Carla Priscila Kamiya Carvalho Pessoa

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1 Carla Priscila Kamiya Carvalho Pessoa Correlação das características ultrassonográficas com o perfil imunoistoquímico dos tumores mamários malignos Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP, para obtenção do Título de Doutor. Orientador: Prof. Dr. Gilberto Uemura Coorientador: Prof. Dr. Angelo Gustavo Zucca Matthes Botucatu 2014

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3 Dedicatória Dedicatória

4 Dedicatória Dedico ao meu marido Eduardo, meus filhos Eduardo e Alexandre, meus pais Ossao e Keiko, meus irmãos Natalia e Rodrigo, meus sogros Fátima e João e aos meus professores e amigos Gilberto e José Ricardo.

5 AGRADECIMENTOS Agradecimentos

6 Agradecimentos Às minhas mestras e incentivadoras: professora Heloisa, professora Mariangela, professora Rosany, professora Eliana e professora Izildinha. Às secretárias do departamento: Cida, Célia e Ligia. À secretária da mastologia: Ju. Aos residentes da mastologia: Marcelo, André, Rafael e Leonardo. Aos funcionários da pós-graduação da Faculdade de Medicina de Botucatu. Às pacientes do CAM que tornaram este trabalho possível. A todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.

7 Índice ÍNDICE

8 Índice Lista de Abreviaturas. 07 Lista de Figuras e Tabelas 11 Resumo 13 Abstract. 15 Introdução.. 17 Objetivo 38 Artigo para publicação Conclusão 53 Anexos. 55 Planilha geral. 62

9 Lista de Abreviaturas LISTA DE ABREVIATURAS

10 Lista de Abreviaturas Birads Breast Imaging Reporting and Data System BRCA1 Breast Cancer 1 CAM CDIS CK - DNA EGFR - Centro de Avaliação em Mastologia carcinoma ductal in situ citoqueratina deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucleico) receptores de fatores de crescimento epidérmico HER1 Human Epidermal growth factor Receptor 1 HER2 Human Epidermal growth factor Receptor 2 Hz IHQ MHz PAAF RE RP SERMs UNESP 2D Hertz imunoistoquímica mega Hertz punção aspirativa por agulha fina receptor de estrógeno receptor de progesterona moduladores seletivos de receptores de estrógeno Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho bidimensional

11 LISTA DE FIGURAS E TABELAS Lista de Figuras e Tabelas

12 Lista de Figuras e Tabelas Gráfico 1 Distribuição dos tumores de acordo com o perfil imunoistoquímico Gráfico 2 Distribuição dos tumores luminais em seus subgrupos: luminal A, luminal B e luminal híbrido Tabela 1 Média de idade e tamanho dos tumores de acordo com o perfil imunoistoquímico Tabela 2 Características ultrassonográficas por subtipo imunoistoquímico Tabela 3 - Características ultrassonográficas por subgrupo luminal A, B ou híbrido Tabela 4 - Características ultrassonográficas de acordo com a presença ou ausência de HER Tabela 5 - Características ultrassonográficas de acordo com a presença ou ausência de Ki Figura 1 Figura 2 Figura 3 Características morfológicas ultrassonográficas de tumor luminal Características morfológicas ultrassonográficas de tumor triplo negativo Características morfológicas ultrassonográficas de tumor HER2 positivo... 48

13 RESUMO Resumo

14 Resumo INTRODUÇÃO: Estudos moleculares do carcinoma de mama, baseados na identificação do perfil de expressão gênica por meio do cdna microarray, permitiram definir subtipos distintos: luminal (A, B e híbrido), superexpressão de HER2 e triplo negativo. Painéis imunoistoquímicos têm sido propostos para a identificação destes subtipos, buscando reproduzir com certa aproximação os perfis de expressão gênica. A ultrassonografia é uma importante modalidade de imagem na caracterização dos tumores de mama e, consequentemente, na morfologia das lesões malignas. OBJETIVO: Diferenciar os subgrupos moleculares descritos quanto às suas características morfológicas ultrassonográficas. SUJEITOS E MÉTODOS: Este trabalho constitui-se em estudo clínico, de caráter analítico e prospectivo. Foram avaliadas 279 lesões mamárias com o diagnóstico de carcinoma ductal invasivo no Centro de Avaliação em Mastologia (CAM) do Departamento de Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP no período de 2010 a RESULTADOS: As principais características ultrassonográficas associadas aos subtipos moleculares foram: a) luminal - pleomórficos, tecido ao redor do tumor espessado, margem não circunscrita, ausência de microcalcificações em seu interior, efeito acústico posterior ausente ou presença de sombra, presença de halo ecogênico e orientação não paralela a pele; b) triplo negativo - ovais e circunscritos, tecido ao redor do tumor normal, ausência de microcalcificações em seu interior, efeito acústico posterior ausente ou presença de reforço, limites abruptos e orientação mais paralela a pele; c) HER2 - pleomórficos, apresentarem tecido ao redor do tumor normal, margem não circunscrita, presença de microcalcificações em seu interior, serem heterogêneos, ausência de efeito acústico posterior, limites abruptos e orientação não paralela a pele. CONCLUSÃO: Foram encontradas características ultrassonográficas distintas (estatisticamente significantes) entre os subtipos imunoistoquímicos estudados. Palavras-chave: Câncer de mama; Imunoistoquímica; Ultrassonografia.

