CRIOPRESERVAÇÃO Comumente, os resultados do processo de criopreservação têm sido avaliados através da manutenção da morfologia folicular (CASTRO et al., 2011; YOUM et al., 2014) e do próprio estroma (MARSELLA et al., 2008; BANDEIRA et al., 2015), viabilidade (CASTRO et al., 2011; CARVALHO et al., 2014), proliferação celular (BANDEIRA et al., 2015), capacidade de desenvolvimento e restauração das atividades metabólicas (BALABAN et al., 2008; CASTRO et al., 2014; KLOCKE et al., 2015), imediatamente após a descongelação ou após períodos de incubação. Estes parâmetros podem ser avaliados, por estudos morfológicos, comumente empregando histologia clássica, testes de viabilidade, por meio de corantes vitais e/ou marcadores fluorescentes, bem como através da observação do desenvolvimento folicular após cultivo in vitro. A histologia clássica permite a observação de alterações estruturais relacionadas à disfunção e morte celular, como picnose, retração citoplasmática do oócito, destacamento da membrana basal, desorganização das células da granulosa. Contudo, os estudos morfológicos realizados imediatamente após a descongelação podem não ser indicadores suficientes da eficácia do procedimento de criopreservação, uma vez que a morfologia nem sempre está relacionada com a competência de desenvolvimento folicular (SANTOS et al., 2007). Dentre os métodos de análise de viabilidade, comumente são utilizados marcadores fluorescentes, como calceína-am e Etídio Homodimero-1, e testes de integridade de membrana como o teste de com azul de tripan.

31 29 A eficiência de ambos os métodos são equivalentes (MERDASSI et al., 2011). Contudo, o azul de tripan apresenta as vantagens de ser mais prático, rápido e de baixo custo. Além da análise da morfologia folicular os cortes histológicos permitem avaliar também o estroma ovariano. O estroma contém uma séries de componentes que proporciona um microambiente adequado para o crescimento celular. Especificamente nos ovários, o estro é essencial para manter as interações celulares, necessária para a formação e desenvolvimento folicular (WOODRUFF;SHEA, 2007). Trabalhos tem utilizado a histologia para quantificar e verificar a densidade de células estromais (FAUSTINO et al., 2010; MAFFEI et al., 2013). Além das células, a matriz extracelular também tem sido investigada em função do importante papel na manutenção do contato celular e integridade estrutural do folicular. Recentemente, nossa equipe relatou o efeito de duas técnicas distintas de vitrificação sobre as fibras colágenas, através da coloração por Picrosírus (BANDEIRA et al., 2015). Está técnica baseia-se na utilização do corante sirus red, que tem afinidade pelo colágeno e quando visualizado sob luz polarizada apresenta coloração avermelhada. Logo após a criopreservação podem ocorrer alterações moleculares que se manifestam com a retomada do metabolismo e desenvolvimento folicular (SIEBZEHNRÜBL et al., 2000). Para evidenciar estas possíveis alterações, diversos estudos tem destacado o cultivo in vitro como uma ferramenta valiosa para verificar a capacidade de desenvolvimento de folículos pré-antrais previamente criopreservados (CECCONI et al., 2004; TSURIBE et al., 2009; BORGES et al., 2009; FAUSTINO et al., 2010). Com o cultivo in vitro é possível avaliar a capacidade de proliferação celular e a funcionalidade celular. Técnicas de imunohistoquímica para marcadores de proliferação celular, como a proteína PCNA tem sido comumente empregadas em folículos pré-antrais de diferentes espécies (GOSDEN et al., 2000; SILVA et al., 2004; KLOCKE et al., 2015). Recentemente, a quantificação das regiões organizadoras de nucléolos após coloração com prata (AgNOR), já bastante utilizadas para células cancerígenas, tem sido utilizada para avaliar a proliferação celular. As regiões organizadoras do nucléolo (NORs) são áreas de DNA nucleolares, contendo genes que codificam o RNA ribossomal e devido a proteínas não histonas associadas à essas regiões, apresentam um alta afinidade por prata. Células em intensa atividade mitótica necessitam produzir ribossomos sufientes para as

32 30 células filha, isso implica em maior transcrição destes genes e consequentemente, um aumento no número de regiões visualizadas (DERENZINI, 2000). No intuito de avaliar a funcionalidade folicular, são realizadas ainda dosagens da quantidade de progesterona e estradiol a partir do meio de cultivo. Recentemente a associação entre as avaliações morfológicas e capacidade de produção hormonal tem sido citada como o método mais acurado para verificar a funcionalidade celular (KLOCKE et al., 2015). No tocante ao cultivo de folículos previamente criopreservados, a quantificação de espécies reativas de oxigênio é uma análise extremamente interessante, uma vez que os a produção de radicais livres e peroxidação lipídica são importantes alterações observadas após a criopreservação (LUZ et al., 2011). O aumento de espécies reativas de oxigênio pode levar à um quadro de estresse oxidativo, que além de provocar lesões em proteínas e lipídios, podem também culminar em lesões na dupla fita de DNA. As células possuem um complexo mecanismo de detecção e reparo de danos de DNA. De maneira geral, as lesões de DNA são dividas em lesão de fita simples (SSB singlestrand breaks) e lesões de fita dupla (DSB double-strand breaks). As SSB são mais comuns e ocorre com maior frequência (CALDECOTT, 2008), porém, as DSB podem comprometer mais severamente, a estabilidade genética (KHANNA; JACKSON, 2001). A cascata de resposta aos danos de DNA envolve a detecção do local da lesão, seguido da amplificação do sinal através de proteínas quinases e a ativação de uma série de efetores que promovem a parada do ciclo celular e reparo do DNA (MAUGERI-SACCA et al., 2012). A investigação da integridade genômica ainda é um aspecto pouco estudado em folículos pré-antrais criopreservados. Contudo, recentemente alguns autores têm empregado técnicas de himunohistoquímica e western blot para detectar e quantificar proteínas envolvidas na cascata de sinalização de dano e reparo de DNA, como por exemplo a H2AX e a RAD51, respectivamente (MAFFEI et al., 2013; CARVALHO et al., 2014; LEE et al., 2015).

33 31 3 JUSTIFICATIVA Uma das razões para o grande interesse na criopreservação de folículos é que, além de representarem a maioria (95%) do capital folicular presente no ovário, os oócitos imaturos inclusos nestes folículos são menos susceptíveis às crioinjúrias. Diversos grupos de pesquisa têm investigado o transplante após a criopreservação de tecido ovariano ovino (GRAZUL-BILSKA et al., 2008; ONIONS et al., 2013), caprino (SANTOS et al., 2009) e humano (DONNEZ et al., 2013; IMBERT et al., 2014). Embora essa prática seja de grande importância na clínica reprodutiva humana, o transplante de tecido ovariano pode resultar na reintrodução de células cancerosas. Além disto, em animais de produção além de menor praticidade, esta técnica também apresenta desvantagens no que diz respeito à viabilidade econômica. Portanto o cultivo in vitro de folículos pré-antrais, representa uma alternativa apropriada, evitando todos estes inconvenientes. A espécie bovina foi escolhida para a realização deste trabalho por duas importantes razões. Primeiro pela grande importância econômica da espécie bovina, especialmente para o Brasil que possui o maior rebanho comercial do mundo, sendo um importante fonte de carne e leite. Com a evolução da bovinocultura e na busca por maiores lucros, as raças nativas, que geralmente são de grande rusticidade mas a produtividade deixa a desejar, tem sido substituída ao longo das décadas por raças de alta produtividade. Como resultado desta substituição, cerca de 25% das raças bovinas mundiais estão ameaçadas de extinção, segundo levantamento da Organização das nações unidas para Agricultura (FAO), como é o caso das raças Pantaneira, Mocho Nacional, Crioulo e Curraleiro no Brasil. Portanto, a criopreservação neste caso, possui papel crucial em programas de preservação genética destas raças. Segundo, porque a espécie é um excelente modelo experimental para humanos. De acordo com a literatura, os ovários bovinos e humanos além de semelhanças morfológicas e fisiológicas, como a duração da foliculogênese e conteúdo de lipídio oocitário (LEDDA et al., 2001; LEESE, 2012), os folículos também comportam-se de forma similar frente à protocolos de resfriamento e exposição a ACPs (GANDOLFI et al., 2006). Desta forma, a identificação de um método de criopreservação eficiente e a adequação dos sistemas de cultivo para folículos bovinos após criopreservação poderá ser de grande valia para o estabelecimento destes procedimentos na espécie humana.

34 32 Dentre os meios utilizados para o cultivo in vitro de tecido ovariano, o αmem tem proporcionado resultados satisfatórios para pequenos ruminantes (LUZ et al., 2012; SILVA et al., 2013). Já para bovinos tem sido relatado o uso tanto do McCoy (GUTIERREZ et al., 2000) quanto M199 para o cultivo de folículos pré-antrais (MCLAUGHLIN et al., 2010). No entanto, é importante ressaltar que a grande maioria dos estudos envolvendo o cultivo in vitro de folículos pré-antrais tem sido realizados com tecido ovariano fresco. Considerando as condições estressantes às quais são submetidos durante os procedimentos de criopreservação, os folículos criopreservados podem apresentar necessidades diferentes daquelas requeridas pelos folículos frescos, quando se trata do desenvolvimento in vitro pós criopreservação. Portanto, o presente trabalho é de grande relevância para a criobiologia, pois contribuirá para a definição de um método de criopreservação de tecido ovariano bovino, bem como auxiliará na elaboração de um meio de cultivo in vitro específico para folículos pré-antrais criopreservados por ambos os métodos.

35 33 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA Folículos pré-antrais inclusos no tecido ovariano fresco ou criopreservado requerem meios de base diferenciados para o cultivo in vitro; O método de criopreservação do tecido ovariano bovino influencia na capacidade de desenvolvimento in vitro dos folículos pré-antrais.

36 34 5 OBJETIVOS 5.1 GERAL Definir um meio de base para o cultivo in vitro de folículos pré-antrais inclusos no tecido ovariano bovino submetido à criopreservação, e comparar os métodos de congelação lenta ou vitrificação. 5.2 ESPECÍFICOS Comparar a eficiência dos métodos de criopreservação (congelação vs vitrificação) para o tecido ovariano bovino; Avaliar a eficiência de três meios de base (αmem, McCoy e TCM 199) para o cultivo in vitro de folículos pré-antrais inclusos no tecido ovariano bovino previamente criopreservado por ambos os métodos; Analisar a morfologia, viabilidade folicular e proliferação das células da granulosa após cultivo in vitro do córtex ovariano previamente criopreservado; Avaliar a produção hormonal (estradiol e progesterona), de folículos pré-antrais cultivados in vitro após congelação lenta ou vitrificação; Comparar os níveis de expressão de RNAm para as proteínas, Bcl-2 e Bax em folículos ovarianos criopreservados e cultivados; Verificar o impacto dos métodos de criopreservação sobre a integridade do estroma ovariano, através da avaliação das fibras colágenas e densidade de células estromais.

37 35 6 CAPÍTULO 1 Proteínas de choque térmico Hsp70: estrutura e atuação em resposta ao estresse celular Heat shock protein Hsp70: structure and action in response to cellular stress Periódico: Acta Veterinaira Brasilica, v. 7, n.4, p , 2013.

38 36 PROTEÍNAS DE CHOQUE TERMICO Hsp 70: ESTRUTURA E ATUAÇÃO EM RESPOSTA AO ESTRESSE CELULAR Heat shock protein Hsp70: structure and action in response to cellular stress RESUMO: Todas as células possuem mecanismos específicos para defender-se das agressões e condições estressantes imposta pelo ambiente. As proteínas de choque térmico (Hsp), além de auxiliar na síntese e dobramento de diversas outras proteínas em condições normais, representam um dos mecanismos mais conservados ativado em respostas a diversos tipos de estresse. Neste contexto, esta revisão aborda aspectos relacionados à descoberta e estrutura das proteínas Hsp, com destaque para a atuação da família Hsp70 na resposta celular ao estresse, interação com as vias apoptóticas, bem como a influência da criopreservação sobre a expressão destas proteínas. Palavras-chave: Apoptose, criopreservação, chaperona ABSTRACT: All cells have specific mechanisms to defend itself from aggression and stressful conditions imposed by the environment. The heat shock proteins (Hsp), besides aiding in the synthesis and folding of several other normally represent one of the most conserved mechanisms activated in response to various types of stress. In this context, this review discusses aspects related to the discovery and structure of Hsp proteins, highlighting the role of Hsp70 in the cellular response to stress, interaction with apoptotic pathways, as well as the influence of cryopreservation on the expression of these proteins. Keyword: Apoptosis, cryopreservation, chaperone

39 37 1. INTRODUÇÃO Os organismos vivos, independente do reino, são constantemente submetidos à diversas situações estressantes e respondem a esses estímulos por meio de alterações no metabolismo celular, ativando seus mecanismos de defesa. A primeira resposta de um organismo a qualquer estresse ambiental acontece bioquimicamente, a qual subjaz todos os efeitos de maior nível organizacional. A resposta ao estresse compreende a atuação de proteínas denominadas proteínas de choque térmico (Hsp Heat Shock Proteins), sendo esta uma das respostas primárias de proteção celular (LINDQUIST; GRAIG, 1988). As Hsp fazem parte da grande família das proteínas conhecidas como chaperonas moleculares, assim chamadas por possuir a capacidade de interagir de forma reversível com outras proteínas, auxiliando na formação, dobramento e transporte trans-membrana (KARP, 2005). Inicialmente as Hsp foram identificadas como proteínas induzidas pelo estresse térmico (RITOSSA, 1962), contudo foi verificado que trata-se não só de um componente crítico de um mecanismo de defesa complexo e altamente conservado, como também desempenha papel fundamental tanto durante a síntese, montagem, dobramento e degradação de proteínas, quanto na preservação da sobrevivência celular sob condições ambientais adversas (GUPTA et al., 2007). Em condições adversas, como por exemplo, o aumento de temperatura, estresse osmótico ou oxidativo, os níveis de Hsp são aumentados, auxiliando, desta forma, a síntese e maturação de novas proteínas que irão substituir aquelas afetadas pelo estresse metabólico (BUKAU; HORWICH, 1998). As Hsp também fornecem subsídio às células para identificar e facilitar o redobramento de proteínas danificadas ou destiná-las a um sistema proteolítico adequado, facilitando a eliminação de proteínas cujos danos não são passíveis de restauração (MEYER; BUKAU, 2005). O aumento de Hsp nas células lesadas, além de auxiliar no reparo de proteínas, apresenta um importante papel na manutenção da viabilidade uma vez que inibe a apoptose. Já foi demonstrado que as Hsp70 interagem diretamente com elementos da via apoptótica, seja ela intrínseca ou extrínseca, inibindo a cascata de eventos que culminam com a morte celular (MOSSER et al., 1997). Dentre os genes da família de resposta ao choque térmico, o HSP70 é um dos genes altamente conservados e o primeiro a ser induzido em resposta a diversos fatores estressantes (MUKHOPADHYAY; SAXENA; CHOWDHURI, 2003). Diante da grande relevância da atuação desta família de proteínas sobre o metabolismo celular, bem como a

40 38 atuação peculiar em condições adversas, o presente trabalho tem por objetivo relatar a estrutura das proteínas Hsp70, e contextualiza sua atuação na resposta ao estresse e influência na apoptose, a qual é uma forma de morte celular extremamente comum e indispensável para o desenvolvimento apropriado e para a homeostase do tecido em todos os organismos multicelulares. 2. DESENVOLVIMENTO 2.1 Descoberta das proteínas de choque térmico Na década de 60 em um estudo com glândulas salivares de Drosophila melanogaster, foi demonstrado que o estresse térmico ou químico induzia a expressão de genes quiescentes, levando a célula estressada a produzir uma grande quantidade de uma determinada classe de proteínas com peso molecular de 70 kd (RITOSSA, 1962). Doze anos depois Tissiere, Mitchell e Trancy (1974), utilizando o mesmo tipo celular para o estudo do estresse térmico, avaliaram a relação entre a síntese protéica e a presença de puffs comossômico, que representam regiões do cromossomo em que há ativação gênica com intensa produção de RNA. Estes autores também encontraram um elevado nível das mesmas proteínas específicas relatadas por Ritossa (1962) e denominaram-nas de Heat Shock Proteins (Hsp), ou proteínas do choque térmico. Posteriormente, verificou-se que o aumento da síntese de Hsp70 não ocorre unicamente em função do aumento de temperatura, podendo estar relacionada também à resposta a isquemia, presença de metais pesados (SOMERO, 1995); tolerância à endotoxina (CHI; MESTRIL, 1996) e à radiação ultravioleta (SIMON et al., 1995); tumorigenicidade (JAATTELA, 1995); proliferação celular (FEDER et al., 1992); resistência à apoptose (WYATT; MAILHOS; LACCHMAN, 1996); processos patológicos como infecções virais, bacterianas e parasitárias, bem como doenças auto-imunes e venenos metabólicos, que de alguma forma resultem no comprometimento da função das proteínas (WELCH, 1992). No entanto, apesar de diversos fatores induzirem o aumento de Hsp70, a distribuição intracelular desta proteína é diferente dependendo do tipo de estresse. Essa translocação diferencial em resposta a cada tipo de agressão sofrida sugere uma distinção na atuação da Hsp70 frente às diversas condições estressantes (DASTOOR ; DREUER, 2000).

