EFEITO DO CONGELAMENTO NA CONTAGEM DE SALMONELLA ENTERITIDIS PELO MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) EM CECOS DE FRANGOS DE CORTE

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1 EFEITO DO CONGELAMENTO NA CONTAGEM DE SALMONELLA ENTERITIDIS PELO MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) EM CECOS DE FRANGOS DE CORTE FREEZING EFFECT ON SALMONELLA ENTERITIDIS COUNTING BY THE MOST PROBABLE NUMBER (MPN) METHOD IN CECA FROM BROILERS Vanessa Rodrigues Vieira 1 ; Vladimir Pinheiro do Nascimento 2 ; Anderlise Borsoi 3 ; Luciana Ruschel dos Santos 4. RESUMO O objetivo do presente trabalho foi avaliar o comportamento quantitativo sob o estresse de diferentes períodos de congelamento a temperatura de -20ºC de Salmonella Enteritidis inoculada em cecos de frangos de corte, através do método do Número Mais Provável (NMP). Foram coletados 60 cecos na linha de produção de uma indústria avícola e realizada a contagem de salmonelas pelo NMP. Foram realizados 4 tratamentos, sendo T1: material não congelado e T2, T3 e T4 amostras congeladas por 1, 3 e 7 dias a 20oC, respectivamente. No primeiro tratamento foram obtidos os números máximos para presença de células de Salmonella por NMP (>110 cél/g) em todas as amostras. Nos cecos congelados por 1 e 3 dias, sete amostras apresentaram diminuição do NMP e, no congelamento por 7 dias, somente cinco amostras diminuíram a contagem pelo NMP. Não houve diferença significativa entre a redução bacteriana e os tempos de congelamentos das amostras nos 4 tratamentos, entretanto, amostras não congeladas obtiveram maiores contagens pelo NMP frente àquelas congeladas. O congelamento de amostras pode interferir na recuperação e contagem de células de salmonelas, influenciando na identificação da real contaminação existente por ocasião do período de coleta das mesmas. Palavras chave: Salmonella enteritidis, contagem por NMP, frangos de corte, cecos luruschel@upf.br

2 141 Efeito do congelamento... ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the Salmonella enteritidis quantitative behavior, through the Most Probable Number (MPN) method, under different stress time conditions, at 20ºC. Samples of 60 ceca from broiler were collected, obtained in the production line from a poultry industry. Ceca were divided in 4 treatments, as follows: T1: samples not frozen and T2, T3 e T4 samples frozen for 1, 3 and 7 days at 20 o C, respectively. The results showed in the first treatment the maximum numbers of the presence of Salmonella cells for NMP (>110 cél/g) in all samples. In the ceca frozen for 1 and 3 days, seven samples showed a decrease in NMP counting. The samples frozen by 7 days, only five samples had a counting decrease by NMP. Samples frozen and non-frozen didn t show significant difference reduction in MPN among freezing times. However, the non-frozen samples obtained higher counting by MPN than ones submitted to -20 o C procedure. The samples submitted to frozen procedures can present some difficulties to recover and count microbial cells, so this way would bring damages to reflect the real situation at time of acquiring the samples. Key words: Salmonella enteritidis, quantification by MPN, broiler, ceca. INTRODUÇÃO As salmonelas estão amplamente difundidas na natureza e são capazes de infectar o homem e os animais. Aves contaminadas por salmonelas paratíficas podem desenvolver a doença clinicamente ou de forma assintomática, alojando estes agentes em seu organismo e tornando-se potenciais transmissores de salmonelose para os seres humanos através de seus produtos finais. Os produtos de origem animal, principalmente avícolas, são considerados uma importante fonte de proteína humana. No comércio brasileiro, carcaças de frangos podem ser encontradas nas formas refrigeradas ou congeladas. A respeito de tais processos de conservação, o resfriamento não inviabilizaria a presença de Salmonella e, ao tratar-se de congelamento, seria esperada a redução ou ausência de células bacterianas viáveis (SANTOS et a.l, 2000). As bactérias têm capacidade de produzir mecanismos de respostas em função aos tratamentos térmicos, como proteínas especializadas para resistência térmica (heat-proteins) aumentando a resistência ao choque térmico; mudanças na estrutura da membrana (alteração na saturação de ácidos graxos para proteção contra baixas temperaturas) e reparação de material genético (EVERIS, 2001), assim confirmando a capacidade de reparo de