15 ABSTRACT Abstract

16 Abstract INTRODUCTION: Breast cancer molecular studies are usefull to define distinct subtypes based on the identification of gene expression by cdna microarray profile: luminal (A, B and hybrid), HER2 overexpression and triple negative. Immunohistochemical panels have been reported for identification of these subtypes with similarity with profiles of gene expression. Ultrasonography is an important imaging procedure in the characterization of breast tumors by the morphology of malignant lesions. OBJECTIVE: Differentiate the molecular subgroups described through sonographic morphologic characteristics. SUBJECTS AND METHODS: The present study is clinical, analytical and prospective. It was performed in the period from 2010 to breast lesions were diagnosed with invasive ductal carcinoma at Centro de Avaliação em Mastologia (CAM) of the Department of Obstetrics, Gynecology and Breast Unit, Faculty of Medicine of Botucatu. RESULTS: The main sonographic features associated with molecular subtypes were: a) luminal - pleomorphic, thickened tissue around the tumor, no circumscribed margins, absence of microcalcifications, absent posterior acoustic shadowing effect, presence of echogenic halo and no parallel orientation to the skin; b) triple negative - oval and circumscribed lesions, normal tissue around the tumor, absence of microcalcifications, absence of posterior acoustic enhancement effect, sharp boundaries and parallel orientation the skin; c) HER2 - pleomorphic, normal tissue around the tumor, no circumscribed margins, presence of microcalcifications, heterogeneous, absent posterior acoustic effect, sharp boundaries and no parallel orientation to the skin. CONCLUSION: Statistically significant differences were found between distinct sonographic features and immunohistochemical subtypes studied. Keywords: Breast Cancer; Immunohistochemistry; Ultrasonography

17 INTRODUÇÃO Introdução 17

18 Introdução 18 O câncer de mama é o tipo de câncer que mais acomete as mulheres em todo o mundo, tanto em países em desenvolvimento quanto em países desenvolvidos. Cerca de 1,67 milhões de casos novos dessa neoplasia foram diagnosticados para o ano de 2012, em todo o mundo, o que representa 25% de todos os tipos de câncer diagnosticados nas mulheres. Para o Brasil, são esperados casos novos de câncer de mama em 2014, com um risco estimado de 56,09 casos a cada 100 mil mulheres. Sem considerar os tumores de pele não melanoma, esse tipo de câncer é o mais frequente nas mulheres das regiões Sudeste (71,18/ 100 mil), Sul (70,98/ 100 mil), Centro-Oeste (51,30/ 100 mil) e Nordeste (36,74/ 100 mil). Na região Norte, é o segundo tumor mais incidente (21,29/ 100 mil). 1 Os fatores etiológicos desta neoplasia são múltiplos e ainda não são totalmente elucidados. Entre os fatores de risco conhecidos desta entidade podemos citar as categorias: idade, história familiar de câncer de mama, fatores hormonais, doenças proliferativas da mama, irradiação da região mamária na infância, história pessoal de câncer e fatores relacionados aos hábitos de vida. 2 A idade permanece como um dos mais importantes fatores de risco. Segundo a American Cancer Society 3, aos 30 anos a probabilidade de desenvolvimento de câncer de mama nos próximos 10 anos é de 0,44% e aos 70 anos é de 4,14%. Existem fatores de risco relacionados à vida reprodutiva da mulher (menarca precoce, nuliparidade, idade da primeira gestação a termo acima dos 30 anos, anticoncepcionais orais, menopausa tardia e terapia de reposição hormonal) bem estabelecidos em relação ao desenvolvimento do câncer de mama 4, 5 O carcinoma invasivo de mama é definido como um grupo de tumores epiteliais malignos caracterizados por invadir o tecido adjacente e ter marcada tendência à metástase a distância 6. A grande maioria destes tumores é derivado das células da unidade ducto terminal do lóbulo mamário, que são as células cuboidais luminais secretoras e as células mioepiteliais e/ou basais 6, 7, 8. O câncer de mama é uma doença complexa, de alta heterogeneidade clínica, morfológica e biológica. Tumores mamários com histologia e clínica semelhantes podem apresentar diferentes prognósticos e diferentes respostas terapêuticas Essas diferenças podem ser, em parte, justificadas pela existência de diversos