41 39 As Hsp são encontradas desde seres procariotos (bactérias e Archaea) até os eucariotos (desde leveduras até primatas), sendo um indício da vital importância biológica desta classe proteica. Seu alto grau de conservação sugere o desempenho de um papel essencial no processo celular (KREGEL, 2002), uma vez que proteínas envolvidas em processos metabólicos vitais geralmente apresentam poucas mutações ao longo da evolução das espécies (HARTL, 2007). As Hsp podem ser agrupadas em seis famílias: pequenas Hsp, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90 e Hsp100, de acordo com suas sequências de aminoácidos e com seus pesos moleculares (em kd), determinados pelo método SDS-PAGE (FULLER et al., 1994). Em cada família há diferentes proteínas, como por exemplo, Hsp72 e Hsp73 no grupo Hsp70, que apesar de possuírem pesos moleculares similares, tem padrões de indução e expressão distintos. A família Hsp70 é a mais conservada filogeneticamente, sendo de fundamental importância para o dobramento de proteínas nas células (WYNN et al., 1994). Além disso, é conhecida como a proteína com maior atuação em resposta ao estresse celular, sendo utilizada em muitos estudos como indicadora de estresse (TIRELLI et al., 2005; STINSHOFF et al., 2009; TARUTHUM et al., 2010; COLE; MEYERS, 2011; MONZO et al., 2012). 2.2 Família das proteínas Hsp70 As Hsp70 compõem uma grande família de proteínas comumente associadas ao início e duração da tolerância à temperatura. Essas proteínas atuam na montagem, transporte e regulação da atividade de proteínas através de sua interação com os segmentos peptídicos hidrofóbicos das proteínas num processo regulado por ATP (MEYER; BUKAU, 2005). Os quatro principais representantes da família Hsp70 são: i) Hsp72; ii) Hsp73; iii) Grp 78 kd e iv) Grp 75 kd. A Hsp73 é expressa constitutivamente em todas as células e está presente tanto no núcleo como no citoplasma celular (BECKMANN; MIZZEN; WELCH, 1990). Já a Hsp72 é o principal membro da família expresso em resposta ao estresse, sendo verificado um aumento significativo dos seus níveis até seis horas após a exposição ao fator estressante (OGATA et al., 2008). A Grp 78 kd (proteínas reguladas por glicose), também denominada de BiP (Binding immunoglobulin protein) ou HSPA5, localiza-se no lúmen do retículo endoplasmático, desempenhando papel fundamental na translocação proteica. Por outro lado, a Grp 75 kd

42 40 (HSPA9 ou PBP74) é encontrada no interior das mitocôndrias e além de atuar na resposta ao estresse, participa em outros processos celulares importantes como o controle de diferenciação celular, proliferação e tumorigênese (WADHWA; TAIRA; KAUL, 2002). Outros membros da família Hsp70 já foram identificados e investigados. O Mortalin (Mortalin/mthsp70/PBP74/Grp75), um membro da família Hsp70, foi identificado pela primeira vez na fração citoplasmática de fibroblastos normais de camundongos CD1-ICR (WADHWA et al., 1993) e posteriormente indicado sua localização prioritária em mitocôndrias e no retículo endoplasmático (RAN et al., 2000). Embora os aspectos funcionais da mortalin ainda não sejam elucidados, essa proteína parece desempenhar um papel central na regulação do ciclo celular, além de atuar na tumorigênese por interação com a proteína p53, influenciando sua translocação celular (Yi et al., 2008). Recentemente, foi demonstrado em peixe zebra que a HspA12B, um membro distante da família Hsp70 que possui um domino ATPase atípico (HAN et al., 2003), desempenha um papel crucial no desenvolvimento de células endoteliais e na angiogênese in vivo e in vitro, influenciando os níveis de fosforilação da proteína quinase B (Akt), um dos eventos chave na transdução de diversos sinais angiogênicos (HU et al., 2006) Estrutura geral A Hsp70 é composta por um domínio ATPase e um domínio de ligação ao substrato (figura 1). O domínio de ligação ao substrato de 25 kd (SBD) localiza-se na região C-terminal, cujo acesso ao substrato é controlado por uma tampa C-terminal que expõe o sítio de ligação aos peptídeos. Através de uma ligação hidrofóbica flexível o domínio SBD é unido ao domínio N-terminal com atividade ATPase (NBD) (KAMPINGA; CRAIG, 2010). O estado do nucleotídeo (ATP ou ADP) ligado ao domínio NBD estão associados com a afinidade de ligação do domínio SBD, desta forma, a regulação alostérica deste sítio, bem como a interação com proteínas auxiliares (cochaperonas) e fatores de troca de nucleotídeos (NEF) dependem da conformação do sítio NBD (JIANG et al., 2007; VOS et al., 2008). No entanto, estudos mais recentes avaliando a estrutura do NBD de diversos membros da família Hsp70 demonstraram que este domínio é altamente conservado e que tem pouca contribuição na especificidade das proteínas, sendo este papel desempenhado pelo sítio SBD e por proteínas acessórias (WISNIEWSKA et al., 2010)

43 41 Figura 1 - Estrutura da Hsp70 com domínio de ligação ao substrato (SDB) e domínio ATPase (NBD) ligados por uma sequência hidrofóbica (KAMPINGA; CRAIG, 2010) O domínio SBD é responsável pela ligação ao substrato, também denominado de proteína cliente, portanto interagindo de forma reversível com outras proteínas ou cadeias polipeptídicas recém sintetizadas. Dessa forma, as Hsp em células submetidas à condições adversas evitam que proteínas desnaturadas formem agregados citoplasmáticos que ponham em risco a integridade estrutural da célula; guiando à renaturação de proteínas e, quando isso não for impossível, conduzindo as proteínas desnaturadas à degradação pelos proteossomos. Além disto, esta capacidade de interação com outras proteínas permite que as Hsp inibam diretamente a atividade de mediadores da via apoptótica, tanto intrínseca quanto extrínseca, prevenindo o desencadeamento da apoptose (BEERE et al., 2000) 2.3 Mecanismo de ativação gênica para produção de Hsp70 As proteínas Hsp70 são codificadas por uma família multigênica altamente conservada. Em plantas, cerca de 12 a 14 genes codificam proteínas Hsp70, cujo sequenciamento demonstra haver quatro subgrupos com distribuição intracelular distinta: citosol, retículo endoplasmático, plastos e mitocôndrias (SUNG; VIERLING; GUY, 2001). Com o sequenciamento do genoma humano, verificou-se a existência de 47 sequências de Hsp70 (BROCCHIERI; MACARIO; MACARIO, 2008) nesta espécie. Porém 30 destas sequências são ditas como pseudogenes, ou seja, não resultam na produção de proteínas. Portanto, pelo menos 17

44 42 genes distintos localizados em vários cromossomos são traduzidos nas diversas isoformas destas proteínas (KABANI; MARTINEAU, 2008). Acredita-se que nas demais espécies, embora não haja um levantamento exato da quantidade, também estejam presentes diversos genes codantes ou codificantes em vários cromossomos. A ativação dos genes codificantes das Hsp requer um controle por parte de proteínas transregulatórias denominadas fator de choque térmico (Hsf), cuja ativação e translocação é responsável pelo reconhecimento do elemento de choque térmico (Hse). O Hsf está presente normalmente na célula na forma de um monômero inativo. Em resposta ao acumulo de proteínas incorretamente dobradas em função de algum tipo de estresse, ocorre uma rápida trimerização dos monômeros Hsf (SANTORO, 2000). Esse trímero formado é translocado para o núcleo, onde é capaz de reconhecer e ligar-se imediatamente a uma sequência de nucleotídeos específica, o Hse, que está localizada na região promotora dos genes que codificam as Hsp, resultando desta forma, num alto nível de transcrição dos genes do choque térmico (figura 2). A estrutura da Hsf foi elucidada por cristalografia, primeiramente no fungo Kluyveromyces lactis (DAMBERG et al., 1994). Atualmente, já são conhecidas pelo menos cinco isoformas da Hsf, contudo, estudos demonstraram que a atuação destas Hsf se dá por meio de alguns elementos funcionais, que são conservados na sequência proteica independente da isoforma (HUBL; OWENS. NELSON, 1994; TORRES; BONNER, 1995). Dentre estes elementos podemos destacar o domínio de ligação ao DNA (DBD do inglês DNA binding) com cerca de 90 resíduos e responsável pelo reconhecimento de uma sequência específica de nucleotídeos (Hse) na região promotora do gene HSP70 (NIETO-SOTELO et al., 1990), a região regulatória (RR), que promove a trimerização do Hsf (BONNER; HEYWARD; FACKENTAL, 1992) e a região amino-terminal AR1, responsável pela ativação transcricional de genes que possuem o Hse (BULMAN; HUBL; NELSON, 2001).

45 43 Figura 2- Representação esquemática do mecanismo de ativação gênica Hsf-Hse. Diversos fatores como estresse osmótico, oxidativo e exposição à radiação causam desnaturação protéica. As proteínas desnaturadas estimulam a trimerização do Hsf, que uma vez ativo liga-se ao Hse na região promotora do gene HSP70 e induz a produção da proteína Hsp Participação da Hsp70 na resposta ao estresse e na apoptose O elevado nível de Hsp em células submetidas ao estresse, além de orientar o dobramento de proteínas recém sintetizadas, atuam na renaturação de proteínas danificadas (MEYER; BUKAU, 2005). O mecanismo de reparo proteico promovido pela Hsp70 envolve ciclos de dobramento, similar ao que ocorre em cadeias peptídicas recém sintetizadas, sendo imprescindível para o restabelecimento da homeostasia celular. Ademais, a Hsp70 apresenta um importante papel na manutenção da viabilidade uma vez que inibe a apoptose (MOSSER et al., 1997) como mostrado nos tópicos a seguir Reparo de proteínas lesadas

46 44 As proteínas representam o componente mais abundante nas células e mais diversificado quanto à forma e função. Essas macromoléculas como são conhecidas, desempenham as mais variadas funções, como, por exemplo, participam desde a organização estrutural, formando o esqueleto celular, até os processos metabólicos vitais. Nesse contexto, a manutenção e/ou recuperação da estrutura proteica é de suma importância para garantir a sobrevivência celular sob condições adversas. Na resposta ao estresse celular, as Hsp70 influenciam o dobramento de proteínas, orientando a renaturação e prevenindo a agregação proteica por meio da interação com as partes hidrofóbicas expostas da proteína alvo ou cliente. Este mecanismo de dobramento é realizado em ciclos de ligação e liberação do substrato, que são acelerados pela hidrólise do ATP e modulados por co-chaperonas que interagem com Hsp70 e regulam a atividade da ATPase (MOSSER; MORIMOTO, 2004). O mecanismo de atuação da Hsp70 no dobramento de proteínas envolve a cochaperona Hsp40 (também conhecida por proteína J) e o fator de troca de nucleotídeos (NEF) (BUKAU; WEISSAMAN; HORWICH. 2006). Inicialmente, a Hsp40 liga-se ao substrato, em seguida, o complexo Hsp40-substrato interage com o domínio de ligação de peptídeos da Hsp70. Esta interação só é permitida quando o domínio ATPase da Hsp70 encontra-se ligado a uma molécula de ATP. A ligação do substrato em conjunto com Hsp40 estimula a hidrólise do ATP, causando uma alteração conformacional na parte helicoidal ao longo da fenda do sitio de ligação, com consequente dobramento do substrato. A hidrólise do ATP e alteração na estrutura conformacional, reduz a afinidade de ligação com a Hsp40, fazendo com que essa proteínase desligue do complexo. Posteriormente, o NEF liga-se à Hsp70 auxiliando na substituição da molécula de ADP formada por uma molécula de ATP. Após a ligação Hsp70-ATP o substrato é liberado, caso a conformação nativa da proteína não seja alcançada, a Hsp40 religa-se às regiões hidrofóbicas expostas dando inicio a um novo ciclo de dobramento, até que a estrutura proteica esteja completamente recuperada (KAMPINGA; CRAIG, 2010) Interação da Hsp70 com as vias apoptóticas Paradoxalmente, as células acometidas por algum tipo de dano podem seguir em caminhos opostos: respondendo ao estresse amenizando novos danos e facilitando a recuperação com a finalidade de manter a sobrevivência celular, ou sinalizando para a apoptose, uma forma de morte celular programada, que remove as células lesadas sem desencadear um processo

47 45 inflamatório (FERREIRA et al., 2004). A interação entre estas duas vias é determinante para as consequências biológicas do estresse sofrido. O avanço no conhecimento sobre as vias apoptóticas fornece subsídio para examinar como a Hsp70 pode conferir suas propriedades citoprotetoras. Estudos têm demonstrado que o mecanismo de proteção das Hsp vai além da função de chaperonas moleculares, tendo a capacidade de modular a susceptibilidade das células a estímulos nocivos por interação com elementos diretamente envolvidos na via apoptótica (BEERE et al., 2000). O processo de apoptose pode ser desencadeado por duas vias distintas, ou seja, a via intrínseca e a extrínseca. A via intrínseca é caracterizada pelo aumento da permeabilidade da membrana externa das mitocôndrias com consequente liberação de fatores pró-apoptóticos, dentre eles o citocromo c e o fator indutor de apoptose (AIF apoptosis inducing factor) (YANG et al, 1997). Uma vez no citosol, o citocromo c liga-se ao fator ativador da protease apoptótica1(apaf-1). O Apaf-1 ativado recruta e ativa moléculas de pró-caspase 9 (caspase iniciadora), formando um complexo proteico denominado, apoptossoma. O apoptossoma por sua vez, atua clivando a pró-caspase3 (caspase efetora), tornando-a apta a exercer sua atividade proteolítica culminando na apoptose (BEERE, 2004). A via extrínseca por outro lado, é iniciada pela interação de determinados ligantes aos receptores de morte na superfície celular. Estes receptores pertencem à família dos receptores do Fator de Necrose Tumoral (TNF), contendo um domínio citoplasmático (necrose death domain DD) que tem um papel de extrema importância na transmissão do sinal, desencadeando uma série de eventos que resulta na cascata de ativação de enzimas pró-apoptóticas. Dentre estes eventos está o processamento da pró-caspase 8 em sua forma ativa. A caspase 8 ativa atua na clivagem da proteína tbid na forma ativa Bid, esta por sua vez atua sobre a mitocôndria estimulando a liberação de fatores apoptóticos. Além disto, o domínio DD está envolvido na ativação de outras proteínas sinalizadoras como a ASK I e JNK (Figura 3 - BEERE, 2004).