3 Vieira, V.R. et al. 142 células injuriadas, isso podendo acontecer em curto espaço de tempo (BOZIARIS & ADAMS, 2001). A alteração de carga microbiana total de uma amostra submetida a algum processo térmico pode ser estimada com a utilização de métodos quantitativos. PEELER & McCLURE (1992) citam que a primeira estimativa precisa do número de bactérias viáveis foi publicada por McGrady em A técnica usada buscava comparar o número de bactérias observadas com o uso de meios de cultura sólidos e líquidos, estimando Escherichia coli em água. HALVORSON & ZIEGLER apud PEELER (1992) publicaram uma série de artigos onde são usadas fundamentações estatísticas de número mais provável (NMP), que representa uma estimativa de densidade de organismos viáveis na amostra. Pesquisadores da Public Health Association (APHA) utilizam tabelas de NMP desenvolvidas por De MAN (1983) para contagem de bactérias em amostras com baixo nível de contaminação. No Brasil são poucos os relatos que incluem a contagem de salmonelas, em diferentes amostras relacionadas às aves. Assim, sob a óptica de envio de amostras clínicas para análise laboratorial, por vezes congeladas, e comercialização de carcaças de frangos congeladas e resfriadas, foi elaborado este estudo. O objetivo foi avaliar o comportamento quantitativo, através do método do NMP, de Salmonella enteritidis inoculada em cecos de frangos de corte, submetidos a diferentes períodos de congelamento a temperatura de -20ºC. MATERIAIS E MÉTODOS Foram utilizados 60 cecos de frangos de corte coletados na linha de produção de uma indústria avícola e processados no laboratório do Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária da UFRGS (CDPA/UFRGS). Coletou-se 10g de conteúdo cecal de cada amostra, colocou-se em saqueta estéril e adicionou-se 1ml de inóculo na diluição 10-7 (aproximadamente 14 UFC/ml de Salmonella enteritidis ácido nalidíxico resistente). Posteriormente adicionou-se às saquetas 90ml de água peptonada tamponada 1% (AP 1%) e homogeneizouse em stomacher por 1 minuto. As 60 amostras foram então divididas em 4 tratamentos com 15 amostras, sendo o T1: material não congelado e T2, T3 e T4 amostras congeladas por 1, 3 e 7 dias, a 20 o C, respectivamente. Após o congelamento, foram realizadas as análises de NMP com técnica descrita por DUFRENNE et al. (2000), adaptada ao laboratório do CDPA/UFRGS. A metodologia consistiu em dividir, a partir dos 100 ml iniciais de cada amostra (conteúdo cecal, AP 1% e inóculo de S.

4 143 Efeito do congelamento... Enteritidis ácido nalidíxico resistente), h. Placas com colônias características de ml em 3 tubos de ensaio, 2,5 ml em outros salmonela foram computadas como 3 tubos e 0,25 ml adicionados de 2,5 ml de positivas e confirmadas com perfil AP 1% nos 3 tubos finais. Os 9 tubos obtidos a partir de cada uma das amostras foram incubados à 37 o C por 24h. Após, as amostras foram repicadas para caldos seletivos (0,1ml para caldo Rappaport bioquímico e sorológico, sendo o resultado levado até a tabela do NMP (De MAN, 1983) para o resultado final de NMP/g. Os resultados obtidos nesse estudo foram analisados pelo Teste do Qui-quadrado. Vassiliadis e 1ml para caldo tetrationato) e incubados à 42 o C por 24h. Posteriormente, RESULTADOS E DISCUSSÃO as culturas foram repicadas em ágar verde Os resultados do NMP de brilhante adicionado de novobiocina e ácido nalidíxico (BGN) e incubadas à 37 o C por Salmonella inoculada em amostras de ceco estão na Tabela 1. TABELA 1: Contagem pelo método do NMP de Salmonella Enteritidis ácido nalidíxico resistente inoculadas em amostras de cecos não congeladas e congeladas a 20 o C por 1, 3 e 7 dias. NMP/g Tratamento 1 n/15 Tratamento 2 n/15 Tratamento 3 n/15 Tratamento 4 n/15 9, > As 15 amostras não congeladas inoculadas com 10-7 de S. Enteritidis ácido nalidíxico resistente obtiveram os números máximos de contagem de NMP, estabelecido em >110 cél/g. Deste modo, ao analisarmos uma amostra clínica em laboratório com NMP >110 cél/g, poderá ser inferido que, provavelmente, tal amostra contenha uma concentração mínima de 10-7 de Salmonella Enteritidis (aproximadamente 14 UFC/ml). Nos tratamentos T2 e T3, congelados a 20 o C por 1 e 3 dias respectivamente, sete amostras dentre as 15 analisadas diminuíram a contagem pelo NMP, enquanto no T4 apenas cinco amostras reduziram a contagem pelo NMP. Nenhuma das amostras apresentou aumento no NMP após o congelamento. O teste do Quiquadrado foi utilizado na análise estatística dos resultados obtidos, o qual demonstrou não haver diferença significativa na redução