19 Introdução 19 subtipos moleculares do carcinoma de mama, a exigir terapêutica específica. A classificação morfológica (anatomopatológica) atualmente utilizada é insuficiente para caracterizar os carcinomas de mama, uma vez que os tumores com o mesmo grau, estadio e tipo histológico podem apresentar diferentes prognósticos e respostas à terapia 14,15. Acredita-se que as limitações na classificação morfológica são devidas à incapacidade de considerar as características biológicas destes tumores O advento da tecnologia de microarranjos de DNA complementar, com a análise paralela de milhares de genes, tem permitido correlacionar perfis de expressão gênica dos cânceres de mama com a evolução clínica das pacientes e com as respostas às terapias utilizadas. 20 Painéis imunoistoquímicos têm sido propostos para a identificação desses subtipos, buscando reproduzir com certa aproximação os perfis de expressão gênica. 21,22 Apesar de o perfil de expressão gênica ser considerado o teste padrão-ouro para a subtipagem molecular do câncer de mama, em países com recursos limitados, como o Brasil, torna-se necessária a utilização de técnicas menos complexas e financeiramente mais viáveis que possam identificar os subtipos moleculares. Para tal finalidade, a anatomia patológica conta com a imunoistoquímica. 18 O estudo imunoistoquímico tem sido utilizado em diferentes situações da patologia mamária, sendo as mais importantes: avaliação de fatores preditivos e prognósticos do câncer de mama, pesquisa de células epiteliais metastáticas em linfonodo sentinela, diagnóstico diferencial de lesões mamárias e determinação de possível origem de neoplasias metastáticas A imunoistoquímica mantém a vantagem de avaliar a expressão de proteínas no contexto da morfologia do tumor, podendo ser aplicada a pequenas amostras como biópsias extraídas por agulha fina (PAAF), em laboratórios clínicos ou de pesquisa, com menores custos e com um rápido tempo de execução. 30 A expressão do receptor de progesterona (RP), uma proteína induzida por estrogênio, via receptor de estrógeno (RE), é geralmente relatada juntamente com a expressão de RE, e a determinação imunoistoquímica da expressão de RP foi

20 Introdução 20 validada, demonstrando que o status do RP está associado com a sobrevida livre de doença e a sobrevida global. 31 Atualmente, os receptores hormonais são considerados marcadores prognósticos e também preditivos de resposta aos moduladores seletivos dos receptores de estrógeno (SERMs). 23,32 Durante as últimas duas décadas, outra proteína com papel de receptor, alcançou papel de fator prognóstico. Em pesquisas subseqüentes, observou-se que 25 a 30% dos tumores mamários apresentavam amplificação do oncogene HER2/neu que codifica uma glicoproteína transmembrânica da família de receptores de fatores de crescimento epidérmico (EGFR) e é expressa em baixos níveis numa variedade de células normais, incluindo o epitélio ductal mamário. 33,34,35 A determinação do status do HER2 no câncer de mama é importante, a superexpressão do HER2 e/ou a amplificação do gene é um marcador de fator prognóstico de resposta clínica, em pacientes tanto com linfonodos positivos, quanto negativos. 34,36,37,38 Desta forma, foram desenvolvidos novos tratamentos com terapias específicas para pacientes que apresentavam expressão do HER2 incluindo uma terapia alvo para o receptor. O Ki67 é um antígeno nuclear que está expresso em células em proliferação, e portanto não é expresso em células quiescentes (fase G0 do ciclo celular). Como indicador prognóstico, é considerado alto quando seus níveis são superiores a 14%, a sua superexpressão foi relacionada à atividade mitótica aumentada, indiferenciação celular e maior tendência a invasão. 30 Em vista do importante impacto prognóstico e terapêutico que a caracterização do perfil de expressão genética trouxe e da dificuldade técnica que existe em se aplicar esses métodos na prática anatomopatológica diária, grande esforço vem sendo realizado no sentido de tentar identificar características morfológicas e imunofenotípicas que permitam predizer os achados genéticos, a fim de facilitar a aplicação desses conhecimentos. 39