48 46 Figura 3: Representação esquemática das vias apoptóticas extrínseca (linha pontilhada) e intrinseca (linha contínua), demonstrando os diferentes pontos em que a Hsp70 atua para inibir a desencadeamento da apoptose. A super expressão de Hsp70 pode prevenir a apoptose induzida pelo estresse, através da inibição do processamento das pró-caspases 9 e 3 (MOSSER et al., 1997). Estudos mais recentes comprovaram que a super expressão da HSP70 também atua na via apoptótica intrínseca por meio da prevenção da perda do potencial da membrana mitocondrial externa, o que impede a liberação de citocromo c e do AIF a partir da mitocôndria (CREAGH; CARMODY; COTTER, 2000). Já foi comprovado que a Hsp70 atua na via extrínseca da apoptose, inibindo a ativação de moléculas sinalizadoras secundárias como a proteína Bip e a JNK (c-jun NH2-terminal protein kinase), que estão envolvidas na cascata desencadeada pela ativação dos receptores de morte presentes na membrana celular (TOURNIER et al., 2000). Além disto, a Hsp 70 em associação com co-chaperonas Hsp40 pode interferir no balanço de proteínas pró (Bax, Bad, Bid) e anti apoptóticas (Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, A1). Na via intrínseca da apoptose, a proteína apoptótica Bax

49 47 forma poros na membrana mitocondrial externa, permitindo a liberação de elementos (citocromo c, etc) da cascata da apoptose. Comprovadamente, a translocação da proteína apoptótica Bax, para a membrana mitocondrial é inibida pela Hsp70, consequentemente a apoptose é prevenida (GOTOH et al., 2004). A avaliação da morte celular programada em células embrionárias em desenvolvimento revelou que os níveis de Hsp70 estão diretamente correlacionados com a apoptose, sendo acometida prioritariamente células com menores níveis de Hsp70 (DE LA ROSA et al., 1998 ), o que sugere um papel importante desta proteína durante a embriogênese. A promoção da sobrevivência pela Hsp70 tem sido atribuída à sua capacidade de inibir o desencadeamento da apoptose em resposta a vários estímulos, incluindo calor, danos à molécula de DNA e ativação de receptores específicos de morte (BEERE 2004). Embora não seja bem elucidado, é possível que estas proteínas estejam envolvidas na criotolerância ou sobrevivência de células submetidas aos procedimentos de criopreservação. 2.5 Expressão de Hsp70 em gametas criopreservados No sistema reprodutivo, a Hsp 70 é citada como uma das famílias de Hsp mais importantes (NEUER et al., 2000), estando envolvida em processos desde a formação dos gametas até a fertilização, desenvolvimento embrionário e gestação (MARIANI et al., 2000; BERRUTI; MARTEGANI, 2001; MATWEE et al., 2001; BROWNE et al., 2007). Estudos anteriores demonstraram que ocorre um acúmulo de Hsp70 durante a espermatogênese (ALLEN et al., 1988), cuja importância foi comprovada pelo bloqueio do gene HSP70 em camundongos, resultando em falha da meiose, apoptose das células germinativas e infertilidade (DIX et al., 1996). Especificamente, relacionado à criopreservação, os trabalhos encontrados na literatura ainda são escassos e contraditórios. Com base no fato de que o processo de criopreservação representa uma condição estressante para a célula, o esperado seria um aumento das proteínas Hsp70. Essa suposição baseia-se no fato do estresse osmótico promovido pela adição de agente crioprotetor (FAUSTINO et al., 2011), bem como pelo estresse térmico causado pela variação da temperatura e o estresse oxidativo, que promove a peroxidação lipídica (LUZ et al., 2011). Em um estudo recente, comparando-se a motilidade de espermatozóides murinos criopreservados e a expressão de Hsp, foi possível verificar um aumento na quantidade de Hsp70

50 48 fosforilada em resposta ao estresse osmótico decorrente da exposição à solução de criopreservação. Isso demonstra claramente que, no tipo celular estudado, a Hsp70 é ativada na tentativa de reparar os danos provocados pela criopreservação (COLE; MEYERS 2011). Surpreendentemente, de modo contrário ao esperado, Tirelli et al. (2005) relataram uma redução significativa nos níveis de Hsp70 após a criopreservação de células da granulosa isoladas. O baixo nível dessa proteína pode estar correlacionado com um aumento da apoptose desta células verificada após cultivo in vitro por 48 horas. Em oócitos caninos imaturos, Taruthum et al. (2010) ao avaliar a Hsp70 após vitrificação e cultivo in vitro de até 48h, verificaram uma forte expressão desta proteína imediatamente após o aquecimento e um decréscimo com o decorrer do cultivo, equiparando-se aos oocitos não criopreservados ao fim do período de incubação. Estudos mais recentes com embriões bovinos (STINSHOFF et al., 2009) e oócitos humanos em estágio de metáfase II (MONZO et al., 2012), demonstraram através da técnica de micro arranjo de DNA, que independente do método de criopreservação empregado, isto é, congelação lenta ou vitrificação, ocorre uma alteração na expressão de diversos genes envolvidos no metabolismo de proteínas, ciclo celular e crescimento, dentre eles o HSP70, que sofre uma redução significativa na sua expressão. 3. Considerações finais As mudanças no ambiente intra ou extracelular pode ser desencadeada por uma variedade de sinais, incluindo danos ao DNA, resposta aos estresses, térmico, osmótico, e oxidativo, dentre outras injúrias. Esses sinais são interpretados e desencadeiam uma apropriada resposta biológica, coordenados por eventos que envolvem uma série de alterações conformacionais, multimerização e mudanças na localização de proteínas. Todos estes parâmetros são sujeitos à regulação pelas Hsp, que constitui um mecanismo fundamental de proteção celular. Portanto, aprofundamento dos conhecimentos a cerca da Hsp é essencial para que além de utiliza-la como marcador inicial de injúrias, possamos compreender melhor os mecanismos de defesa exercidos pelas células em diferentes condições adversas, como por exemplo, no processo de criopreservação. A criopreservação é um segmento da criobiologia de suma importância para a preservação de material genético e consequente flexibilização de diversas técnicas de reprodução

51 49 assistida, como a fecundação in vitro, transferência embrionária, transferência nuclear e outras. No entanto o procedimento de criopreservação representa uma condição estressante para as células. Desta forma, o entendimento da atuação das Hsp70 pode contribuir nos estudos de criobiologia, visando o estabelecimento de protocolos cada vez mais eficientes e menos agressivos. A elucidação acerca do envolvimento da Hsp70 no processo de criopreservação também traz uma perspectiva de utilização do seu poder de citoprotetor para o aperfeiçoamento de protocolos de manipulação celular in vitro de uma forma geral.

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58 56 7 CAPÍTULO 2 Folículos pré-antrais bovinos frescos e vitrificados tem diferentes requerimentos nutricionais durante o cultivo in vitro. Fresh and vitrified bovine preantral follicles have different nutritional requirements during in vitro culture. Periódico: Cell and Tissue Banking, v. 15, p , 2014.

59 57 RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência de diferentes meios de base no cultivo in vitro de tecido ovariano bovino frescos ou vitrificados. Fragmentos de córtex ovariano foram destinados a vitrificação, análise histológica e de viabilidade ou imediatamente cultivados in vitro utilizando os meios, αmem, McCoy e M199. Amostras dos diferentes meios de cultivo foram coletadas nos dias 1 (D1) e 5 (D5) para quantificação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e pra análise hormonal. No cultivo do tecido ovariano não vitrificado (fresco) o percentual de folículos morfologicamente normais foi significativamente superior aos outros meios quando utilizado o meio M199. Já para o tecido previamente vitrificado o meio McCoy foi significativamente superior aos demais meios na preservação da morfologia folicular até o fim do cultivo (D5), sendo o único a manter o percentual de folículos morfologicamente normais do D1 para D5. Os níveis de ROS foram superiores no D1 de cultivo do tecido vitrificado, porém ao fim de cinco dias não houve diferença no nível encontrado entre os três meios. A dosagem hormonal revelou que ao fim do cultivo de tecido previamente vitrificado houve um aumento de progesterona no cultivo com M199 e aumento de estradiol com meio McCoy em relação aos meios testados. Em conclusão, nossos resultados indicam que o uso do meio M199 seria mais recomendado para tecido fresco e o McCoy para o cultivo de tecido previamente vitrificado. Palavras-chave: Tecido ovariano, vitrificação, M199, McCoy, αmem

60 58 Fresh and vitrified bovine preantral follicles have different nutritional requirements during in vitro culture S. V. Castro*, A. A. Carvalho, C. M. G. Silva, F. W. Santos, C. C. Campello, J. R. Figueiredo, A. P. R. Rodrigues Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles, Faculty of Veterinary, State University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil. * Correspondence should be addressed to: Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA) Universidade Estadual do Ceará (UECE) Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi Fortaleza CE Brasil. CEP: Tel.: ; Fax: address: simone_medvet@hotmail.com (Simone Vieira Castro)

61 59 Abstract The aim of this study was to compare the efficiency of different media for the in vitro culturing of fresh and vitrified bovine ovarian tissues. Fragments of the ovarian cortex were subjected to vitrification and histological and viability analyses or were immediately cultured in vitro using the αmem, McCoy, or M199 medium. Samples of different culture media were collected on days 1 (D1) and 5 (D5) for quantification of reactive oxygen species and for hormonal assays. In nonvitrified (i.e., fresh) ovarian tissue cultures, the percentage of morphologically normal follicles was significantly greater than that recorded for the other media (e.g., M199). In the case of previously vitrified tissues, the McCoy medium was significantly superior to the other media in preserving follicular morphology up until the last culture day (i.e., D5), thus maintaining a similar percentage from D1 to D5. ROS levels were higher in D1 vitrified cultured tissues, but there were no differences in the levels among the 3 media after 5 days. The hormonal assays showed that in the case of previously vitrified tissues, at D5, progesterone levels increased on culture in the M199 medium and estradiol levels increased on culture in the McCoy medium. In conclusion, our results indicate that the use of M199 would be recommended for fresh tissue cultures and of McCoy for vitrified tissue cultures. Keywords: Ovarian tissue, vitrification, M199, McCoy, αmem

62 60 Introduction Vitrification is a cryopreservation method that employs a high concentration of cryoprotective agents and confers high viscosity to the cryoprotectant solution (Rall et al. 1985). When the development of high viscosity is followed by ultra-rapid chilling, it leads to the formation of an amorphous solid without the intracellular formation of ice crystals (Dobrinski et al. 2000; Rubinsky 2003; Chian et al. 2004), thus reducing cell cryodamage. Vitrification has become an effective alternative for the preservation of oocytes and embryos (Smith et al. 2010; Ubaldi et al. 2010) and has proven to be a very attractive method for the cryopreservation of primordial follicles within ovarian tissue (Kagawa et al. 2009; Carvalho et al. 2011). Studies in the last decade have demonstrated the feasibility of vitrification of the ovarian cortex containing preantral follicles. For example, De La Peña et al. (2002) reported obtaining healthy mouse pups after in vitro culturing of previously vitrified preantral follicles, followed by in vitro maturation and fertilization. In livestock production, such as that of ovines, the birth of viable lambs after orthotopic transplantation of previously vitrified ovarian tissue has also been reported (Bordes et al. 2005). Although births have already been achieved with the use of vitrified murine and ovine ovarian tissue (De La Peña et al. 2002; Bordes et al. 2005), which have been widely used for the cryopreservation of oocytes and embryos (Saragusty et al. 2011), the application of vitrification to ovarian tissue is still in the experimental stages because of the complexity of the process of cryopreserving structures with heterogeneous cell types (Camboni et al. 2008). All cells that comprise the tissue are subject to molecular changes that manifest with the resumption of metabolism and follicular development (Siebzehnrübl et al. 2000). In order to highlight these possible changes, several studies have employed in vitro analysis as a tool to verify the developmental capacity of previously cryopreserved preantral follicles (Cecconi et al. 2004; Borges et al. 2009; Tsuribe et al. 2009; Faustino et al. 2010). Some studies have reported that cryopreserved follicles exhibit delay in development and reduction in cell viability (Newton et al. 2001; Segino et al. 2005; Choi et al. 2008), indicating that fresh follicles (i.e., not cryopreserved) and cryopreserved follicles require differentiated in vitro culture conditions, especially with regard to the nutrients and supplements present in the culture medium necessary for in vitro growth and development.

63 61 Studies aiming to develop an effective culture system for in vitro follicular development have used preantral follicles obtained from non-cryopreserved tissue and have primarily employed alfa minimum essential medium (αmem), McCoy s 5A medium (McCoy), or medium 199 (M199) as the culture medium. The αmem medium is an enriched version of the MEM and has been successfully used for in vitro cultures of caprine (Saraiva et al. 2010; Barboni et al. 2011) and ovine (Luz et al. 2012, Lima et al. 2013) ovarian tissue. For bovines, the McCoy medium was used for in vitro cultures of isolated secondary follicles for promoting development of the antral stage (Gutierrez et al. 2000; McCaffery et al. 2000; Itoh et al. 2002). Within the same species, there have been reports of the use of M199 as a basal medium, which was able to support the survival and development of primordial follicles enclosed in ovarian tissue and isolated secondary follicles (Saha et al. 2000; McLaughlin et al. 2010; Rossetto et al. 2012). However, to date, there have been no studies on the efficiency of different culture media for in vitro cultures of bovine ovarian tissue, especially after cryopreservation. Therefore, our aim was to compare the efficiency of the αmem, McCoy, and M199 media for the culture of follicles derived from fresh and vitrified bovine ovarian tissue. Materials and methods Source and transport of ovarian tissue Ovaries from adult mixed-breed cows were obtained from a local slaughterhouse. They were washed once in 70% alcohol and twice in HEPES-buffered MEM (HMEM; Sigma, St. Louis, Mo., USA) supplemented with 0.1% (v/v) penicillin/streptomycin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). The ovaries were transported to the laboratory within 1 h of collection in thermos flasks that contained tubes filled with HMEM and were maintained at 20 C. Experimental design At the laboratory, the cortex from each pair of ovaries (n = 5) was removed, avoiding regions of corpus luteum and large antral follicles, and 22 fragments (9 mm 3 ) were obtained and subdivided as follows: (i) 1 fragment (fresh control) was immediately fixed in Carnoy s solution