5 Vieira, V.R. et al. 144 de contagem de Salmonella pelo NMP entre os tempos de congelamento (tratamentos 2, 3 e 4), bem como entre amostras não congeladas (T1) e congeladas (T2, T3 e T4). Os microrganismos podem estar presentes em uma determinada amostra de três formas: inviabilizados (injúria letal e inabilidade de crescimento), injúria subletal (hábil para reparar seu crescimento sob condições corretas) e viáveis. As alterações podem acontecer no material genético, determinada por tratamento com altas temperaturas, congelamentos e resfriamentos. Alterações de membrana também podem ocorrer quando as células são submetidas a baixas temperaturas, ocorrendo então alteração de permeabilidade da membrana e extravasamento do conteúdo celular ou, quando submetidas ao congelamento, partículas de gelo promover o rompimento da membrana (EVERIS, 2001; BOZIARIS & ADAMS, 2001). As bactérias têm capacidade de produzir mecanismos de respostas, como proteínas especializadas para resistência térmica (heat-proteins), mudanças na estrutura da membrana com alteração na saturação de ácidos graxos para proteção contra baixas temperaturas e reparo de material genético (EVERIS, 2001), confirmando a capacidade de reparo de células injuriadas e este processo podendo ocorrer em um curto espaço de tempo (BOZIARIS & ADAMS, 2001). Autores relatam que a resistência de Salmonella aos tratamentos térmicos é maior quando as mesmas estão em fase estacionária do crescimento e na presença de gordura (DOYLE & MAZZOTTA, 2000; BOZIARIS & ADAMS, 2001; TAYLOR-ROBINSON et al., 2003). Os resultados obtidos no presente estudo concordam com SANTOS et al. (2000), ao afirmarem que em amostras congeladas espera-se uma redução ou mesmo ausência de células bacterianas viáveis. BAILEY et al. (1991) demonstram que as salmonelas e outras enterobactérias não se multiplicam em temperaturas abaixo de 4 o C, demonstrando também que as salmonelas não são inviabilizadas ou reduzidas significativamente por temperaturas inferiores a 18ºC. No mesmo sentido, FOSTER & MEAD (1976) afirmam que salmonelas em carne de frango são destruídas mais rapidamente em temperaturas entre 2 e 5ºC. Por outro lado, os resultados do presente estudo discordam de VAN ESELTINE et al. (1948), os quais observaram que, utilizando congelamento rápido ou utilizando congelamento a temperaturas abaixo de 24 o C, não houve redução no número de bactérias. Em outro enfoque, discordando dos resultados na citação anterior e do