21 Introdução 21 SUBTIPOS MOLECULARES DO CÂNCER DE MAMA Luminal A Os subtipos luminais têm denominação advinda da similaridade que as células neoplásicas desses grupos possuem com as células mamárias normais, que ficam em contato direto com o lúmen dos ductos mamários, as chamadas células luminais. 40 O subtipo molecular luminal A representa cerca de 60% dos casos dos carcinomas de mama. Apresenta fenótipo RE positivo e HER2 negativo e é caracterizado pela elevada expressão de genes representados pelas células epiteliais luminais, como, por exemplo, as citoqueratinas 7, 8, 18 e 19. Este fenótipo está associado à assinatura de melhor prognóstico e responde à terapêutica com antiestrogênicos. 41 Tamoxifeno e inibidores de aromatase são as terapias alvo-específicas utilizadas para o seu tratamento sistêmico. 42 Classificam-se, então, como luminais A os tumores positivos para receptor de estrogênio (RE) e/ou receptor de progesterona (RP), e negativos para amplificação e/ou superexpressão de HER2. 12,19,40,41 Estudos recentes trazem que esse subtipo deve ainda apresentar um índice de Ki-67, avaliado por imunoistoquímica, inferior a 14% de células neoplásicas imunomarcadas. 30, 43,44 Luminal B Os tumores do subtipo luminal B exibem, em sua maioria, receptores hormonais positivos, embora por vezes esses sejam expressos em baixos níveis e não raramente apresentem alto índice proliferativo. Seu maior índice de proliferação celular traz consigo um pior prognóstico em relação aos tumores luminais A. 19,41 A expressão de RE, RP, HER2 e mais recentemente a utilização do índice do Ki-67, distinguem o subtipo luminal A do luminal B 16 : HER2 é negativo e um índice de Ki-67 igual ou superior a 14% de células neoplásicas imunomarcadas. 30,44 Essa nova subclassificação, com a utilização do índice de Ki-67, tem alterado

22 Introdução 22 significativamente os valores de prevalência até então encontrados para os subtipos luminais, uma vez que tumores com alto índice proliferativo, até então classificados como luminais A, segundo os novos parâmetros, são classificados como luminais B. 30,43 O subtipo luminal B foi significativamente associado a um maior risco de recorrência e a uma menor sobrevida livre da doença específica em todas as categorias de tratamento adjuvante sistêmico 16 (B); e, ainda, associado à maior possibilidade de resistência ao tamoxifeno, demonstrando se beneficiar mais do que o subtipo luminal A de quimioterapia associada a antiestrogênicos. 43 Luminal híbrido O subtipo luminal híbrido, mais recentemente, tem sido caracterizado pela positividade de pelo menos um dos receptores hormonais e ser HER2 positivo. Superexpressão de HER2 O subtipo superexpressão de HER2, como o próprio nome indica, possui elevada expressão da oncoproteína HER2, porém apresenta negatividade para receptores hormonais. 45 Pacientes com diagnóstico primário de carcinoma de mama e com superexpressão de HER2 possuem um pior prognóstico em relação aos pacientes que não apresentam essa amplificação gênica. Assim sendo, justifica-se a incorporação do status de HER2, juntamente com o status de outros fatores prognósticos, a uma decisão clínica sobre a prescrição de qualquer terapia adjuvante sistêmica 44,46 ; entretanto, a utilização de terapia alvoespecífica melhora acentuadamente o prognóstico dessas pacientes. 47 A positividade de HER2 parece estar associada relativamente, mas não em absoluto, à resistência às terapias endócrinas. Esse efeito pode ser específico para as terapias moduladoras seletivas do receptor de estrógeno, como o tamoxifeno, e talvez não para terapias de depleção de estrogênio, como os inibidores de aromatase, utilizados em mulheres após a menopausa. 46

23 Introdução 23 As terapias-alvo contra HER2 são muito eficazes, tanto na forma adjuvante, quanto no contexto metastático. O trastuzumabe é um anticorpo monoclonal humanizado que melhora as taxas de resposta, reduz a progressão da doença e melhora a sobrevida quando utilizado isoladamente ou adicionado à quimioterapia em câncer de mama metastático. 48 O tratamento combinado com o paclitaxel é indicado para as pacientes que não receberam tratamento prévio para o tumor. O trastuzumabe adjuvante reduz o risco de recorrência à metade e a mortalidade em um terço em pacientes com câncer de mama em estágio primário. 46 O uso do lapatinibe, outro inibidor da tirosina quinase, que bloqueia tanto o HER2 quanto o HER1, beneficia as pacientes nas quais o uso do trastuzumabe foi ineficaz, controlando sua doença metastática. 49 O pertuzumabe tem como alvo especi fico o domi nio de dimerização extracelular da protei na do HER2, inibindo duas vias de sinalização principais, a protei na cinase ativada pelo mitoge nio (MAP) e o fosfoinositi deo 3-cinase (PI3K), que levam ao impedimento do crescimento celular e a apoptose, respetivamente. Enquanto que o pertuzumabe isoladamente inibiu a proliferação de ce lulas tumorais humanas, a associação com trastuzumabe aumentou significativamente a atividade antitumoral em modelos de xenoenxertos com sobre-expressão HER2. Triplo Negativo Apresenta negatividade tanto para os receptores hormonais, quanto para a superexpressão de HER2. Espera-se assim, que pacientes com esse perfil não se beneficiem do uso de terapias alvo contra HER ou terapias hormonais ( tamoxifeno ou inibidores de aromatase). 50 O comportamento clínico do câncer de mama triplo-negativo é classicamente mais agressivo do que os demais tumores deste órgão, consequentemente, a sobrevida dessas pacientes é inferior à da população geral das pacientes com essa patologia 22,40,53 e semelhante àquela das pacientes portadoras de tumores HER2 positivos, a qual igualmente representa subtipo agressivo de neoplasia mamária. 34,54 A maior parte dos tumores associados à deficiência de BRCA1 é triplonegativa e expressa marcadores de células mioepiteliais, como as CKs basais. 55 Demonstra-se forte relação entre a disfunção da via BRCA1 e a expressão de