64 62 for 4 h for histological examination; (ii) 1 fragment was submitted for follicular isolation for a viability test; (iii) 9 fragments were cultured in vitro in the αmem, McCoy, or M199 medium; and (iv) 11 fragments were subjected to solid-surface vitrification. Vitrification and warming Vitrification was performed according to the protocol described for bovine ovaries (Faheen et al. 2011). Briefly, the fragments were initially exposed to cryoprotective agents in a solution composed of HMEM supplemented with 20% fetal calf serum (FCS), 7.5% EG (Dinâmica Química, Diadema, Brazil), and 7.5% dimethyl sulfoxide (DMSO; Dinâmica Química, Diadema, Brazil). After 15 min of equilibration at room temperature (RT), the ovarian cortex was transferred to a vitrification solution consisting of HMEM supplemented with 20% FCS, 15% EG, and 15% DMSO for 5 min. Subsequently, the fragments were transferred to the surface of a metallic cube partially immersed in liquid nitrogen and were transferred to cryotubes and stored in liquid nitrogen after vitrification (for 1 week). For heating, the cryotubes containing the vitrified samples were exposed to room temperature (~25 C) for 20 s and immersed in a water bath at 37 C for 1 min. Then, the cryoprotective agents were removed by 4 successive washes (5 min each) in HMEM medium supplemented with 20% FCS and decreasing concentrations of sucrose (i.e., 1, 0.5, 0.1, and 0 M). After heating, a fragment of the tissue was fixed in Carnoy s solution (vitrified control), another was subjected to follicular isolation and a viability test, and the remaining fragments (n = 9) were cultured in vitro. In vitro culture For the in vitro culture, the cortex tissue samples were transferred to 24-well culture dishes containing 1 ml of the culture medium per well. The culture was performed at 38.5 C in 5% CO 2 in a humidified incubator. Fresh media were incubated for 1 h prior to use, and the culture media were replenished every alternate day. The culture medium consisted of the McCoy, M199, or αmem medium (concentrations of amino acids and vitamins are shown in Table 1) supplemented with glutamine (3 mm), hypoxanthine (2 mm), bovine serum albumin (BSA; 0.1%), insulin (10 ng/ml), transferrin (2.5 g/ml), selenium (4 ng/ml), and ascorbic acid (50

65 63 g/ml). In vitro cultures were performed for 1 (D1) or 5 (D5) d, and the medium was stored for quantification of reactive oxygen species (ROS) and the production of estradiol and progesterone. Histological evaluation of preantral follicles For histological examination, after fixation in Carnoy s solution, the ovarian fragments were dehydrated in ethanol, cleared in xylene, embedded in paraffin wax, and serially sectioned at 7 µm. Every fifth section was mounted onto a glass slide and stained with hematoxylin and eosin (HE). All sections were examined using a light microscope (Nikon, Tokyo, Japan) at a magnification of 400. For each treatment, 30 preantral follicles were analyzed per animal. Only preantral follicles with visible nuclei were counted. Preantral follicles (1 or more layers of granulosa cells and no antral cavity) were classified as morphologically normal if they had intact oocytes and granulosa cells. The follicles were considered degenerated if they contained a pyknotic oocyte nucleus or shrunken ooplasm, with or without disorganized granulosa cells and/or detachment of the basement membrane (Rodrigues et al. 2004). Viability analysis with trypan blue Preantral follicles were isolated from ovarian tissue with the mechanical method described by Figueiredo et al. (1998) with slight modifications. Briefly, samples were cut into small pieces with a tissue chopper (The Mickle Laboratory Engineering Co., Gomshal, Surrey, UK) and adjusted to a sectioning interval of 50 µm. Samples were placed in HMEM supplemented with 3 mg/ml BSA and were suspended 100 times with a large Pasteur pipette (inner diameter, 1600 µm) and 100 times with a smaller Pasteur pipette (inner diameter, 600 µm) to dissociate the preantral follicles from the stroma. The material obtained was then passed through a 200 µm nylon mesh filter. This procedure was performed within 10 min at room temperature (RT). The viability of preantral follicles was assessed by the trypan blue dye exclusion test. Briefly, 5 µl of 0.4% trypan blue (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) was added to 100 µl of isolated and suspended preantral follicles, which were incubated for 1 min at RT. Subsequently, follicles were examined with an inverted microscope (Nikon, Tokyo, Japan) and classified as nonviable or viable if they were positively or negatively stained, respectively, with trypan blue.

66 64 ROS and hormonal levels The ROS levels were determined for the culture media for ovarian tissue by the spectrofluorimetric method, using the 2,7 -dichlorofluorescein diacetate (DCF-D) assay. The medium was incubated with 5 µl of DCF-D (1 mm) and the oxidation of DCF-D to fluorescent dichlorofluorescein (DCF) was measured for ROS detection. The DCF fluorescence intensity emission was recorded at 520 nm (with 480 nm excitation) at 120 min after the addition of DCHF-DA to the medium. The estradiol and progesterone levels were measured for the in vitro cultures on days 1 and 5 with the microparticle enzyme immunoassay (MEIA; Abbott Diagnostics AxSYM System) by using a commercial kit (AxsymProgesterona and Estradiol; Abbott Japan Co. Ltd., Tokyo, Japan). Statistical analysis Data were initially evaluated for homoscedasticity and the normal distribution of the residues with Bartlett s and Shapiro-Wilk tests, respectively, to confirm the requirements for analysis of variance (ANOVA). ANOVA was then carried out according to a factorial arrangement of treatments with reference to the media (αmem, McCoy, or TCM), the procedure (with or without cryopreservation), and the time of culture (1 or 5 d) as the primary variables. The model used was defined as Y ijk = µ + M i + P j + T k + (M i P j ) + (P j T k ) + (M i P j T k ) + e ijk, where Y ijk = dependent variable; µ = general mean; M i = medium; P j = procedure; T k = time of culture; M i P j = interaction between the medium and the procedure; P j T k = interaction between the procedure and time; M i P j T k = interaction among the medium, procedure, and time; and e ijk = residual error. Means were separated by the Student-Newman-Keuls test for significant interactions. Dunnets s test was applied to compare the experimental treatments to the control groups (i.e., fresh or cryopreserved samples). The quantification of ROS data was analyzed by one-way analysis of variance, followed by the post-hoc Duncan s test. For evaluation of viability by trypan blue, the follicles were pooled and analyzed as the dispersion of frequency with a Chi-square test. In all cases, differences were considered to be significant when P < 0.05.

67 65 Table 1. Representation of the amino acid and vitamin content for the McCoy, M199, and αmem media. Components McCoy g/l M199 g/l αmem g/l Amino acids L-Alanine L-Arginine HCl L-Asparagine H2O L-Aspartic Acid L-Cysteine L-Cystine L-Glutamic Acid L-Glutamine Glycine L-Histidine HCl H2O Hydroxy-l-proline L-Isoleucine L-Leucine L-Lysine HCl L-Methionine L-Phenylalanine L-Proline L-Serine L-Threonine L-Tryptophan L-Tyrosine 2Na 2H2O L-Valine Vitamins Ascorbic Acid p-aminobenzoic Acid D-Biotin

68 66 Choline Chloride Folic Acid myo-inositol Niacinamide Nicotinic Acid D-Pantothenic Acid (hemicalcium) Pyridoxal HCl Pyridoxine HCl Riboflavin Thiamine HCl Vitamin B Results Morphological features of vitrified and fresh bovine preantral follicles in culture A total of 2,700 follicles were evaluated by classical histological analysis (Figure 1). Vitrification maintained the percentage of morphologically normal follicles, similar to that observed for the fresh control (Figure 2). However, after maintaining in vitro cultures for 1 or 5 d in all the media tested (αmem, McCoy, or M199), the percentage of preantral follicles with normal morphological features was significantly lower in ovarian tissue (vitrified and nonvitrified) than in the fresh and vitrified controls.

69 67 Fig. 1 Morphological aspects of bovine preantral follicles after 5 d of in vitro culture. Secondary normal follicle in A, arising from frozen tissue cultured with the McCoy medium, and primary follicle degeneration in B, originating from vitrified tissue cultured with α MEM. The figure shows the pyknotic oocyte (white arrow) and cytoplasmic retraction (black arrow) Treatments cultured (without previous vitrification) only on D1 showed no significant differences among the 3 media cultures. The D5 percentage of morphologically normal follicles was significantly higher in vitro when cultured with the M199 medium than with the αmem and McCoy media. Additionally, the M199 medium was also the only medium that maintained a similar percentage of morphologically normal follicles from D1 to D5 for tissues cultured alone and without prior vitrification. In the vitrified group, after in vitro culture, no differences were detected between D1 media but the McCoy medium showed a higher percentage of normal follicles (P < 0.05) than the αmem or M199 media for D5 cultures. In vitro cultures of ovarian tissue previously vitrified in McCoy s medium were the only cultures to maintain the percentage of morphologically normal follicles from D1 to D5 (Figure 2).

70 68 Fig. 2 Percentage of morphologically normal follicles for in vitro cultures of bovine ovarian tissue (fresh or vitrified). FC: fresh control, VC: vitrified control. * Differs to the fresh control; differs from the vitrified control; AB differs significantly among culture media within the same group (cultured or vitrified cultured); ab difference between culture days; α β difference between cultured and vitrified cultures within each in vitro culture medium. There were no significant differences in the percentage of primordial or developing follicles (Figure 3) between the fresh and vitrified controls. The percentage of primordial and developing follicles in the non-vitrified tissues cultured (D1 and D5) with αmem and M199 media was similar to that for the fresh control tissue. In vitro culture in the presence of the McCoy medium resulted in a significant decrease in the percentage of primordial follicles, concomitant with an increase in the percentage of developing follicles on D5, when compared to the fresh control and M199 medium, the results for which did not differ from those for the αmem medium. In previously vitrified tissue cultures, there was a reduction in the percentage of both follicular classes (primordial and development) on D5 when compared to the results for the vitrified control, regardless of the medium used.

71 69 Fig. 3 Percentages (mean + SEM) of primary (A) and growing follicles (B) in non-cultured tissue (fresh control), vitrified tissue (vitrified control), and previously cultured tissue for 5 d (with and without prior vitrification) in the αmem, McCoy, or M199 medium. * Differs to the fresh control; differs significantly when compared to the vitrified control; A B represents a significant difference between media within the same group (cultured or vitrified cultured); and α β indicates differences between treatments (vitrified and non-vitrified) in the culture media.

72 70 Assessment of preantral follicle viability The percentage of viable preantral follicles evaluated immediately after vitrification (vitrified control) did not differ from the fresh control (P > 0.05; Figure 4). Contrary to our observations for the M199 and αmem media, after 5 d of culture without prior vitrification, follicular viability in McCoy s medium remained similar for the fresh and vitrified controls. The percentage of viable follicles found in the medium, in relation to the in vitro cultures of non-vitrified ovarian tissues, was also significantly higher than that for the M199 and αmem media. In the vitrified tissue, after culture, regardless of the medium used all treatments showed a lower percentage of viable follicles when compared to the fresh and vitrified controls. However, the McCoy s medium had a higher percentage of viable follicles compared to the αmem medium. Furthermore, when assessing the effectiveness of the media for vitrified and non-vitrified cultured tissues, the McCoy and M199 media were found to maintain viability in vitrified cultured tissues, which was similar to that for the tissues cultured without vitrification. In the presence of αmem, the percentage of viable follicles after vitrification followed by culture was significantly lower (P < 0.05) than that observed for the follicles cultured without prior vitrification. Fig. 4 Percentage of viable follicles in cultured bovine ovarian tissue on D5, with and without prior vitrification. Different letters indicate statistical differences

73 71 ROS and hormone levels Measurement of ROS from the culture medium of ovarian tissues cultured without prior vitrification showed no significant differences on D1 (Figure 5). After 5 d of culture (D5), the ROS level for McCoy s medium was significantly higher than the level reported for the M199 medium but did not differ from that for the αmem medium. Interestingly, the previously vitrified tissue cultures showed a significant increase in ROS in the αmem medium on D1, when compared to the results for the other media. However, at the end of the 5-d culture period (i.e., on D5), ROS levels were equivalent among all 3 media tested. When the amount of ROS was compared between the vitrified and non-vitrified tissues, the αmem medium showed higher levels of ROS (P < 0.05) on D1 but lower concentrations on D5. In the presence of the M199 medium, vitrified tissue showed an increase in the production of ROS on D1. However, the levels at the end of cultivation (i.e., D5) were similar to the levels reported for the regime that included pre-treatment with and without vitrification. Measurement of steroid hormones by the microparticle enzyme immunoassay showed that, after 5 d of culture, use of the M199 medium led to a significantly lower level of progesterone in the vitrified-culture group than in the nonvitrifies group (Table 2). Similar results were observed for estradiol with McCoy s medium as the basal medium.

74 72 Fig. 5 Quantification of reactive oxygen species in the culture media. AB Represents a significant differs among the media on the same culture day (i.e., days 1 or 5) and analysis condition (i.e., with and without vitrification); ab differences between the days of culture in the same medium and condition analysis; and αβ represents the differences between treatments (with and without vitrification) for each medium and culture day. Table 2. Progesterone and estradiol levels (mean + SE) at 1 and 5 d of culture, produced by bovine ovarian tissue culture with and without prior vitrification. Media Treatment Progesterone (ng/ml) Estradiol (pg/ml) Day 1 Day 5 Day 1 Day 5 αmem No vitrified Aa Aab Ab Bb Vitrified Aα Aα Aα Bα McCoy No vitrified Aa Ab Aa *Ba Vitrified Aα Aα Aα *Bα M199 No vitrified Aa *Aa Ac Aab Vitrified Aα *Aα Aα Bα AB : comparing between days of cultivation. abc : comparison of media within the not vitrified group. αβ : comparison of media within the vitrified group. * Denotes difference between vitrified and no vitrified in the same medium and days of culture.

75 73 Discussion In this study, we evaluated the efficiency of different media, that is, the αmem, McCoy, and M199 media, for in vitro culture of vitrified and non-vitrified bovine ovarian tissues. Our results indicate that preantral follicles within bovine ovarian tissue, when subjected to a vitrification procedure, have different requirements with regard to the basal medium used in vitro when compared to the follicles obtained from non-vitrified tissue. The αmem medium has been successfully used for fresh (i.e., not frozen) in vitro cultures of ovine (Santos et al. 2011; Lima et al. 2013) and caprine preantral follicles (Lima et al. 2012; Rocha et al. 2012), thus allowing for the production of embryos from advanced secondary follicles (Saraiva et al. 2010; Magalhães et al. 2011; Luz et al. 2012). Nevertheless, in this study, it was found that after 5 d of in vitro culture, the αmem medium was less effective in maintaining the survival of preantral follicles cultured in vitro than the McCoy medium in the case of vitrified tissue and less effective than the M199 medium for ovarian tissue without vitrification. For the cultured tissue without prior cryopreservation, the M199 medium showed a percentage of morphologically normal bovine preantral follicles that was greater than that for the other culture media tested. These results are consistent with those of previous studies that reported a higher efficiency of the M199 medium in maintaining cell viability and growth and the stimulation of antrum formation in bovine preantral follicles (Rossetto et al. 2012). To evaluate the morphological features of preantral follicles enclosed in bovine ovarian tissues vitrified and cultured for 5 d in the McCoy medium, there was a higher percentage of normal follicles compared to the αmem and M199 media. Moreover, the efficiency of the McCoy medium in maintaining follicular morphological features after 5 d of culture was associated with higher viability and lower ROS production at the beginning of the culture period when compared to the αmem medium. These results demonstrate that follicular morphological features and viability are negatively influenced by increasing amounts of ROS. Thomson et al. (2009) demonstrated that the generation of high levels of ROS leads to a higher incidence of membrane lipid peroxidation, thus affecting cell viability and function.

