Orientações para Coleta, Transporte, Processamento,

Transcrição

1 Orientações para Coleta, Transporte, Processamento, Análise e Meios de Cultura. ARTIGOS PARA OS SEMINÁRIOS; CONTEÚDO PROGRAMÁTICO; CASOS CLÍNICOS; blog do professor:

2 Colheita de Amostras Quando se suspeita de doença infecciosa Técnicas dirigidas à detecção sorológica de antígenos e anticorpos Sondas de DNA - PCR Anticorpos monoclonais Cultivos apropriados Outros procedimentos sem cultivo

3 Colheita de Amostras É possível que a colheita apropriada de uma amostra para cultivo seja a etapa mis importante na confirmação final de que um microrganismo é responsável pelo processo de enfermidade infecciosa. Uma amostra mal colhida: Na Fracasso instituição no de isolamento uma terapia deincorreta e ainda danosa, microrganismos caso o tratamento importantes. seja dirigido para um comensal.

4 Exemplo: (caso clínico) Klebsiella pneumoniae foi isolada do escarro de um paciente com pneumonia clínica; Klebsiella pneumoniae Escarro colhido de forma inadequada sendo constituído principalmente de saliva; pneumonia Nasofaringe

5 O pior: O tratamento seria inadequado e só resultaria efetivo, por casualidade, se a espécie causadora da pneumonia tivesse um padrão de susceptibilidade a antibióticos Pseudomonas aeruginosa similar à de K. pneumoniae. A terapia eleita poderia ter sido errônea.

6 Colheita de Amostras Considerações fundamentais na colheita de amostras. A amostra deve ser material do sítio real de infecção, devendo ser colhida com o mínimo de contaminação dos tecidos, órgãos e secreções adjacentes; Deve-se estabelecer o momento ótimo para a colheita de amostras, com o objetivo de contar com melhor possibilidade de isolar microrganismos causadores de enfermidades;

7 Colheita de Amostras Considerações fundamentais na colheita de amostras. Enviar Deve-se obter uma quantidade suficiente de Calcularam ao laboratório que Swabs o swab retais seco ou para secreções isolar amostra escassas para é uma realização prática inútil das e de técnicas custo de rendimento do isolamento espécies de Shigella, o material cultivo solicitadas; considerável para o paciente; de microrganismos colhido a partir deve ser inoculado de culturas de sangue diretamente na superfície de Com aumentava Devem demasiada ser utilizados cerca freqüência, ágar de dispositivos Mac Conkey são enviados de ou colheita, caldo ao recipientes 3% laboratório por ml de 0,5 sangue amostras ml enriquecido ou menos e meios de para material de gramnegativos cultura apropriados colhido; identificado (Mermel para como e Maki). assegurar escarro isolamento ou lavado ótimo bactérias anaeróbicas de microrganismos.; brônquico ;

8 Colheita de Amostras Considerações fundamentais na colheita de amostras. Sempre que possível, deve-se obter amostras Etiqueta antes da legível administração com nome, de antibióticos; número de idenficacção, origem, médico e a data/hora Neisseria meningitidis Garganta da colheita; Líquido O recipiente da amostra deve ser rotulado de forma correta; Haemophilus influenzae Neisseria gonorrhoea Amostras geniturinárias cefalorraquidiano (LCR)

9 Colheita de Amostras Outros exemplos importantes.

10 Transporte de Amostras O objetivo primário no transporte de amostras para diagnóstico consiste em manter a amostra o mais próximo possível de seu estado original, com deterioração mínima, e minimizar os riscos para os transportadores das amostras, utilizando-se dispositivos protetores do recipiente da amostra inseridos no interior de um recipiente adequado.

11 Transporte de Amostras Deve-se evitar: Frio Calor extremo Mudanças na pressão Condições ambientais adversas

12 Transporte de Amostras Se for previsto: Um atraso prolongado (acima de 4 dias por exemplo) antes da amostra ser processada; É preferível congelar a amostra a -70ºC, podendo ser utilizado um congelador a -20ºC, se o período de estocagem for breve.