24 Introdução 24 CK5. 56 Essas pacientes compartilham evolução clínica desfavorável. 57 Morfologicamente, é caracterizado por alto grau histológico, por elevado índice mitótico, pela presença de áreas de necrose central e pelo destacado infiltrado linfocitário. 58 Um tipo especial de tumor triplo-negativo é o basal, a maioria dos tumores basal-símile exibe características patológicas de alta agressividade, como elevado índice mitótico, pleomorfismo celular acentuado, alta relação núcleo citoplasma, presença de muitas células em apoptose e presença de comedonecrose, entre outros caracteres agressivos. 59 A forma mais adequada de identificar os tumores basal-símile pela IHQ é o método validado por Nielsen et al. 22, que sugeriram a aplicação do seguinte perfil IHQ para definir a população de pacientes portadoras de tumores basaloides: ausência de expressão de RE e HER-2, acompanhada da expressão do receptor do fator de crescimento epidérmico [EGFR], e das citoqueratinas (CK5/6). ULTRASSONOGRAFIA O principal método de rastreamento para o câncer de mama é a mamografia, com sensibilidade variando de 52-82% e especificidade de 90%, sendo que apenas 10% dos cânceres de mama podem não ser detectados. 60 A mamografia, no entanto, apresenta certas limitações quando se trata de mamas densas, mamas de gestantes ou lactantes, ou processos inflamatórios. Nestes casos, a ultrassonografia foi incorporada como método complementar e auxiliar diagnóstico 60,61,62, além de seu indiscutível papel nos casos de mamografias inconclusivas. Importante modalidade na caracterização do tumor de mama. 63 A ultrassonografia tem demonstrado uma evolução progressiva e acelerada tanto em sua tecnologia quanto em sua aplicabilidade. As mamas foram os primeiros órgãos humanos a serem examinados pela ultra-sonografia na tentativa de diagnosticar tumores. 64,65 A tecnologia daquela época não permitia imagens com definição adequada e os estudos eram realizados com aparelhos estáticos que exigiam habilidade, treinamento e longo tempo para cada exame, porque as imagens tinham que ser montadas, praticamente

25 Introdução 25 esculpidas com o transdutor, o que de certo modo acabou frustrando o desenvolvimento de novos estudos. A partir da metade da década de 1970, o aprimoramento do instrumental ultrassonográfico permitiu a publicação de estudos que, realmente, começaram a definir a importância da ultrassonografia no estudo da patologia mamária estabelecendo critérios para o diagnóstico diferencial dos nódulos mamários. 66 Aparelhos estáticos que utilizavam varreduras automáticas foram introduzidos, proporcionando diminuição do tempo de exame e ganhos de definição na imagem. 67 Após, o advento das sondas de tempo real, utilizadas manualmente e com boa definição, proporcionou um grande desenvolvimento. Os equipamentos manuais trouxeram maior facilidade e rapidez ao exame 68-71, mantiveram e até mesmo melhoraram a performance dos equipamentos automáticos A melhoria tecnológica associada aos recursos da informática foram decisivos na adoção da técnica. 76 Em relação às bases físicas da ultra-sonografia, as ondas sonoras são mecânicas e precisam de um meio físico para se propagar. Elas viajam alternando compressão e rarefação nas moléculas, resultando na formação de uma onda sinusoidal relacionando ciclos em uma unidade de tempo. 77 A distância entre duas cristas de onda é denominada comprimento de onda, e o tempo no qual o comprimento de onda se faz por completo é chamado de período. Conceitua-se freqüência como um determinado número de ciclos completos em uma unidade de tempo. A unidade de freqüência acústica é o Hertz (Hz). O principio da ultrassonografia baseia-se em pulsos de ultrassom, que em uma freqüência especifica, são transmitidos pelos tecidos, e os ecos refletidos são captados e processados no computador a fim de gerar imagens bidimensionais do tecido analisado, demonstrando-os, graficamente, na escala cinza. Como os diversos tecidos interagem com o ultrassom de maneiras diversas, diferentes níveis de energia acústica são refletidos ao transdutor. A energia do ultrassom é submetida a dois processos básicos enquanto adentra nos tecidos: atenuação (absorção) e reflexão. Estes dois processos, e mais a variação de velocidade do som nos diferentes meios são responsáveis pelas características ultrassonográficas especificas dos tecidos em análise.