76 74 Men et al. (2003) reported that vitrified cells become less tolerant of in vitro culture conditions and more susceptible to cell death, suggesting that cryopreserved and noncryopreserved follicles may have different needs in an in vitro culture system. This hypothesis was confirmed in the present study as the McCoy medium was more efficient for the culture of preantral follicles derived from bovine ovarian tissues that were previously vitrified, while the M199 was more suitable for the non-vitrified tissues. These differences are related to variations in the composition and concentration of several substances present in the culture media (Table 1). The M199 medium, on the whole, had a greater concentration of amino acids than the McCoy medium. The McCoy medium had a higher concentration of vitamins that are involved in several metabolic processes. Vitamins can act in combination with amino acids to prevent disturbances in metabolism and a loss of viability when cells are maintained under suboptimal culture conditions (Lane et al. 1998). The mechanism by which vitamins exert their effects in vitro has been studied but remains unclear. In recent years, studies have proven that the addition of vitamins to the in vitro maturation medium is extremely important for improving embryonic development in goats (Bormann et al. 2003), pigs (Naurse et al. 2007), and sheep (Shabankareh et al. 2012). Moreover, in addition to acting on specific enzymes involved in various metabolic pathways, many vitamins, including vitamins E and C, have important antioxidant activities (Sies et al. 1995). From the vitamins present in the McCoy medium, B12 was absent in the M199 medium and the folic acid concentration was 1000 times higher in the McCoy. Vitamin B12, or cobalamin, acts as a coenzyme of methylmalonyl-coa mutase (MCM), an enzyme participating in the citric acid cycle, which is responsible for the conversion of methylmalonyl-coa to succinyl-coa (Watkins et al. 2013). Furthermore, the enzyme methionine synthase, responsible for the remethylation of homocysteine to methionine, is also B12 dependent (Kanth et al. 2011). Folic acid participates in various processes ranging from purine synthesis to the interconversion of amino acids (Ronderos 2003) and is essential for cellular metabolism. In conclusion, the results show that preantral follicles in vitrified ovarian tissues have different requirements with respect to the basal medium used for in vitro culture conditions when compared to non-vitrified ovarian tissues. Therefore, it is recommended that the McCoy

77 75 medium be used for previously vitrified tissue and that the M199 medium be used for fresh bovine ovarian tissue. References Barboni B, Russo V, Cecconi S, Curini V, Colosimo A, Garofalo MLA, Capacchietti G, Giacinto OD, Marrioli M (2011) In vitro growth sheep preantral follicles yield oocytes with normal nuclear-epigenetic maturation. Plos ONE. 6:e27550 Bordes A, Lornage J, Demirci B, Franck M, Courbiere B, Guerin JF, Salle B (2005) Normal gestations and live births after orthotopic autograft of vitrified warmed hemi-ovaries into ewes. Hum Reprod. 20: Borges EN, Silva RC, Futino DO, Rocha-Junior CM, Amorim CA, Báo SN, Lucci CM, (2009) Cryopreservation of swine ovarian tissue: effect of different cryoprotectants on the structural preservation of preantral follicle oocytes. Cryobiology 59: Bormann CL, Ongeri EM, Krisher RL (2003) The effect of vitamins during maturation of caprine oocytes on subsequent developmental potential in vitro. Theriogenology 59: Camboni A, Martinez-Madrid B, Dolmans MM, Amorim CA, Nottola SA, Donnez J, Langendonckt AV (2008) Preservatin of fertility in Young cancer patients: contribution of trasmission electron microscopy. Reprod Biomed. Online 17: Carvalho AA, Faustino LR, Silva CMG, Castro SV, Luz HKM, Rossetto R, Lopes CAP, Campello CC, Figueiredo JR, Rodrigues APR, Costa APR (2011) Influence of vitrification techniques and solutions on the morphology and survival of preantral follicles after in vitro culture of caprine ovarian tissue. Theriogenology 76: Cecconi S, Capacchietti G, Russo V, Berardinelli P, Mattioli M, Bardoni B (2004) In vitro growth of preantral follicles isolated from cryopreserved ovine ovarian tissue. Biol Reprod. 70:12-17.

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83 81 8 CAPÍTULO 3 Tecido ovariano congelado e fresco requerem diferentes meios de cultivo para promover o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais bovinos Frozen and fresh ovarian tissue require different culture media to promote in vitro development of bovine preantral follicles Periódico: Biopreservation and Biobanking, v. 12 (5), p , 2014.

84 82 RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência de diferentes meios de base para o cultivo in vitro de folículos pré-antrais bovinos frescos ou submetidos a congelação lenta. Fragmentos de córtex ovariano frescos e congelados, não cultivados ou cultivados, foram destinados à análise histológica, de viabilidade e proliferação celular. Para a criopreservação, os fragmentos expostos à solução contendo 1.5 M de etilenoglicol foram congelados com auxílio de um freezer biológico programável. Imediatamente após a descongelação parte das amostras foi destinada ao controle. Os fragmentos restantes foram cultivados in vitro por cinco dias em meio α-mem, McCoy ou M199. Amostras dos diferentes meios de cultivo foram coletados nos dias 1 e 5 para quantificação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e dosagem hormonal. No tecido frescocultivado o percentual de folículos morfologicamente normais foi significativamente superior utilizando o M199 quando comparado aos demais meios. Já para o tecido congelado-cultivado o meio McCoy foi significativamente superior aos demais meios, sendo o único tratamento a manter a viabilidade similar ao controle fresco e ao controle congelado. A quantificação de regiões organizadoras de nucléolos (NORs) indicou uma maior proliferação de células da granulosa no tecido congelado-cultivado quando utilizado o meio McCoy, enquanto para o tecido fresco-cultivado houve menor proliferação com o meio α-mem. No tecido congelado-cultivado, os níveis de ROS foram superiores no D1 e reduziram com o decorrer do cultivo, independente do meio. Em conclusão, as condições utilizadas neste estudo mostraram que os meios M199 e McCoy são recomendados para o cultivo de folículos oriundos de tecido ovariano bovino fresco e congelado, respectivamente. Palavras-chave: Criopreservação, tecido ovariano, α-mem, McCoy, M199

85 83 Frozen and fresh ovarian tissue require different culture media to promote in vitro development of bovine preantral follicles Simone Vieira Castro 1, Adeline Andrade Carvalho 1, Cleidson Manoel Gomes Silva 1, Francielli Weber Santos 2, Cláudio Cabral Campello 1, José Ricardo de Figueiredo 1, Ana Paula Ribeiro Rodrigues 1* 1 Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles (LAMOFOPA), Veterinary Faculty, State University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil. 2 Department of Chemistry, Center of Natural and Exact Sciences, Federal University of Santa Maria, Santa Maria-RS, Brazil * Corresponding address: Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA) Universidade Estadual do Ceará (UECE) Av. Silas Munguba, 1700, Bairro Itaperi. Fortaleza CE Brasil. CEP: Tel.: ; Fax: address: aprrodriguespapers@gmail.com (Ana Paula Ribeiro Rodrigues)

86 84 Abstract Our aim in this study was to evaluate the efficiency of different media in the in vitro culture of bovine preantral follicles that were used either fresh or following slow freezing treatment. Frozen and fresh non-cultured or cultured ovarian fragments were processed for histological, viability, and cell proliferation analyses. For cryopreservation, was used a solution containing 1.5 M ethylene glycol and frozen in a programmable biological freezer. After thawing, part of the samples was destined for frozen control. The remainders were cultured in vitro for 5 days in three media: α-mem, McCoy, or M199. Samples from these culture media were collected on days 1 and 5 for quantification of reactive oxygen species (ROS) and for hormonal assays. In freshcultured tissues, the percentage of morphologically normal follicles was significantly higher when cultured in M199 compared to that in the other media. In frozen-cultured tissues, McCoy medium was significantly superior to the other media, and was the only treatment that helped in maintaining the viability similar to fresh and frozen controls. Upon quantification of the nucleolus organizer region, we observed greater proliferation of granulosa cells in the frozencultured tissues with McCoy medium, and lesser proliferation in fresh-cultured tissues only with α-mem. In frozen-cultured tissues, ROS levels were highest at day 1 and progressively reduced during culture, independent of the media used. In conclusion, under the conditions used in this study, the M199 and McCoy media are recommended for the culture of follicles derived from fresh and frozen ovarian tissues, respectively. Keywords: Cryopreservation, ovarian tissue, α-mem, McCoy, M199

87 85 Introduction In recent decades, continuous advances in cancer treatment have helped in considerably increasing survival rates among young women with cancer. Nevertheless, the administration of chemo/radiotherapy can result in gonadotoxic effects, which, in severe cases, can lead to infertility 1. Fortunately, progress in cryobiology and assisted reproduction techniques have provided an alternative to the re-establishment of female fertility after anticancer treatment, which involves the removal and cryopreservation of ovarian tissue before starting treatment so that the tissue can be reimplanted after healing 2,3. However, the ovarian cortex transplantation procedure poses a risk of reintroduction of malignant cells 4. In order to enable pregnancy in women after treatment of malignant diseases without the risk of reintroduction of cancer cells through transplantation of the ovarian tissue, in vitro culture systems have been investigated as an alternative to ensure follicle development and in vitro oocyte maturation with subsequent embryo transfer 5. Nevertheless, the protocols of in vitro culture, mainly for preantral follicles present in the ovarian tissue, are not yet properly defined to the point of allowing full follicular development. Moreover, the vast majority of studies aimed at developing in vitro culture systems have used follicles from non-cryopreserved ovarian tissues. This fact, coupled with the lower survival rates of cryopreserved follicles compared to noncryopreserved follicles 6-8 and evidence that cryopreserved cells are less tolerant to in vitro culture and more susceptible to cell death 9, suggest the need for establishing systems and media of in vitro culture that are specific to the requirements of cryopreserved preantral follicles. Owing to ethical constraints and the limited availability of human ovarian tissue for research purposes, animal models with ovaries that are biochemically, physiologically, and anatomically similar to human ovaries 10 are required. Livestock animals serve as experimental models for this purpose, including ovine 11, bovine 12, and swine 13. Indeed, Gandolfi et al. 14 evaluated the behavior of ovarian follicles of humans, bovine, and swine during cryopreservation, and showed that bovine and human ovarian tissues have higher similarity, since human and bovine follicles responded in the same way to the two equilibrium cooling protocols. Since both bovines and humans are non-seasonal, mono-ovulatory species, bovine ovaries represent a good experimental model 12 for assist in the development of protocols to humans. Furthermore, the large size of bovine ovaries yields a large enough quantity of the ovarian cortex from the same

88 86 individual to facilitate experimental research. Thus, in this study, we used the bovine as a model to evaluate the efficiency of three types of media for in vitro culture of frozen/thawed ovarian tissue, and evaluated the morphology, development, and follicular viability, as well as oxidative stress of preantral follicles. Material and methods This experiment was approved and performed under the guidelines of Ethics Committee for Animal Use of State University of Ceará. Except where otherwise stated, all chemical were obtained from Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA). Source and transport of ovarian tissue Ovaries from five adult cows were obtained from a local slaughterhouse, washed once in 70% alcohol, and then twice in HEPES-buffered minimal essential medium (MEM) supplemented with 0.1% (v/v) penicillin/streptomycin. Within 1 h after slaughter, the ovaries were transported to the laboratory in thermo flasks containing tubes filled with MEM at 20 C. Experimental design At the laboratory, the cortex from each pair of ovaries was removed, cut (with a scalpel) into 22 fragments of approximately mm (9 mm 3 ), and allocated to each treatment group. As fresh control, one fragment was immediately fixed in Carnoy s solution for 4 h for histological and proliferation examination, and 1 fragment was submitted to follicular isolation for the viability test. Of the remaining fragments, 9 fragments were destined for in vitro culture with different culture media (α-mem, McCoy, or M199) and 11 fragments were subjected to slow freezing. Freeze-thaw procedure Slow freezing was performed according to the protocol described by Celestino et al. 15, with some modifications. Briefly, ovarian fragments were exposed for 20 min to 1.8 ml freezing solution containing 1.5 M ethylene glycol and 10% fetal calf serum (FCS) in macrotubes. Then, the samples were transferred to a programmable freezer (Freeze Control;

89 87 CryoLogicPtyLtd.; Waverley, Australia), previously equilibrated at 20 C. The temperature was reduced at 2 C/min from 20 C to 7 C, and ice crystal formation (seeding) was manually induced by touching the vials with forceps that were pre-cooled in liquid nitrogen. After seeding, the vials were held at 7 C for 10 min and then cooled at 0.3 C/min to 40 C and finally reduced to 70 C at 10 C/min. The samples were immersed in liquid nitrogen ( 196 C) and stored for up to 1 week. For thawing, the samples were kept at room temperature (RT; ~20 C) for 1 min and then immersed in a water bath at 37 C until the cryopreservation medium was completely melted. Then, the cryoprotectant was removed from the ovarian cortex fragments by three washes (5 min each) in (i) MEM + 10% FCS M sucrose, (ii) MEM + 10% FCS M sucrose, and (iii) MEM + 10% FCS. Finally, one fragment was immediately processed for histological and cell proliferation evaluation and other fragment processed for viability analysis. The others underwent in situ culture in the three different media. In vitro culture The cortex tissue samples were cultured in 24-well culture dishes containing 1 ml of culture medium per well. Culture was performed at 38.5 C in 5% CO 2 in air. The culture medium, based on that described by McLaughlin et al 16 consisted of α-mem, McCoy, or M199 supplemented with hypoxanthine (2 mm), glutamine (3 mm), bovine serum albumin (0.1%), transferrin (2.5 g/ml), selenium (4 ng/ml), insulin (10 ng/ml), and ascorbic acid (50 g/ml). Fresh medium was incubated for 1h prior to use, and the culture medium was replenished every other day. In vitro culture was carried out for 1 and 5 days, and the media were stored for quantification of reactive oxygen species (ROS) and estradiol and progesterone concentrations. After in vitro culture, the ovarian fragments were destined to histological, cell proliferation and viability analysis. Histological evaluation of preantral follicles For histological examination, after fixation in Carnoy s solution for 4 h, the ovarian fragments were dehydrated in increasing concentrations of ethanol, cleared in xylene, and embedded in paraffin wax. After paraffin embedding, the bovine ovarian cortex tissue samples

90 88 were serially sectioned at 7 µm, mounted on a glass slide, and stained with hematoxylin and eosin. All sections were examined under a light microscope (Nikon; Tokyo, Japan) at a magnification of 400. For each treatment, 30 preantral follicles were analyzed per repetition. Only preantral follicles with visible oocyte nuclei were counted. The developmental stages of follicles have been defined previously 17 as primordial (one layer of flattened and cuboidal granulosa cells) or growing (one or more layers of cuboidal granulosa cells around the oocyte and without an antrum) follicles. Follicles were classified as morphologically normal if they presented intact oocytes and granulosa cells. The follicles were considered degenerated if they contained a pyknotic oocyte nucleus or shrunken ooplasm, with or without disorganized granulosa cells and/or detachment of the basement membrane 18. AgNOR staining To estimate the cell proliferation index, Ag-NOR staining was performed to quantify the number of argyrophilic nucleolar organizer regions (NOR). For this purpose, ovarian tissue fixed in Carnoy s solution was sectioned at 5 µm. After reduction with 1% potassium iodide, slides were stained with 50% silver nitrate solution in a colloid solution (2:1) in a darkroom and counterstained with 0.1% safranin. For quantification, the follicles were visualized under a light microscope (1000 ), and the NOR of all the nuclei of visible granulosa cells were counted. In the fresh and 5-day-cultured groups, 30 preantral growing follicles were evaluated. Viability analysis by trypan blue staining Preantral follicles were isolated from the control and frozen-thawed ovarian fragments were obtained using the mechanical method described by Figueiredo et al. 19 with slight modifications. Briefly, with a tissue chopper (The Mickle Laboratory Engineering Co.; Gomshal, Surrey, UK) adjusted to sectioning intervals of 50 µm, samples were cut into small pieces and placed in 2 ml MEM supplemented with 3 mg/ml bovine serum albumin. Samples were then pipetted 100 times with a large Pasteur pipette (inner diameter 1600 µm), followed by pipetting 100 more times with a smaller Pasteur pipette (inner diameter 600 µm) to dissociate the preantral follicles from the stroma. The obtained material was then passed through a 200-µm nylon mesh filter. This procedure was performed within 10 min at RT. Then, 5 µl of 0.4% trypan blue (Sigma Chemical Co.) was added to 100 µl of isolated and suspended preantral follicles, which