13 Transporte de Amostras As amostras de escarro colhidas principalmente para o isolamento: Podem ser remetidas sem qualquer tratamento desde que colhidas em recipientes de propileno ou polietileno micobactérias esterilizados. fungos

14 Transporte de Amostras A maioria das amostras líquidas, em particular amostra de urina, deve ser transportada ao laboratório o quanto antes possível: Recomenda-se um limite máximo de 2 horas entre a colheita e a chegada da amostra ao laboratório. Contexto hospitalar

15 Transporte de Amostras O limite de tempo representa um problema quando as amostras são colhidas em consultórios particulares. Amostras de urina Podem ser utilizados recipientes contendo uma pequena quantidade de ácido bórico, se o transporte rápido não for possível.

16 Transporte de Amostras Para a maioria das amostras pode ser utilizado um meio de manutenção ou transporte, seguindo-se as instruções do fabricante. Meio de transporte Stuart Solução tampão, isenta de nutrientes e fatores de crescimento, conserva a viabilidade sem permitir a multiplicação das bactérias durante o transporte.

17 Transporte de Amostras Tioglicolato de sódio tem função de agente redutor para melhorar o isolamento de bactérias anaeróbias; Ágar (pequena quantidade) proporciona uma consistência semi-sólida que impede a oxigenação e o derrame durante o transporte;

18 Transporte de Amostras Solução de borato de sódio Tampão com sacarose, fosfato e glutamato

19 Transporte de Amostras As amostras devem ser embaladas de modo a suportar golpes ou mudanças de pressão que podem ocorrer durante a manipulação e causar vazamento do conteúdo; Um recipiente que vaza não apenas predispõe a amostra a uma potencial contaminação, mas também expõe os microrganismos ao pessoal que transporta ou recebe a amostra;

20 Transporte de Amostras Técnica apropriada para embalar e rotular agentes etiológicos: Recipiente primário com tampa à prova d água Recipiente secundário de preferência de metal Embalagem para envio fabricada em cartão ondulado, cartão grosso ou gomaespuma

21 Recepção de Amostras luvas jalecos máscaras

22 Processamento de Amostras Ingresso de dados essenciais em um livro de registros ou em um terminal de computador; Exame visual e determinação do cumprimento de todos os critérios para aceitação da amostra; Para certas amostras, o exame microscópico de montagens úmidas ou de esfregaços corados, para estabelecer um diagnóstico presuntivo;

23 Processamento de Amostras USO DE CORANTES EM MICROBIOLOGIA: É recomendável que os microbiologistas efetuem exames microscópicos diretos das amostras enviadas para cultivo; Rápido diagnóstico presuntivo Guia para selecionar os meios de cultura apropriados

24 Processamento de Amostras Coloração de Gram Cristal violeta serve como coloração primária, unindo-se à parede celular bacteriana após tratamento com uma solução de iodo fraca (mordente para a ligação do corante); Descorante (mistura etanol 95% e acetona) as bactérias que retêm o corante aparecem azuladas se observadas ao microscópio e são denominadas gram-positivas;

25 Processamento de Amostras Coloração de Gram Contracorante Safranina certas bactérias perdem a coloração primária com cristal violeta quando são tratadas com o descorante e captam a contracoloração com safranina e aparecem em vermelho quando observadas ao microscópio, denominandose gram-negativas; A coloração de Gram pode ser utilizada para efetuar identificações presuntivas.

26 Processamento de Amostras Colorações de àlcool-ácido-resistência micobactérias Recobertas por um espesso material ceroso que resiste à coloração, entretanto, uma vez coradas, resistem à descoloração mesmo por solventes orgânicos fortes, como o álcool-ácido. Fenômeno descoberto por Ziehl e Neelsen (1881).