26 Introdução 26 Um fenômeno importante no diagnóstico ultra-sonográfico é a impedância acústica. É definida como a relação da pressão acústica (força de direcionamento) sobre a movimentação molecular induzida no meio onde se encontram. Propriedades teciduais tais como densidade e a compressão entre as moléculas que as constituem são importantes na formação da imagem, pois é na interface entre dois meios adjacentes de diferentes características próprias que ocorre a variação da impedância, ou seja, a divisa acústica que leva a reflexão das ondas sonoras. Devido os tecidos do organismo humano serem muito semelhantes apenas uma pequena quantidade da energia ultrassônica é refletida ao nível da interface dos tecidos adjacentes acusticamente não semelhantes, enquanto que, a maior parte é transmitida e vai adentrando pelos tecidos (99% em media). 77,78 A forma mais usada no diagnóstico ultrassonográfico em mama é o modo-b (brilho, bright ). É baseada na emissão de energia ultrassônica dos elementos do transdutor e leitura dos ecos dos tecidos recebidos de diferentes profundidades. A amplitude do eco recebido do tecido é usada para controlar o brilho (modo-b) no monitor. Os ecos recebidos de várias direções são combinadas para construir uma imagem bidimensional (2D) da mama. Desde que cada pulso transmitido e cada eco recebido ocorram em menos de um milisegundo, mais de 30 imagens podem ser obtidas por segundo. As imagens ultrassonográficas podem revelar as diferentes estruturas da mama. A pele é altamente refletora e aparece como uma linha brilhante na imagem. Ductos lactíferos são facilmente visíveis, especialmente quando estão dilatados. Os ligamentos de Cooper, estruturas de suporte das glândulas, são vistas comumente como finas fibras ecogênicas. O tecido gorduroso produz baixos níveis de ecos e aparecem como uma imagem escura. Já o parênquima mamário e o tecido fibroso refletem o som de forma intensa e aparecem brilhantes, brancos (hiperecogênicas). Lesões mamárias geralmente aparecem mais escuras (hipoecogênicas) que os tecidos vizinhos. 79 A literatura, a partir de então, tem demonstrado o emprego da ultrassonografia na diferenciação das lesões malignas das benignas. Stavros 74 publicou trabalho clássico a respeito das características dos nódulos mamários benignos e malignos, deste então, vários autores tem reproduzido seus achados na prática clínica 74. A ultrassonografia passou a ser Importante modalidade na

27 Introdução 27 caracterização do tumor de mama. 61,62 Outros critérios foram sendo acrescidos aos primeiros, na tentativa de aprimorar a performance do método na distinção de patologias benignas e malignas da mama. Assim, critérios morfológicos como a orientação em relação a pele 74,80,81 (largura/profundidade), espessamento dos ligamentos de Cooper 82, uma maior ecogenicidade ao redor do nódulo, definindo um halo ecogênico 83,84,85, espessamento da pele e alterações texturais no parênquima circunvizinho ao nódulo foram citados 86. Em geral, aceita-se que os nódulos benignos tenham contornos regulares, forma ovalada, ecotextura hipoecogênica homogênea e parede posterior sem alterações ou com reforço ecogênico. Os nódulos malignos, por sua vez, têm contornos irregulares, ecotextura hipoecogênica, heterogênea, sombreamento da parede posterior e formas mais irregulares. 74,84,85,87-90 Na literarura, há poucos trabalhos que associam perfil imunoistoquímico dos tumores às características ultrassonográficas dos mesmos: tumores luminais e HER2 tendem a ser irregulares 91,100 e tumores triplo negativos tendem a ser hipoecogênicos, ovais, circunscritos e tendem a ter menos efeito acústico posterior e tumores HER2 apresentam microcalcificações em seu interior 100.

28 Introdução 28 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. INCA Instituto Nacional de Câncer [homepage on the Internet]. Rio de Janeiro: INCA; 2014 [acesso 10 ago 2014]. Disponível em: 2. Hunt, KK, Robb, GL, Strom, EA, Ueno, NT. Breast Cancer. Second Edition. University of Texas. Springer, 2008, Surveillance Research, American Cancer Society, Hardy EE, Pinotti JA, Osis MJD, Faúndes A. Variáveis reprodutivas e risco para câncer de mama: Estudo caso-controle desenvolvido no Brasil. Boletín de la Oficina Sanitária Panamericana, 1993;115: Shah R, Rosso K, Nathanson SD. Pathogenesis, prevention, diagnosis and treatment of breast cancer. World J Clin Oncol Aug 10;5(3): Tavassoli FA, Devilee P, editors. Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs. Lyon: WHO/ IARC; Birnbaum D, Bertucci F, Ginestier C, Tagett R, Jacquemier J, Charafe-Jauffret E. Basal and luminal breast cancers: basic or luminous? Int J Oncol. 2004;25(2): Böcker W, Moll R, Poremba C, Holland R, van Diest PJ, Dervan P, et al. Common adult stem cells in the human breast give rise to glandular and myoepithelial cell lineages: a new cell biological concept. Lab Invest. 2002;82(6): Cianfrocca M, Gradishar W. New molecular classifications of breast cancer. CA Cancer J Clin. 2009;59(5): Geyer FC, Marchiò C, Reis-Filho JS. The role of molecular analysis in breast cancer. Pathology. 2009;41(1):77-88.