91 89 were incubated for 1 min at RT. Afterward, follicles were examined with an inverted microscope (Nikon; Tokyo, Japan) and classified as degenerated (blue-stained) and surviving (unstained). ROS and hormonal levels The ROS levels were determined in culture medium of ovarian tissue by a spectrofluorimetric method, using a 2,7 -dihydrodichlorofluorescein diacetate (DCHF-DA) assay. The medium was incubated with 5 µl of DCHF-DA (1 mm). The oxidation of DCHF-DA to fluorescent dichlorofluorescein (DCF) reflects the level of intracellular ROS. The DCF fluorescence intensity emission was recorded at 520 nm (with 480 nm excitation) 120 min after the addition of DCHF-DA to the medium. The levels of estradiol and progesterone were measured using a microparticle enzyme immunoassay (Abbott Diagnostics AxSYM SYSTEM) with commercial kits (Axsym Progesterone and Estradiol; Abbott Commercial Kit Japan Co., Ltd.; Tokyo, Japan). Culture medium removed on days 1 and 5 was analyzed. Statistical analysis Data were initially evaluated for homoscedasticity and normal distribution of the residues using the Bartlett and Shapiro-Wilk tests, respectively, to confirm requirements underlying analysis of variance (ANOVA). For histological analyses, ANOVA was then carried out according to a factorial arrangement of treatments with medium (α-mem, McCoy, or TCM), procedure (with or without freezing), and time of culture (1 or 5 days) as the main effects. The model used was Y ijk =µ+m i +P j +T k +(M i P j )+(P j T k )+(M i P j T k )+e ijk, where Y ijk is the dependent variable, µ is the general mean, M i is the medium, P j is the procedure, T k is the time of culture, M i P j is the interaction between the medium and procedure, P j T k is the interaction between the procedure and time, M i P j T k is the interaction among medium, procedure, and time, and e ijk is the residual error. When any main effect or interactions were significant, means were separated by the Student-Newman-Keuls test. Dunnet s test was applied to compare experimental treatments against control groups, i.e., fresh or frozen samples. For NOR data, ANOVA was then carried out according to a 3 2 factorial arrangement of treatments with medium (α-mem, McCoy, or M199) and procedure (frozen or not) as the main effects. The model used was

92 90 Y ij =µ+m i +P j +(M i P j )+e ij. When any main effect or interactions were significant, means were separated by the Student-Newman-Keuls test. Dunnet s test was applied to compare experimental treatments against the control group, i.e., fresh (non-cultured and non-frozen) samples. The ROS data were analyzed by one-way ANOVA followed by the post-hoc Duncan s test. For viability evaluated by trypan blue staining, follicles were taken as a pool and analyzed as the frequency dispersion with the chi-square test. In all cases, differences were considered to be significant when P<0.05, and results are expressed as mean ± standard deviation (SD). Results Histological evaluation of preantral follicles A total of 2100 preantral follicles was analyzed by classical histology. Follicles derived from fresh and frozen tissues after in vitro culture for 5 days with intact morphology (a) or degenerated (b) are shown in Figure 1. Immediately after thawing (frozen control), a reduction in the percentage of morphologically normal follicles was observed when compared to the fresh control (Figure 2). Similar results were observed in all cultured treatments compared to fresh and frozen controls. When the fresh-cultured and frozen-cultured tissues were compared, there was a lower percentage of normal follicles at day 5 of culture in frozen-cultured tissues, except for those cultured with McCoy medium. Comparing the days of culture, the frozen-cultured tissue showed a significant reduction of normal follicles on day 5, regardless of the medium used. Figure 1. Morphological aspects of bovine preantral follicles after 5 days of in vitro culture. Images show a morphologically intact primordial follicle in the frozen-cultured fragment in McCOy (a) and degenerated growing follicles in the fresh-cultured fragment in αmem (b) presenting picnose oocytes (white arrow) and cytoplasmic shrinkage (black arrow)

93 91 The percentage of morphologically normal follicles observed in fresh-cultured ovarian tissues in M199 medium was higher than that in McCoy at day 1, and was also higher in M199 than the other two media investigated after 5 days of in vitro culture (Figure 2). Culture in α-mem resulted in a lower percentage of normal follicles when compared to the other media at day 5 (P <0.05). In frozen-cultured tissues, we observed that using the McCoy medium resulted in a higher percentage of normal follicles than that with other media, both on day 1 and day 5 of culture (P <0.05). Interestingly, the M199 medium resulted in a lower (P <0.05) percentage of normal follicles when used in frozen-cultured tissues on day 5 of culture. Figure 2. Percentage of morphologically normal bovine preantral follicles in fresh, frozen, and cultured ovarian tissues. C1, fresh control; C2, frozen control; * significant difference from the fresh control; significant difference from fresh and frozen control. Different uppercase letters (AB) indicate a significant difference between days of culture. Different lowercase letters (ab) indicate significant differences among media within the same day (1 or 5) and treatment (fresh or frozen). Different Greek symbols (αβ) indicate differences between treatments (fresh or frozen) within each medium and day of culture. With regard to follicular development, all cultured treatments showed a higher percentage of growing follicles when compared to fresh and frozen controls (Figure 3). In freshcultured tissues, M199 and McCoy media resulted in an increase in the percentage of growing

94 92 follicles from day 1 to day 5, whereas α-mem reduced the percentage of growing follicles from day 1 to day 5 (P <0.05). In frozen-cultured tissues, only McCoy increased the percentage of growing follicles on day 5 compared to day 1 of culture. Furthermore, the other media (α-mem and M199) reduced the percentage of growing follicles on day 5 (P <0.05). Comparing the efficiency of the media for fresh-cultured and frozen-cultured tissues, both M199 and McCoy resulted in a higher percentage of growing follicles in the frozen-cultured group on day 1. By contrast, on day 5, culture in McCoy medium yielded a significantly higher percentage of growing follicles in the frozen-cultured group, and M199 yielded the highest percentage in the fresh-cultured group. Figure 3. Percentage of growing preantral follicles before and after in vitro culture for up to 5 days. C1, fresh control; C2, frozen control; * significant difference from the fresh control; significant difference from fresh and frozen control. Different uppercase letters (AB) indicate a significant difference between days of culture. Different lowercase letters (ab) indicate significant differences among media within the same day (1 or 5) and treatment (fresh or frozen). Different Greek symbols (αβ) indicate differences between treatments (fresh or frozen) within each medium and day of culture.

95 93 AgNOR staining A total of 140 preantral follicles were analyzed by AgNOR staining. Evaluation of cell proliferation by quantification of NOR (Figure 4) revealed a greater number of NOR/granulosa cells in fresh-cultured tissues in M199 and McCoy media compared to α-mem in day 5 and the fresh control (Table 1). Otherwise, only frozen-cultured fragments cultured in McCoy medium had a higher average NOR/cell number compared to the fresh control, α-mem, and M199 media. M199 promoted greater cell proliferation in fresh-cultured tissues, while α - MEM and McCoy showed similar proliferation rates between fresh-cultured and frozen-cultured tissues. Figure 4. Bovine growing preantral follicles stained using the AgNOR technique, showing the nucleolar organizer regions (NOR) stained black by silver nitrate (white arrows).

96 94 Table 1. Average number of nucleolar organizer regions (NOR) per nucleus of granulosa cells derived from bovine growing preantral follicles from fresh and frozen ovarian tissues that were subjected to in vitro culture. Treatment No. NOR/cell Day 1 Day 5 Fresh Control 1.78 ± 0.42 α-mem 2.15 ± 0.41 *Aab 1.91 ±0.37 Ab McCoy 2.39 ± 0.41 *Aa 2.34 ± 0.25 *Aa M ± 0.39 *Aab 2.21 ± 0.27 *Aa Frozen Control 1.99 ± 0.28 α-mem 2.00 ± 0.29 Ab 1.91 ± 0.28 Ab McCoy 2.35 ± 0.37 * Aa 2.36 ± 0.33 * Aa M ± 0.32 Ab 1.82 ± 0.22 Ab * Significant difference from the fresh control. Significant difference from the frozen control. A,B Within a columm, means without a common letter differed. a,b Within a row, means without a common letter differed (P<0.05). Preantral follicle viability analysis The assessment of viability by membrane integrity as evidenced by trypan blue vital dye showed no difference in the percentage of viable follicles present between the fresh and frozen controls (Table 2). After 5 days of culture, there was a reduction in the percentage of viable follicles in fresh-cultured tissues, regardless of the media tested, compared to the fresh control (P <0.05). The analysis of follicles from the frozen-cultured group demonstrated that all media tested maintained follicle viability similar to the frozen control (P> 0.05). Furthermore, McCoy medium was also able to maintain follicle viability similar to that of the fresh control. However, comparing the medium for the fresh-culture group no significant difference was

97 95 observed, in similarly in frozen-cultured group no have difference between the medium. There was no statistical difference among the media within the fresh-cultured and frozen-cultured groups. Table 2. Percentage of viable preantral follicles from fresh and frozen ovarian tissues that were subjected to in vitro culture for 5 days Treatment Experimental conditions Culture(-) Freeze (-) Culture(-) Freeze (+) Culture(+) Freeze (-) Culture(+) Freeze (+) Fresh control Frozen control α-mem * Ab * Aa McCoy * Bb Aa M * Bb * Aa * Significant difference from the fresh control. A,B Within a columm, means without a common letter differed. a,b Within a row, means without a common letter differed (P<0.05). (-) absence (+) presence. ROS and hormonal levels There was no difference in ROS levels from the culture media obtained on days 1 and 5 of culture in the fresh-cultured tissues (Figure 5), regardless of the medium used (P>0.05). As for the frozen-cultured tissues, irrespective of the media, the amount of ROS was lower at day 5 when compared to day 1 (P <0.05). Furthermore, M199 promoted an increase in ROS on day 1 in frozen-cultured tissues compared to fresh-cultured tissues. Hormonal production was ng/ml for progesterone and pg/ml for estradiol. However, no significant difference in the levels of these hormones was observed between the fresh-cultured and frozen-cultured tissues, regardless of the medium used.

98 96 Figure 5. Quantification of reactive oxygen species from the media of the fresh-cultured and frozen-cultured tissues. Different uppercase letters (AB) indicate a significant difference between days of culture. Different lowercase letters (ab) indicate significant differences among media within the same day (1 or 5) and treatment (fresh or frozen). Different Greek symbols (αβ) indicate differences between treatments (fresh or frozen) within each medium and day of culture. Discussion In this study, the efficiency of three basic media (α-mem, McCoy, and M199) was evaluated for the in vitro culture of bovine preantral follicles included in fresh or frozen ovarian tissue. The morphology and developmental competence of fresh-cultured or frozen-cultured preantral follicles was demonstrated to be influenced by the type of base medium used. For fresh-cultured tissues, maintenance of normal morphology and follicular development was more efficient when the M199 medium was used. These results are in agreement with the findings of Rossetto et al. 20, who assessed the effect of different media (α- MEM, McCoy, M199) for the culture of isolated bovine preantral follicles that were not cryopreserved, and showed that M199 was more efficient than the other media with respect to the same parameters evaluated in the present study. On the other hand, our results showed that McCoy medium was more suitable for the culture of previously frozen tissues with respect to preserving the morphology and maintaining follicular viability, and promote greater proliferation

99 97 of granulosa cells, as demonstrated by the AgNOR. This can be attributed to the cryopreservation process, which can alter the natural conditions of the cellular environment, and thus modify their requirements for homeostasis and survival. In particular, cryopreservation can lead to retardation of follicular development and/or render cells more sensitive to degeneration occurring in vitro 9,21. These results provide strong evidence that fresh and cryopreserved preantral follicles have distinct requirements for proper in vitro development. The histological analysis showed a lower percentage of normal follicles in the frozencultured group with αmem and M199, but the viability analysis, based on the trypan blue technique, indicated a higher percentage of viable follicles in the frozen-cultured group compared to the fresh-cultured group. Although the morphology is not always correlated with the viability 22, we suggest that this difference between the histology and follicular viability test results is related to the follicular isolation procedure adopted in the present study. Cryopreserved follicular cells are considered more sensitive to laboratory processing techniques, but can withstand histological processing; if they show a high degree of degeneration, follicles may become lost and/or disintegrated during the mechanical processing of follicle isolation. Thus, the follicles derived from the frozen-cultured group had a higher degree of degeneration that was assessable using histological techniques, but possibly experienced a more pronounced loss during the isolation process, resulting in a higher proportion of viable follicles relative to identifiable follicles in the trypan blue viability analysis. The nucleolar organizer regions (NOR) are structural-functional units of the nucleolus in which all the components necessary for the ribosomal RNA synthesis are located and the number of such regions is closely linked with cellular activity. Thus, cells with more intense proliferative activity exhibit a greater number of NOR 23. This method of analysis has been widely used to evaluate the activity of cancer cell lines 24,25,26 and recently was also used to evaluate the activity of granulosa cells 27. In the present study, besides the higher percentage of normal and growing follicles shown by histology on frozen-cultured tissue with McCoy medium, the AgNOR technique showed that the granulosa cells of these follicles had a higher mitotic activity when compared to follicles cultured in other media. Even with this increase in cellular activity as demonstrated by AgNOR, a reduction in the amount of ROS of D1 to D5 in frozen

100 98 group was observed. Possibly, this reduction is related to reduction in cell number, since the histological analysis showed a reduction in the number of normal follicles. Numerous studies have shown that various cell characteristics are altered by the cryopreservation process, including morphology 6, ultrastructure 28, and gene expression 29, 30. Furthermore, most studies have used the same culture systems for fresh and cryopreserved follicles. Consequently, the results for the culture of previously cryopreserved cells have been unsatisfactory in general, which is partly because culture systems are developed based on the requirements of non-cryopreserved cells. Currently, several different types of culture media are commercially available for the in vitro culture of different cell types. However, these media show variation in their efficiency for the culture of preantral follicles 20, which may be related to the composition of the medium with regard to the presence and concentration of contained substances. As demonstrated in this work, the procedure of freezing influences the efficiency of media, possibly by changes in cell metabolism that reflect changes in the requirement for cell survival and development. The medium used for cell culture needs to meet the specific requirements of the cells to enable their normal growth and proliferation in vitro. In this context, efforts have been undertaken to characterize the metabolic activity of follicles in order to identify the requirements of these structures and facilitate development of a medium capable of promoting complete follicular development in vitro. Recently, it was shown that both the stroma and granulosa cells have glycolytic activity 31. In another study, Harris et al. 32 found that primordial follicles have the ability to use glucose as the main carbohydrate source, suggesting that glycolysis is an important pathway to produce energy for this class of follicular cells. Considering these observations, McCoy medium contains a higher glucose concentration than M199; thus, it is possible that cryopreserved follicles use glycolysis to obtain energy for the complete restoration of cellular activities. McCoy medium also has higher vitamin content than M199, especially those belonging to the B complex such as folic acid, pyridoxine, and cyanocobalamin. These vitamins are important for cell survival and development because they act as essential co-factors for the metabolism of carbon, which involves a complex metabolic network of interdependent biosynthetic pathways 33. This network is involved in the synthesis of