27 Processamento de Amostras OUTROS CORANTES: Laranja de acridina Azul de toluidina e Azul de Metileno Coloração com Prata Coloração com Wright-Giemsa Ácido periódico de Schiff

28 Processamento dos Cultivos Após recebimento de amostras para cultivo no laboratório de microbiologia, devem ser tomadas as seguintes decisões: Selecionar os meios de cultura primários apropriados para o tipo de amostra particular; Determinar a temperatura e a atmosfera de incubação para isolar todos os microrganismos potencialmente significativos;

29 Processamento dos Cultivos Determinar qual dos microrganismos isolados em meios primários requer uma maior caracterização; Determinar se são necessárias provas de suscetibilidade a antibióticos, uma vez conhecida a identidade do organismo; Comum a todos é o reconhecimento das dificuldades envolvidas na manutenção da qualidade dos serviços, em vista das políticas de redução de custos, cada vez mais rigorosas;

30 Seleção de Meios de Cultura Primários Meios não-seletivos são isentos de inibidores e permitem o crescimento de microrganismos encontrados freqüentemente em laboratórios clínicos; Gardnerella vaginalis Haemophilus influenzae Ágar com 5% de Ágar com sangue sangue de carneiro humano Ágar com sangue de cavalo ou de ovelha

31 Seleção de Meios de Cultura Primários Pode-se tornar o ágar sangue seletivo mediante a adição de um ou mais antibióticos ou de certas substâncias químicas; Inibem gram-positivos Colistina e o ácido Canamicina e vancomicina nalidíxico Bacilos Inibe gram-negativos e favorece anaeróbios o crescimento (bacteroides) gram-positivos Ágar McConkey Ágar-KV sangue Ágar EMB

32 Seleção de Meios de Cultura Primários O caldo de enriquecimento é empregado para isolar microrganismos patogênicos de amostras, como fezes, nas quais existe uma elevada concentração de microrganismos comensais; Fase logaritmica Escherichia coli e outros comensais entéricos Salmonella e Shigella Fase de latência

33 Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas Uma vez que a amostra tenha ultrapassado os vários critérios para rejeição e tenha sido aceita para cultivo, porções apropriadas da mesma devem ser transferidas aos vários meios de cultura descritos no item anterior. Essa atividade também é usualmente realizada luvas em uma parte separada de outras áreas do laboratório, conhecida como área de máscaras semeadura ; jalecos

34 Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas O equipamento necessário para a inoculação primária de amostras é relativamente simples:

35 Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas Espalhamento nos quatro quadrantes UFC

36 Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas O meio nos tubos pode ser líquido, semi-sólido (0,3 a 0,5% de ágar) ou sólido. O ágar semisólido é adequado para as provas de motilidade;

37 Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas Os microrganismos diferem quanto à temperatura ótima de incubação. Porém, a maioria dos microrganismos cresce a 35ºC; assim, se o laboratório dispõe apenas de uma estufa, esta deve estar ajustada para 35ºC; O crescimento da maior parte dos microrganismos é potencializado por uma atmosfera de 5% a 10% de CO 2 ;

38 Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas Mais importante que o modo de incubação é a prevenção de amplas flutuações na temperatura. Deve-se cuidar para que os tubos e placas fiquem protegidos de correntes de arcondicionado ou de fluxos de calor; O controle da umidade no interior da estufa também é importante. A maioria dos microrganismos tem crescimento máximo quando a umidade é de 70% ou superior;

39 Interpretação dos Cultivos A identificação dos cultivos primários após 24 a 48 horas de incubação requer uma considerável habilidade; O microbiologista deve avaliar o crescimento das colônias e decidir se são necessários procedimentos adicionais; Essa avaliação se faz:

40 Interpretação dos Cultivos Anotando as características e o número relativo de cada tipo de colônia isolada em meios de ágar; Determinando a pureza, reação à coloração de Gram e morfologia das bactérias em cada tipo de colônia;; Verificando mudanças no meio que circunda as colônias, o que reflete atividades metabólicas específicas de bactérias isoladas;

41 Interpretação dos Cultivos Características macroscópicas das colônias

42 OBRIGADO