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37 Introdução Ko ES, Lee BH, Kim HA, Noh WC, Kim MS, Lee SA. Triple-negative breast cancer: correlation between imaging and pathological findings. Eur Radiol (2010) 20: Kojima Y, Tsunoda H. Mammography and ultrasound features of triple-negative breast cancer. Breast Cancer 2011, 18: Choi YJ, Seong MH, Choi SH, Kook SH, Kwag HJ, Park YL, Park CH. Ultrasound and Clinicopathological Characteristics of Triple Receptor-Negative Breast Cancers. J Breast Cancer 2011, 14(2): J Breast Cancer 2011 June; 14(2): Dogan BE, Turnbull LW. Imaging of triple-negative breast cancer. Annals of Oncology 2012, 23 (6): Wojcinski S, Soliman AA, Schmidt J, Makowski L, Degenhardt F, Hillemanns P. Sonographic Features of Triple-Negative and Non Triple-Negative Breast Cancer. J Ultrasound Med 2012; 31: Krizmanich-Conniff K, Paramagul C, Patterson SK, Helvie MA, Roubidoux MA, Myles JD, Jiang Q, Sabel M. Triple Negative Breast Cancer: Imaging and Clinical Characteristics. AJR Am J Roentgenol 2012, 199(2): Mi Young Kim and Nami Choi. Mammographic and ultrasonographic features of triple-negative breast cancer: a comparison with other breast cancer subtypes. Acta Radiologica 2013; 54: Boisserie-Lacroix M, Macgrogan Gt, Debled M, Ferron Sp, Asad-Syed M, Mckelvie-Sebileau P, Mathoulin-Pe Ĺissier S, Brouste Vr, Hurtevent-Labrot G. Triple-Negative Breast Cancers: Associations Between Imaging and Pathological Findings for Triple-Negative Tumors Compared With Hormone Receptor- Positive/Human Epidermal Growth Factor Receptor-2-Negative Breast Cancers. TheOncologist 2013; 18: Elias SG, Adams A, Wisner DJ, Esserman LJ, van t Veer LJ, Mali WPTM, Gilhuijs KGA, Hylton NM. Imaging features of HER2 overexpression in breast cancer: a systematic review and metanalysis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2014; 23(8):

38 OBJETIVO Objetivo 38

39 Objetivo 39 O objetivo deste trabalho é correlacionar os grupos definidos pela imunoistoquímica (luminal, triplo negativo e HER2) com as características morfológicas ultrassonográficas.

40 ARTIGO PARA PUBLICAÇÃO Artigo para Publicação 40

41 Artigo para Publicação 41 INTRODUÇÃO O câncer de mama é uma doença complexa e heterogênea do ponto de vista clínico, morfológico e biológico. Tumores mamários com histologia e clínica semelhantes podem apresentar diferentes prognósticos e diferentes respostas terapêuticas. 1-5 Essas diferenças podem ser, em parte, justificadas pela existência de diversos subtipos moleculares do carcinoma de mama, a exigir terapêutica específica. A tecnologia de microarranjos de DNA complementar tem permitido correlacionar perfis de expressão gênica dos cânceres de mama com a evolução clínica das pacientes e com as respostas às terapias utilizadas. 6 Painéis imunoistoquímicos têm sido propostos para a identificação desses subtipos, buscando reproduzir com certa aproximação os perfis de expressão gênica. 7,8 Assim, marcadores moleculares específicos com receptor de estrogênio (RE), receptor de progesterona (RP), HER2 fornecem informações adicionais de prognóstico e para terapia alvo. 9,10 A classificação dos subtipos moleculares atualmente se divide em: 1. Luminal (RE+ e/ou RP+ e HER2-), 2. Triplo negativo (RE-,RP- e HER2-), 3. HER2 (RE-, RP-, HER2+) A ultrassonografia é importante exame de imagem na caracterização morfológica tumores de mama 11,12 e, consequentemente, na diferenciação entre lesões malignas e benignas, além de guiar procedimentos como punções ou biópsias. 13 Stavros 14 publicou trabalho clássico a respeito das características dos nódulos mamários benignos e malignos, deste então, vários autores tem reproduzido seus achados na prática clínica. 14