101 99 nucleotides and amino acids 34, and also participates in other mechanisms such as the methylation of catecholamines and nuclear proteins such as histones 35,36. We formulated two hypotheses to explain the results of this study. The first hypothesis is that cells of the ovarian tissue require a higher energy intake after being subjected to stressful conditions of the freezing procedure. Thus, the increased efficiency demonstrated in McCoy medium may be related to its higher concentration of glucose compared with the other media tested. The second hypothesis is based on the importance of vitamins in various metabolic processes 33. Thus, it is likely that follicles previously submitted to the freezing procedure have a greater requirement of these compounds, possibly due to the activation or increased activity of metabolic pathways required to repair sub-lethal damage induced by cryopreservation 37. The results of this study allow us to conclude that the media, M199 and McCoy, are more suitable for the in vitro development of bovine preantral follicles contained in non-frozen and cryopreserved by slow freezing ovarian tissues, respectively. As has already been shown that bovine and human follicles respond similarly, it is possible that in humans the use of specific culture systems for the cryopreserved tissue is also necessary. Thus, this experimental system is a valuable model for assessing the suitability of a culture system to promote the in vitro development of preantral follicles after cryopreservation. Acknowledgments This work was supported by CNPq and CAPES, Brazil. S.V. Castro and A.P.R Rodrigues are supported by a grant from CAPES. References 1 Hancke K, Isachenko V, Isachenko E, et al. Prevention of ovarian damage and infertility in young female cancer patients awaiting chemotherapy-clinical approach and unsolved issues. Support Care Cancer 2011; 19: Donnez J, Dolmans MM, Demylle D, et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. The Lancet 2004; 364(9443):

102 100 3 Meirow D, Levron J, Eldar-Geva T, et al. Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy. N Engl J Med 2005; 353: Dolmans MM, Marinescu C, Saussoy P, et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leuckemia is potentially unsafe. Blood 2010; 116: De La Peña EC, Takahashi Y, Katagiri S, et al. Birth of pups after transfer of mouse embryos derived from vitrified preantral follicles. Reproduction 2002; 123: Carvalho AA, Faustino LR, Silva CMG, et al. Influence of vitrification techniques and solutions on the morphology and survival ao preantral follicles after in vitro culture of caprine ovarian tissue. Theriogenology 2011; 76: Oskam IC, Lund T, Santos RR. Irreversible damage in ovine ovarian tissue after cryopreservation in propanediol: analyses after in vitro cultured and xenotransplantation. Reprod Domest Anim 2011; 46: Ting AY, Yeoman RR, Lawson MS, et al. In vitro development of secondary follicles from cryopreserved rhesus macaque ovarian tissue after slow-rate freeze or vitrification. Hum Reprod 2011; 26(9): Men H, Monson RL, Parrish JL, et al. Degeneration of cryopreserved bovine oocytes via apoptosis during subsequent culture. Cryobiology 2003; 47: Vandeberg, JL.. Need for primate models in biomedical research. Gynecol Obstet Invest 2004; 57(1): Bordes A, Lornage J, Demirci B, et al. Normal gestations and live births after orthotopic autograft of vitrified warmed hemi-ovaries into ewes. Hum Reprod 2005; 20: Gerritse R, Beerendonk CCM, Tijink MSL, et al. Optimal perfusion of an intact ovary as a prerequisite for successful ovarian cryopreservation. Hum Reprod 2008; 23(2): Borges EN, Silva RC, Futino DO, et al. Cryopreservation of swine ovarian tissue: effect of different cryoprotectants on the structural preservation of preantral follicle oocytes. Cryobiology 2009; 59: Gandolfi F, Paffoni A, Brambilla EP, et al. Efficiency of equilibrium cooling and vitrification procedures for the cryopreservation of ovarian tissue: comparative analysis between human and animal models. Fertil Steril 2006; 85:

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104 Castro SV, Carvalho AA, Silva CMG, et al. Freezing solution containing dimethylsulfoxide and fetal calf serum maintains survival and ultrastructure of goat preantral follicles after cryopreservation and in viro culture of ovarian tissue. Cell Tissue Res 2011; 346: Turathum B, Saikhun K, Sangsuwan P, et al. Effects of vitrificaton on nuclear maturation, ultrastructural changes and gene expression of canine oocytes. Reprod Biol Endocrinol 2010; doi: / Monzo C, Haouzi D, Roman K, et al. Slow freezing and vitrification differentially modify the gene expression profile of human metaphase II oocytes. Hum Reprod 2012; 27(7): Collado-fernandez E, Picton HM, Dumollard R. Metabolism thoughout follicle and oocyte development in mammals. Int. J. Dev. Biol. 2012; 56: Harris SE, Leese HJ, Gosden RG, et al. Pyruvate and oxygen consumption throughout the growth and development of murine oocytes. Mol Reprod Dev 2009; 76: Bailey LB. Folate in health and disease. CRC Press, Boca Raton Florida, Christensen KE, Mackenzie RE. Mitochandrial one-carbon metabolism is adapted to the specific needs or yeast, plants and mammals. BioEssays 2006; 28(6): Sharma RP. Schizophrenia, epigenetics and ligand-activated nuclear receptors: a framework for chromatin therapeutics. Schizophr Res 2005; 72: Kale A, Naphade N, Sapkale S, et al. Reduced polic acid, vitamin B12 and docosahexaenoic acid and increased homocusteine and cortisol in never-medicated schizophrenia patients: implications for altered one-carbon metabolism. Psychiatry research, 2010; 175: Rodriguez AM, Silva CB, Macías-García B, et al. Dimethylformamide improves the in vitro characteristics of thawed stallion spermatozoa reducing subletal damage. Reprod Domest Anim 2012; 47:

105 103 9 CAPÍTULO 4 Efeito da congelação lenta e vitrificação sobre a integridade do estroma, morfologia e desenvolvimento folicular em tecido ovariano bovino Effect of slow freezing and vitrification on stromal integrity, follicular morphology and development in bovine ovarian tissue Periódico: Reproduction in domestic animal, a ser submetido

106 104 RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar e comparar o efeito de ambos os métodos de criopreservação, congelação lenta e vitrificação, sobre o desenvolvimento folicular e integridade do estroma. Tecido ovariano fresco, congelado e vitrificado seguido ou não de cultivo in vitro, foram processados para análise histológica, de viabilidade e proliferação celular. Além disto, dosagem hormonal foi realizada a partir do meio de cultivo, bem como fragmentos ovarianos para qpcr (para a quantificação de RNAm para Bax e Bcl2) e Western blot. Ambos os métodos de criopreservação reduziram o percentual de folículos morfologicamente normais quando comparado com o controle, mas não reduziu o percentual de folículos em desenvolvimento, diâmetro folicular e viabilidade. A proliferação celular, avaliada por imunolocalização e quantificação do PCNA, não demonstrou diferença entre os tratamentos. Apenas no tecido vitrificado houve um aumento na quantidade de RAD51 e na relação Bax/Bcl2 após o cultivo quando com parado com o tecido vitrificado e não cultivado. A análise do estroma demonstrou uma redução no percentual de fibras colágenase densidade de células do estroma, independente do método de criopreservação. No entanto, as fibras colágenas foram mais afetadas pela vitrificação do que pela congelação lenta. Em conclusão, ambos os métodos de criopreservação mantém de forma similar a viabilidade e potencial de desenvolvimento de folículos pré-antrais bovinos, porém a vitrificação demonstrou ter maior efeito deletério sobre as fibras colágenas.

107 105 Effect of slow freezing and vitrification on stromal integrity, follicular morphology and development in bovine ovarian tissue Simone Vieira Castro 1, Adeline Andrade Carvalho 1, Antônia Debora Sales 1, Carlos Henrique Lobo 1, Cláudio Cabral Campello 1, José Ricardo de Figueiredo 1, Vilceu Bordignon 2, Ana Paula Ribeiro Rodrigues 1. 1 Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles (LAMOFOPA), Veterinary Faculty, State University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil. 2 Department of Animal Science, McGill University, Lakeshore Road, Ste-Anne-de- Bellevue, Quebec, Canada H9X 3V9. *Corresponding address: Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA) Universidade Estadual do Ceará (UECE) Av. Silas Munguba, 1700, Bairro Itaperi. Fortaleza CE Brasil. CEP: Tel.: ; Fax: address: aprrodriguespapers@gmail.com (Ana Paula Ribeiro Rodrigues)

108 106 Abstract Our aim in this study was to evaluate and compare the effect of both cryopreservation methods, slow freezing and vitrification, on folicular development and stromal integrity. Fresh, frozen and vitrified ovarian tissue, followed or not by in vitro culture, were processed for histological, viability and cell proliferation analyses. Furthermore, homone dosage was performed from culture medium as well as fragments of ovarian tissue were destined to qpcr (for Bax and Bcl2) and Western Blot (for PCNA and RAD51). Both cryopreservation methods reduced the percentage of normal follicles when compare with control, but did not reduce the percentage of growing follicles, follicular diameter and viability. Cell proliferation, evaluated by PCNA immunolocalization and the quantification of de same protein by western blot showed no difference between treatments. Only in vitrified ovarian tissue there was an increase of RAD51 quantity and Bax/Bcl2 ration after culture when compare with before culture. The analysis of stromal demonstrated a reduction in the percentage of collagen fiber and density of stromal cells independent of cryopreservation method. However, the collagen fibers were more affected by vitrification than by slow freezing. In conclusion, both cryopreservation methods similarly maintain the viability and development potential of bovine preantral follicles, but vitrification had greater deleterious effect on collagen fibers.

109 107 Introduction In recent years, with advances in oncology tools detections and more efficient treatments against cancerous cells, an increasing number of patients survive after chemioradioterapy treatment, being reported a significant reduction in the mortality rate, including children and adolescents (Smith et al. 2010, Smith et al. 2014). However, the oncologic treatments can promote depletion follicular reserve, culminating with premature failure and infertility (Imbert et al. 2014). Thus, in the context of oncofertility, the cryopreservation is mainly important because it represents a viable alternative to preserve the fertility of women undergoing the chemo-radiotherapy. Special emphasis is given to ovarian tissue cryopreservation, because besides allowing the preservation of a large number of oocytes enclosed in preantral follicles, requires no prior hormone treatment and is the only alternative to prepubertal patients (Meirow et al. 2005, Demeestere et al. 2007). Furthermore, the ovarian tissue fragments can be transplanted later, enabling the resumption of endocrine and gametogenic functions (Donnez et al. 2004, Donnez et al. 2012, Ernst et al. 2010, Roux et al. 2010). Cryopreservation can be performed by two different methods i.e. slow freezing and vitrification. The first one is named also as the conventional method of cryopreservation, characterized by the use of low concentration of cryoprotectants, resulting in freezing of the extracellular liquid without severe osmotic and toxic damage to cells. (Gosden et al. 2010). Using this method it was possible to obtain livebirths after orthotopic autografts (Donnez et al. 2013). Nevertheless, in recent decades vitrification has gained notoriety, with very promising results for oocytes and embryos (Quan et al. 2014, Nikiforaki et al. 2014, Al-Azawi et al. 2013). The first livebirths related in human, after transplantantion of vitrified ovarian tissue, was in 2013 (Kawamura et al. 2013). After that, the same research team, after heterotopic transplantation of vitrified ovarian tissue followed by IVF related another health baby delivered (Suzuki et al. 2015). Thus, showing that it is possible both methods of cryopreservation maintain the reproductive function. However, there is no consensus on which method is more efficient to preserve preantral follicles enclosed in ovarian tissue, and still limited information about the impact of cryopreservation methods on the integrity of the ovarian stroma. The study of ovarian tissue cryopreservation has been of great interest to researchers around the world both human and animal assisted reproduction. Studies of this nature in women

110 108 are more difficult, and often unethical to conduct. Thus, it is currently used animal models in the development of safer and more effective biotechnical. Some experiments, comparing human with different species, has been demonstrated that the bovine ovarian tissue is a good translational model for human ovarian tissue cryopreservation protocols (Gandolfi et al. 2006, Kagawa et al. 2009). In this context, our aim was to compare the efficiency of the slow freezing and vitrification for bovine ovarian tissue and assess the development capacity of preantral follicles, as well as the integrity of the ovarian stroma after both cryopreservation methods. Material and methods Source and transport of ovarian tissue Ovaries (n= 10) were harvested from five adult cows obtained at a local slaughterhouse. They were washed once in 70 % alcohol and twice in HEPES-buffered MEM (HMEM; Sigma, St. Louis, Mo., USA) supplemented with 0.1 % (v/v) penicillin/streptomycin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). The ovaries were transported to the laboratory in HMEM within 1 h at 20 C. Experimental design At the laboratory, the cortex from each pair of ovaries was removed, avoiding regions of corpus luteum and large antral follicles, and 18 fragments (9 mm 3 ) were obtained and distributed as follows: 3 fresh fragments (control) were immediately intended for histological, immunohistochemistry and viability analysis; 3 fragments were cultured in vitro; 6 fragments were submitted for slow freezing and others 6 were vitrified. After warming / thawed 3 fragments in each cryopreserved group were immediately submitted to analysis and the remained were cultured in vitro. The fresh fragments, cryopreserved (using slow freezing or vitrification), as well as in vitro cultured fragments, with or without cryopreservation corresponded to 6 treatments. All of them were analyzed as morphological characteristics, granulosa cell proliferation, viability, stromal cell density and collagen fibers. Cryopreservation of ovarian cortex

111 109 Vitrification and warming The fragments were vitrified according to the protocol described for bovine ovaries (Faheem et al. 2011). Briefly, the ovarian fragments were initially exposed to the vitrification solution I composed by HMEM plus 20 % of fetal calf serum (FCS), 7.5 % of ethylene glycol (EG; Dinâmica Química, Diadema, Brazil) and 7.5 % of dimethyl sulfoxide (DMSO; Dinâmica Química, Diadema, Brazil) during 15 min at 20 C. Then, ovarian cortex was transferred to vitrification solution II (HMEM + 20 % de FCS + 15 % de EG + 15 % de DMSO) for 5 min. Subsequently, the fragments were transferred to the surface of a metallic cube partially immersed in liquid nitrogen and after vitrified were placed in cryotubes and stored in liquid nitrogen for up to one week. To warming, cryotubes were exposed to room temperature (~25 ºC) for 20 seconds and immersed in a water bath at 37 C for 1 min. Removal of cryoprotectants agents was carried out by four successive washes (5 min each) in HMEM medium supplemented with 20 % of FCS and decreasing concentration of sucrose e (1, 0.5, 0.1 and 0 M). Slow freezing and thawing The slow freezing was performed according to the protocol described by Celestino et al. (2008). Briefly, fragments were exposed in macrotubes for 20 min to 1.8 ml of cryopreservation solution, containing 1.5 M of EG and 10 % of FCS, at 20 ºC. Then, the samples were transferred to a programmable freezer (Freeze Control, CryoLogic Pty Ltd., Waverley, Australia), previously equilibrated at 20 C. The temperature was reduced at 2 C/min from 20 C to -7 C, and ice crystal formation (seeding) was manually induced by touching the vials with forceps that were pre-cooled in liquid nitrogen, and the vials were held at -7 C for 10 min. Then, it were cooled at 0.3 C/min to -40 C, at 10 C/min to -70 C and finally the samples were immersed in liquid nitrogen (-196 C) and stored for up to 1 week. For thawing, the samples were kept at room temperature (~ 20 C) for 1 min and then immersed in a water bath at 37 C until cryopreservation medium was complete melted. The cryoprotectant was removed from the ovarian cortex fragments by three washes (5 min each) in (i) HMEM + 10 % FCS M sucrose, (ii) HMEM + 10 % FCS M sucrose, (iii) HMEM + 10 % FCS.

