Diagnóstico Virológico

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2 Diagnóstico Virológico Auxílio no diagnóstico clínico: determinação do agente causal em casos de diarréia, infecções respiratórias, etc. Vigilância epidemiológica: febre amarela diagnóstico clínico de um caso suspeito deve ser confirmado em laboratório. Iniciar tratamento específico: Herpesvírus, HIV, HCV Triagem de sangue e órgãos : Hepatite B e C, HIV?

3 DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO Diagnóstico clínico Diagnóstico laboratorial Pesquisa do vírion Pesquisa de anticorpos Pesquisa de antígenos

4 Amostras clínicas O que coletar? - depende da suspeita clínica, da fase da doença e do tropismo viral Replicação viral Primeiros 5 dias de infecção: Há replicação viral, nenhuma ou pouca produção de anticorpos - Pesquisa de vírion, antígenos ou genoma viral. Fase aguda: Pesquisa de IgM Fase convalescente: Pesquisa de IgG

5 Amostras clínicas Cuidados que devem ser tomados : 1. CUIDADOS RELACIONADOS AO TRANSPORTE Acondicionamento adequado em tubos estéreis fechados Previamente identificados Refrigeração à 4 C e rápido transporte para o lab.

6 Isolamento viral (métodos clássicos) Isolamento do vírus a partir da amostra clínica em sistemas hospedeiros: PADRÃO OURO Animais de laboratório Cultivo celular Ovos embrionados

7 Amostras clínicas Doenças Sistêmicas (sangue total ou soro) Doença no SNC Biópsia, líquor Doença localizada no TGI Fezes Doença localizada no TR Aspirado de nasofaringe Swab de nasofaringe Doença localizada na pele Swab (líquido das vesículas)

8 Cultura de células (Termo utilizado para se referir às células quando estas estão sendo cultivadas in vitro ).

9 Meios de cultura Meio Essencial Mínimo (MEM) - Glicose - Bicarbonato (Tampão) - Indicador de ph - Íons (Ca +2, Mg +2, Na +, C l-, K +, Zn +2 ) - Vitaminas - Aminoácidos - Antibióticos e antimicóticos - Água - Soro Fetal Bovino 10% Meio de cultivo 2% Meio de Manutenção Condições Ambientais - Temperatura (37 C) - Umidade - Níveis de CO 2 - ph (7.2)

10 Isolamento viral em cultivo celular TÉCNICA: 1. Escolha das células 2. Preparo do material 1. Preparo da amostra clínica (trituração, centrifugação, homogeneização) tratamento com antibótico + antimicótico 2. Inoculação em CC 3. Monitoramento e identificação

11 Identificação do vírus isolado Observação de efeito citopático (CPE) ao microscópio (caso o vírus cause CPE).

12 Exemplos de CPE: Picornavírus em CC Picnose nuclear: células pequenas, arredondadas e soltas do tapete

13 Exemplos de CPE: Formação de sincícios (células gigantes, multinucleadas) Herpesvírus em CC

14 Exemplos de CPE: Formação de Corpúsculos de Inclusão: Vírus da Raiva em CC Corpúsculo de Negri

15 Identificação do vírus isolado Detecção de antígenos virais: Imunoperoxidase Imunofluorescência

16 Isolamento viral em ovos embrionados Saco vitelino Albúmen (clara) Cav. alantóica Membrana corioalantóica Cav. amniótica Embrião

17 Isolamento viral em ovos embrionados Membrana corioalantóica

18 Isolamento viral em O.E TÉCNICA: 1. Seleção, marcação e desinfecção do ovo a ser inoculado Ovoscópio Ovo embrionado Ovo não-embrionado 2. Preparo da amostra clínica 3. Inoculação 4. Incubação 5. Identificação

19 Vias de inoculação Via de inoculação depende do vírus: Vírus da Febre Amarela Vírus Influenza Humano Influenza Aviário Poxvírus

20 Identificação de vírus em O.E: Identificação de CPE: Pocks : induzidos por Poxvírus Morte do embrião: Vírus da Raiva Quando não há CPE: Identificação por métodos imunológicos

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22 Diagnóstico direto (Detecção de antígenos ou ácido nucléico viral a partir da amostra suspeita) Exemplos de técnicas utilizadas: a. Imunofluorescência, Imunoperoxidase b. Microscopia eletrônica c. Métodos moleculares: Reação da polimerase em cadeia (PCR), Hibridização in situ, captura do híbrido

23 Microscopia eletrônica Observa a morfologia do vírus Baixa sensibilidade: partículas virais/ml Amostras para diagnóstico: - cutâneas: líquido vesicular (Herpesvírus, Poxvírus) - material fecal (Rotavírus) Rotavírus Herpesvírus Fonte: Fonte:

24 Imunofluorescência Detecção de antígenos virais em células ou esfregaços. Revelação através de anticorpo marcado com molécula fluorescente Microscópio de fluorescência IFD positiva para vírus Influenza Aviário

25 Elisa (ensaio imunoenzimático) Detecção de antígenos virais nas amostras ou sobrenadante de culturas. Revelação através reação enzima-substrato-cromógeno. Microplaca de Elisa Leitor de Elisa Fonte:

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27 Diagnóstico Indireto (Detecção e quantificação de anticorpos específicos) Exemplos de técnicas utilizadas: a Inibição da hemaglutinação c ELISA (Ensaio imunoenzimático) d Imunofluorescência e Western Blot

28 Métodos indiretos (métodos sorológicos) SOROLOGIA: Detecção de anticorpos (IgM e/ou IgG) no soro do paciente. IgM: anticorpo marcador de infecção aguda. IgG: anticorpo que indica contato prévio com o vírus ou vacinação. Cinética da produção de anticorpos em uma infecção Fase aguda Fase convalescente

29 Elisa indireto Placa sensibilizada Amostra positiva Anticorpo marcado com enzima substrato lavagem lavagem Leitor de microplaca: espectofotômetro

30 Imunofluorescência indireta Ex: Pesquisa de anticorpos séricos para HIV Conjugado Soro (+) Lâmina sensibilizada com antígenos Soro do paciente A L A V A G E M Soro (-) Soro do paciente B

31 Reação de inibição da hemaglutinação Permite verificar a presença de anticorpos especificos para vírus com propriedade hemaglutinante. Ex: Influenza Soro teste Vírus Interação anticorpo-vírus Hemácia Inibição da Hemaglutinação Sorologia pareada: técnica usada para verificar se houve conversão sorológica SFA SFC Fonte: modificado de

32 Western Blot Lisado de proteínas Eletroforese em gel de poliacrilamida Western Blot para HIV Transferência para membrana Fonte: Fonte:

33 Métodos indiretos (métodos sorológicos) Diagnóstico de infecção recente: Detecção de IgM específica Conversão sorológica: soro de fase aguda soro de fase convalescente Observar um aumento, de pelo menos 4 vezes, no título de anticorpos do soro de fase convalescente em relação ao soro de fase aguda

34 Técnicas moleculares

35 Técnicas de Biologia Molecular PRINCÍPIO: Todo vírus tem sequências de ácido nucléico que são específicas e podem ser detectadas por uma reação de hibridização ou de amplificação

36 Técnicas de Biologia Molecular As duas fitas da dupla hélice podem ser reversivelmente separadas quando as PONTES DE HIDROGÊNIO são rompidas. Esse processo é denominado DESNATURAÇÃO. A RENATURAÇÃO ocorre quando se volta às condições físico químicas iniciais.

37 A detecção do genoma viral é importante: Vírus que não podem ser isolados em cultura de células (ex.: HPV, Rotavírus) Vírus com alta diversidade antigênica, o que dificulta a utilização de técnicas imunológicas para detecção de antígeno (ex.: Enterovírus, Influenza)

38 Técnicas moleculares Exemplos de técnicas: Técnicas de hibridização: Ex.: Hibridização in situ, Dot Blot, Captura do Híbrido Técnicas de amplificação: Ex.:PCR (Reação da Polimerase em Cadeia), RT-PCR, PCR em tempo real, PCR Multiplex, Nested-PCR

39 Hibridização in situ Feita em cultivos celulares, cortes de tecidos ou esfregaços Hibridização do genoma viral com sondas complementares marcadas com enzimas.

40 Hibridização in situ Para detecção de HPV em esfregaço cervical Locais onde ocorreu Hibridização Fonte:

41 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Técnica empregada para obter-se amplificação exponencial de pequenas quantidades de DNA in vitro, empregando elementos do processo natural de replicação do DNA. Taq DNA polimerase Iniciadores ou Primers DNA molde

42 Reação em cadeia da polimerase (PCR)

43 Ciclos da reação Ciclo nº cópias ,0 x ,1 x ,3 x ,7 x ,5 x ,1 x ,34 x ,68 x ,36 x ,0 x 10 9

44 Revelação da reação de PCR Eletroforese em Gel de agarose É uma técnica baseada na separação de partículas em um determinado gel de acordo com sua massa e carga.

45 Preparo para aplicação:

46 Eletroforese em gel de agarose - Ligar a cuba de eletroforese. - A eletroforese é feita a 80 Volts por aproximamente 60 min, até que o corante azul atinja 3/4 do gel.

47 Visualização das bandas no gel: Coloração com brometo de etídio transiluminador Máscara de proteção

48 Visualização das bandas no gel:

49 Resultado e Leitura do Gel MP 6 7 Gene L1 do HPV: 450 bp Gene controle (Actina): 310 bp MP: Marcador de Peso Molecular ou ladder (100bp)