6 145 Efeito do congelamento... presente trabalho, ULRICH & HALVORSON (1947) relataram a ocorrência de grande destruição de células bacterianas quando congeladas por um período de 24 horas. A capacidade de reparo de células injuriadas citada por BOZIARIS & ADAMS (2001) foi demonstrada no experimento de MAY & SAFFLE (1964), onde a contagem bacteriana em cortes de frangos congelados e mantidos à 40 o C multiplicou-se para aproximadamente 10 7 em 14 dias a 2 o C depois do descongelamento, sendo similar a cortes de frango originalmente mantidos por 14 dias à 2 o C. As amostras de cecos analisadas no presente estudo possuíam flora do conteúdo cecal antes da inoculação de Salmonella e vários autores citam que a presença de flora competitiva à Salmonella interfere nas análises de amostras. Neste sentido, DOYLE & MAZZOTTA (2000) e TAYLOR-ROBINSON et al. (2003) citam que a flora acompanhante promove um rápido aumento na termotolerância e maior resistência aos efeitos deletérios em salmonelas. DUFRENNE et al. (2000) avaliaram a presença de salmonelas em carcaças de frangos congeladas e frescas, pelos métodos de contagem por NMP e contagem direta em placa. Os resultados apresentaram somente uma pequena porcentagem (2% carcaças frescas e 2% de carcaças congeladas) contendo mais de Salmonella por carcaça. Os autores afirmaram que a contagem direta de Salmonella em placas foi influenciada, negativamente, pelo grande número de bactérias competidoras presentes na flora das carcaças de frango. O método de NMP produz resultados estimados da população bacteriana com base em probabilidade estatística, assumindo-se que o número verdadeiro de organismos presentes em uma amostra está entre os limites que se supõe ser 95%. Deste modo, a tabulação de NMP representa uma faixa estimada e não os valores absolutos (PEELER & MACCLURE, 1992). Sob as condições calculadas para as tabelas de NMP, o presente experimento detectou uma redução de NMP de Salmonella enteritidis nas amostras congeladas a 20ºC. O congelamento de amostras que serão submetidas às técnicas de bacteriologia convencional poderá interferir na recuperação e contagem de células de salmonelas, prejudicando a reflexão da situação existente nas amostras ao tempo de coleta das mesmas. O desenvolvimento e adoção de novas técnicas que detectem células lesionadas de Salmonella combinadas com a técnica de NMP poderá permitir melhores resultados na estimativa do número total de Salmonella em diferentes amostras.

7 Vieira, V.R. et al. 146 REFERÊNCIAS BAILEY, J.S.; COX, A.C.; BLANKENSHIP, L.C. A comparison of an enzime imunoassay, DNA hibridization, antibody immobilization, and conventional methods for recovery of naturally occurring Salmonellae from processed broiler carcasses. Journal of Food Protection. Annes, v.54, n.5, p , EVERIS, L. Injured bacteria in foods. Nutrition & Food Science, v. 31, n. 2, p , FOSTER, R.D; MEAD G.C. Effect of temperature and added polyphosphate on the survival of salmonellae in poultry meat during cold storage. J. Appl. Bacteriol. v.41, p , BOZIARIS, I.S.; ADAMS, M.R. Temperature shock, injury and transient sensitivity to nisin in Gram negatives. Journal of Applied Microbiology, v. 91, p , De MAN, J.C. MNP tables, corrected. Euro. J. Appl. Microbiol. v.17, p DOYLE, M.E.; MAZZOTA, A.S. Review of studies on the thermal resistance of Salmonellae. Journal of Food Protection, v. 63, n. 6, p , HALVORSON, H.O.; ZIEGLER N.R. Application on of statistics to problems in bacteriology. In: PELLER, J.T e MACCLURE, F.D. Most Probable Number Determination. Bacteriological Analitycal Manual. AOAC. International p MAcGRADY, M.H. The numerical interpretation of fermentation tube results. In: PELLER, J.T e MACCLURE, F.D. Most Probable Number Determination. Bacteriological Analitycal Manual. AOAC International. 1992, p DUFRENNE, J.; RITMEESTER, W.; VAN ASCH, E.D.; et al. Quantification of the contamination of chicken and chicken products in The Netherlands with Salmonella and Campylobacter. J. Food Prot. v. 64, n. 4, p , MAY, K.L.; SAFFLE R.L. Quality of icepacked and of frozen chicken. Taste panel evaluations. Poultry Science. v.43. p PEELER, J.T.; MACCLURE, F.D. Appendix 2. Most Probable Number Determination. In: GARTHRIGHT, W.E.

8 147 Efeito do congelamento... Bacteriological Analitycal Manual. AOAC Internation. 1992, p SANTOS, D.M.S.; BERCHIERI, A.J.; FERNANDES, S. A.; TAVECHIO, A.T.; AMARAL, L. A. Salmonella em carcaças de frangos congeladas. Pesquisa Veterinária Brasileira. v.20, n.1, Rio de Janeiro. Jan./Mar, TAYLOR-ROBINSON, J.D.; CHILD, M.; PICKUP, R.; et al. Cell-cell interactions influence resistance and survival of Salmonella serotype Typhimurium to environmental stress. Journal Applied Microbiology, v. 94, p , ULRICH, J.A.; HALVORSON H.O. Changes in foods during storage in frozen conditions. Minn. Univ. Hormel Inst. Ann. Rep. v.48. p VAN ESELTINE, W. P., NELLIS L.F., LEE F. A, HUCKER G. J. Effect of rate of freezing on bacterial content of frozen vegetables. Food Res. v.43. p