112 110 In vitro culture of preantral follicles included in ovarian tissue Samples from fresh and cryopreserved (vitrification and slow freezing) ovarian cortex were cultured in 24-well plates with 1 ml per well. The culture was carried out for five days at 38.5 C with 5 % of CO 2 in air. Were used two culture media determined by Castro et al (2014 a,b), previously considered most appropriated to fresh or cryopreserved ovarian tissues. Both culture medium (M199 fresh tissue or McCoy cryopreserved tissue) was supplemented with hypoxanthine (2 mm), glutamine (3 mm), bovine serum albumin (0.1 %), transferrin (2.5 g/ml), selenium (4 ng/ml), insulin (10 ng/ml) and ascorbic acid (50 g/ml). M199 or McCoy medium were incubated for 1 h prior to use, replenished every other day and stored (-20 ºC) for dosage of estradiol and progesterone. Morphological analysis of preantral follicles For histological examination, after fixation in Carnoy s solution for 4 h, the ovarian fragments were dehydrated in increasing concentrations of ethanol, cleared in xylene, and embedded in paraffin wax. Paraffin blocks containing the ovarian tissues were serially sectioned at 7 µm, mounted on a glass slide, and stained with hematoxylin and eosin. All sections were examined under a light microscope (Nikon; Tokyo, Japan) at a magnification of 400. For each treatment, 30 preantral follicles were analyzed per repetition. Follicles were classified as morphologically normal, if they presented intact oocytes and granulosa cells, or degenerated if they contained a pyknotic oocyte nucleus or shrunken ooplasm, with or without disorganized granulosa cells and/or detachment of the basement membrane (Rodrigues et al. 2004). The developmental stages of follicles was classified as primordial (oocyte surrounded by one layer of flattened granulosa cells) or growing (oocyte surrounded by one or more layers of cuboidal granulosa cells and without an antrum) follicles. In addition, using only normal follicles, the follicle diameter from 25 follicles / treatment were measured at x and y dimensions (90 ) with the aid of a DS Cooled Camera Head (DS-Ri1) coupled to a Nikon Eclipse 80imicroscope and

113 111 analyzed using the Nikon NIS Elements software (NikonNIS-Elements 3.0, 2008) under 400 magnification. Evaluation of the density of collagen fibers and stromal cells To evaluate the ovarian stroma from fresh and cryopreserved samples followed or not by in vitro culture, were checked stromal cell density and the percentage of collagen fibers. The cell density was calculated by the average number of cells in an area of 10,000 µm 2. In each of the six treatments, 10 fields were analyzed per animal, totaling 50 fields. For evaluation of collagen fibers, 7 µm ovarian sections were stained with Sirius Red (0.1 %) diluted with picric acid (1.2 %) (Dinâmica, Diadema, São Paulo, Brazil) and analyzed using polarized light microscopy (Nikon, Tokyo, Japan). Was evaluated the percentage of the area occupied by the collagen fibers in 10 different fields with 60,000 µm 2 per animal, totaling 50 fields per treatment. For both analyzes we used a Nikon Eclipse 80i microscope connected to DS Cooled Camera Head DS-Ri1 and analyzed with a Nikon NIS-Elements software (Nikon NIS- Elements 3.0, 2008) under 400x magnification. Follicular viability Preantral follicles were isolated from the fresh and cultured control, cryopreserved and cryopreserved/cultured ovarian fragments by the mechanical method described by Figueiredo et al. (1998) with slight modifications. Briefly, samples were cut into small pieces with a tissue chopper (The Mickle Laboratory Engineering Co., Gomshal, Surrey, UK) adjusted to a sectioning interval of 50 µm. Samples were placed in HMEM supplemented with 3 mg/ml BSA, and suspended 100 times with a large Pasteur pipette (inner diameter 1600 µm), followed by 100 times with a smaller Pasteur pipette (inner diameter 600 µm) to dissociate preantral follicles from stroma. The obtained material was then passed through a 200 µm nylon mesh filter. This procedure was performed within 10 min at room temperature (RT). The viability of preantral follicles was assessed by the trypan blue dye exclusion test. Briefly, 5 µl of 0.4 % trypan blue (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) was added to 100 µl of isolated and suspended preantral follicles, which were incubated for 1 min at RT. Afterwards, follicles were examined

114 112 with an inverted microscope (Nikon, Tokyo, Japan) and classified as nonviable or viable if they were positively stained or negatively stained by trypan blue, respectively. Assessment of cell proliferation by immunohistochemistry Fragments from fresh and cryopreserved ovarian tissue (slow freezing or vitrification), followed or not by in vitro culture, were fixed in 4 % paraformaldehyde for 4 h at RT, dehydrated in ethanol, diaphanized, embedded in paraffin wax, sectionated at 5 µm and mounted on slides treated with poly-l-lysine. Antigen retrieval was performed by incubation with citric acid (0.01 M, ph 6.0) and Twee 20 (1 %; Sigma, St. Louis, Mo., USA) in moist heat (pressure cooker). Then, blocking of peroxidase activity (3 % of H 2 O 2 in methanol), biotin (avidin biotin blocking kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) and non-specific blocking (5 % of BSA in PBS) were performed. The slides were incubated overnight at 4 o C with anti-pcna antibody (Proliferating Cell Nuclear Antigen; 1:3 000, AB ABCAN, Inc., USA) followed by incubation with the biotinylated anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) secondary antibody (1:500 AB97049, ABCAN, Inc.). Atfer that, the slides were washed, incubed 30 min with avidin-biotin complex (Vector laboratories, Burlingame, CA, USA). For localization of the protein, was used enzimatic revelation with diaminobenzidine (Dako, Inc., Carpinteria, CA, USA), and finally, the sections were counterstained with haematoxylin. The follicles were classified as no stained, follicles with less then 50 % or more 50 % of granulosa cells stained. Negative controls consisted of ovarian tissue subjected to the same reaction, however, the primary antibody was omitted. Analysis of genic expression The fresh control, cryopreserved (vitrification or slow freezing) and cultured (with or without cryopreservation) tissue samples were used for RNA extraction. Isolation of total RNA was performed using Trizol (Invitrogen, São Paulo, SP, Brazil) following manufacturer's recommendations. Total RNA was purified from this supernatant using the column system PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), according to manufacturer's instructions. RNA preparations were subjected to DNase I treatment with a PureLink DNase

115 113 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). After this treatment, RNA was washed with the provided buffer solutions and then re-suspended in 30 µl RNAse free water. RNA quality and concentration were determined in a NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). Prior to reverse transcription, the RNA samples were incubated for 5 min at 65 C, and then chilled on ice. Reverse transcription was then performed in a total volume of 20 µl made up of 0.5 µg sample RNA, 4 µl 5X reverse transcriptase buffer (Invitrogen, São Paulo, Brazil), 8 units RNaseOUT, 150 units Superscript III reverse transcriptase, U random primers (Invitrogen), 10 mm DTT and 0.5 mm of each dntp. This mix was submitted at 25 C for 5 min, 50 C for 40 min and 70 C for 15 min. The resulting cdna was stored at -20 C until later use. Minus RT blanks were prepared under the same conditions but without inclusion of reverse transcriptase. Quantification of mrna levels for Bcl-2 and Bax was performed using Power SYBR Green PCR Master Mix. Real-time PCR reactions were carried out using 1 µl cdna as template in 10 µl of Power SYBR Green PCR Master Mix (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 7.4 µl of ultra-pure water and 0.5 µm of each primer. Peptidylprolyl Isomerase A (PPIA) was used as endogenous controls for normalization of gene expression. The gene-specific primers used for the amplification of the different transcripts were as follows (Table 1). Table 1. Oligonucleotide primers form PPIA, BCL-2 and BAX used in gene expression. Analysis. Gene Sense Primer sequence (5 à 3 ) PPIA S TCA-TTT-GCA-CGT-CCA-AGA-CTG AS TCA-TGC-CCT-CTT-TCA-CTT-TGC Bcl-2 S ATG-TGT-GTG-GAG-AGC-GTC-AA AS GCC-AGG-AGA-AAT-CAA-ACA-GG Bax S GTT-TTC-CGA-CGG-CAA-CTT-C AS GGA-TGG-TCC-TGA-TCA-ACT-CG

116 114 Western blot Samples from fresh, frozen and vitrified ovarian tissue, submitted or not to in vitro culture, were lysed with sonicator aid in Laemmli buffer (Bio-Rad) containing Phosphatase and Protease Inhibitor Cocktail (GBiosciences, St Louis, MO, USA). Protein samples were separated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE) and transferred to nitrocellulose membranes (Bio-Rad). After blocking with 5% BSA in Tris-buffered saline with 0.1% Tween, the membranes were incubated overnight with anti-pcna (1:1 000; Abcam, Inc.), anti-rad51 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) or anti-b-actin rabbit polyclonal primary antibodies (1:5 000; Abcam, Inc., Toronto, ON, Canada). Subsequently, the membranes were incubated for 1 h with peroxidase-conjugated antirabbit secondary antibodies (diluition 1: ; Cell Signaling, Boston, MA, USA). The membranes were incubated for 2 min with reagents provided with the Immun-Star WesternC Chemiluminescent Kit, and images were captured using the ChemiDoc MP System (Bio-Rad). Detection and quantification of Western bands intensities was conducted using Image Lab software, version 5.0 (Bio-Rad). Hormone assays The estradiol and progesterone levels were measured by microparticle enzyme immunoassay (MEIA Abbott Diagnostics AxSYM SYSTEM) using a commercial kit (AxsymProgesterona and Estradiol, Abbott Japan Co, Ltda,Tokyo Japan). For this analysis, were used the culture media obtained from fresh or cryopreserved fragments, on days 2 and 4of the in vitro culture. Statistical analysis Data for continuous variables were initially evaluated for homocedasticity and normal distribution of the residues, by Bartlett s and Shapiro-Wilk tests, respectively, to confirm requeriments underlying analysis of variance. ANOVA was then carried out according to a 3 2 factorial arrangement of treatments with procedure [Freezing, vitrification or none (fresh ovarian tissue, as the positive control)] and culture (yes or no) as the main effects. The model used was Y ij =µ+p i +C j +(P i C j )+e ij, where Y ijk = dependent variable, µ= general mean; P i =procedure, C j =culture, P i C j = interaction between procedure and culture, and e ij = residual error. When any

117 115 main effect or the interaction was significant, means were separated by Student-Newman-Keuls test and the results were expressed as mean ± standard deviation (SD). Exception was done for hormonal dosages, which did not show homocedasticity and were analyzed by Kruskal-Wallis non-parametric test. For discrete variables (viable preantral follicles and PCNA), follicles were taken as a pool and analyzed as dispersion of frequency with Chi-square test (or Fisher s Exact Test when observed frequency was less than five) and results were expressed as percentages. In all cases, differences were considered to be significant when (P<0.05). Results Morphological and developmental analysis of pre-antral follicles One hundred and fifty follicles per treatment were evaluated, totaling 900 follicles in the histological analysis. The percentage of morphologically normal follicles significantly reduced after ovarian tissue culture, with or without cryopreservation. After cryopreservation by both methods was observed a lower percentage of normal follicles, compared to fresh tissue (not cryopreserved) cultured in vitro or not. However, there was no significant difference between frozen and vitrified ovarian tissue (Figure 1A). Percentage of growing follicles increased in all treatments after five days of in vitro culture as compared to non cultured tissue. In non cultured ovarian fragments, there was no significant difference between the fresh and cryopreserved tissue, either by slow freezing or vitrification. However, after 5 days of culture the percentage of growing follicles in the previously vitrified tissue was superior to fresh tissue (no cryopreserved Figure 1B). Follicular diameter did not suffer alteration in any of the situations analyzed (Figure 1C).

118 116 Figure 1. Histological evaluation of bovine preantral follicles in fresh and cryopreserved ovarian tissue before and after in vitro culture. A: Percentage of morphogically nomal follicles. B: Percentage of growing preantral follicles. C: Follicular diameter. Different uppercase letter (AB) indicate significant difference between days. Different lowercase letter (ab) indicate significant difference among treatments (control, slow freezing and vitrification).

119 117 Viability and cell proliferation Fresh or vitrified pre-antral follicles showed reduced viability after 5 days (D5) of in vitro culture compared to non cultured tissue (D0), but there was no significant difference between treatments on the same day of culture (Table 2). Table 2. Percentage of viable preantral follicles in fresh and cryopreserved ovarian tissue before and after in vitro culture. Non cultured Cultured Control (34/35) A (22/32) B Slow freezing (26/30) A (27/38) A Vitrification (33/34) A (10/18) B A,B Indicates difference between columns. The immunohintochemistry for PCNA showed unstained follicles, follicles with less (<50%) and more (> 50%) than 50% of granulosa cells PCNA positive in all treatments tested (Figure 2 A, B, C). There was no significant difference between fresh and cryopreserved treatments (slow freezing or vitrification), followed or not by in vitro culture (Table 3). Figure 2. Preantral follicles stained to PCNA showing a follicle negative to PCNA (A) with less then 50% of cells stained (B) and more then 50% of cells PCNA positive(c).

120 118 Table 3. Percentage of PCNA staining in fresh or cultured preantral follicles before or after cryopreservation. No stained < 50% > 50% Control (fresh) (7/27) (5/27) (15/27) Control (cultured) (4/23) (4/23) (15/23) Frozen cultured (3/22) 4.55 (1/22) (18/22) Vitrified cultured (3/25) (4/25) (18/25) Hormone dosage Hormone analysis showed a significant increase in the progesterone and estradiol levels from day 2 to 4 only in fresh tissue (control). Similar results were observed in frozen tissue for estradiol. However, there was no difference between fresh, frozen and vitrified follicles at same day of culture (Table 4). Table 4. Progesterone and estradiol levels (mean + SE) at 2 or 4 days of in vitro culture. Progesterone (ng/ml) Estradiol (pg/ml) Day 2 Day 4 Day 2 Day 4 Control A B A B Slow freezing A A A B Vitrification A A A A A,B: significantly different between day of culture day qpcr and Western Blot The analysis of gene expression of Bax and Bcl2 showed no significant difference between fresh and cryopreserved follicles. However, only vitrified follicles had a higher relation Bax/Bcl2 after in vitro culture, as compared to the non-cultured tissue (Figure 3).

121 119 In Western blot analysis there was no significant difference in the quantity of PCNA protein between treatments (Figure 4A). However, analysis of the RAD51 protein showed a significant increase after in vitro culture of cryopreserved tissue by both methods (Figure 4B). Figure 3. Relative Bcl2/Bax mrna expression in control, frozen and vitrified ovarian tissue before and after in vitro culture. AB Indicate significant difference before and after culture

122 120 Figure 4. Quantification of PCNA and RAD51 proteins in bovine ovarian tissue fresh, frozen and vitrified, followed or not by in vitro culture. Representative immunoblots and protein quantification of PCNA (A) and RAD51 (B). The abundance of each protein was calculated in relation to the loading control, β actin (β-actin). Asterisk indicates statistical difference from between groups (P < 0.05).