42 Artigo para Publicação 42 Outros critérios foram sendo acrescidos aos primeiros, na tentativa de aprimorar a performance do método na distinção de patologias benignas e malignas da mama. Assim, critérios morfológicos como a orientação em relação a pele (largura/profundidade) 14,15,16, espessamento dos ligamentos de Cooper 17, maior ecogenicidade ao redor do nódulo, definindo um halo ecogênico 18,19,20, alterações da pele e texturais no parênquima circunvizinho ao nódulo foram acrescentados à classificação ultrassonografica. 21 Raríssimos trabalhos na literatura encontraram diferenças ultrassonográficas entre os grupos definidos pela imunoistoquímica (luminal, triplo negativo e HER2). Tumores luminais apresentam margens irregulares 22 ; tumores triplo negativos são nódulos hipoecogênicos, ovais, irregulares, margens bem definidas e efeito acústico posterior ausente ou presença de reforço ; tumores HER2 positivos apresentam microcalcificações em seu interior 30. OBJETIVO O objetivo deste trabalho é correlacionar os grupos definidos pela imunoistoquímica (luminal, triplo negativo e HER2) com as características morfológicas ultrassonográficas. SUJEITOS E MÉTODOS O presente trabalho constitui-se em estudo clínico, de caráter analítico e prospectivo. Foram avaliadas 279 lesões mamárias com o diagnóstico de carcinoma ductal invasivo no Centro de Avaliação em Mastologia (CAM) do Departamento de Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP no período de 2010 a 2013.

43 Artigo para Publicação 43 Todas as lesões foram submetidas a estudo ultrassonográfico e imunoistoquímico. O exame ultrassonográfico da mama foi realizado utilizando-se um aparelho Logic 5 da General-Eletric (GE) com transdutor linear de 7,5 a 12 MHz. A paciente foi examinada em decúbito dorsal, mantendo os braços erguidos e com as mãos atrás da cabeça, ou outras posições que facilitassem o acesso às lesões, como a sentada ou em decúbito lateral. Os parâmetros ultrassonográficos avaliados foram: forma (oval, pleomórfico ou redondo); orientação em relação à linha da pele (paralela ou não paralela); margem (circunscrita ou não circunscrita); presença de calcificações ( presente ou ausente) padrão de ecogenicidade (heterogêneo, hipoecogênico ou isoecogênico); efeito acústico posterior (ausente, reforço, sombra); limites da lesão com tecido circunjacente ( interface abrupta ou halo); O estudo imunoistoquímico do tumor foi realizado de acordo com o Protocolo da Reação de Imunoistoquímica do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP. Os marcadores tumorais analisados e que foram correlacionados : receptor de estrógeno (RE) e progesterona (RP), produto do oncogene HER 2, Ki67 Os tumores foram divididos em subtipos de acordo com seu perfil imunoistoquímico: luminal ( RE positivo e/ou RP positivo, independente do resultado do HER2) triplo negativo (RE negativo, RP negativo e HER2 negativo HER2 0, 1+ ou 2+ com FISH negativo)

44 Artigo para Publicação 44 HER2 (RE negativo, RP negativo e HER2 positivo HER2 3+ ou 2+ com FISH positivo) Os tumores luminais, por sua vez, foram divididos em subgrupos: luminal A (RE positivo e/ou RP positivo, HER2 negativo e Ki67=< 14% - baixo) luminal B (RE positivo e/ou RP positivo, HER2 negativo e Ki67 >14% - alto) luminal híbrido (positivo e/ou RP positivo, HER2 positivo, independente do Ki67) Foi utilizado o teste de Qui-Quadrado para a análise das variáveis. O presente trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética da Instituição em reunião de 04 de Outubro de RESULTADOS Foram analisados 279 tumores mamários com o diagnóstico de carcinoma ductal invasivo. Destes, 203 (72,75%) lesões pertenciam ao subtipo luminal, 50 (17,92%) pertenciam ao subtipo triplo negativo e 26 (9,33%) pertenciam ao subtipo HER2. Gráfico 1 Distribuição dos tumores de acordo com o perfil imunoistoquímico

45 Artigo para Publicação 45 A idade média das pacientes foi de 56,8 anos e o tamanho médio dos tumores foi de 2,48cm. A idade média e tamanho para os subtipos foi, respectivamente: 57,7 anos e 2,27cm para luminal; 55,4 anos e 2,96cm para triplo negativo e 52,7 anos e 3,28cm para HER2. Tabela 1 Média de idade e tamanho dos tumores de acordo com o perfil imunoistoquímico IDADE MÉDIA TAMANHO MÉDIO Geral 56,8 2,48cm Luminal 57,7 2,27cm Triplo negativo 55,4 2,96cm HER2 52,7 3,28cm Foram estudadas as características morfológicas ultrassonográficas de cada subtipo imunoistoquímico: luminal, triplo negativo e HER2.

46 Artigo para Publicação 46 Tabela 2 Características ultrassonográficas por subtipo imunoistoquímico: número de casos (porcentagens em parênteses), achados significantes em negrito, valores de p ( * p=0,0183, ** p<0,0001, *** p=0,0007, **** p=0,0021) FORMA * LUMINAL TRIPLO NEGATIVO HER2 Oval 20 (9,85) 12 (24,00) 1 (3,89) Pleomórfica 180 (88,67) 36 (72,00) 25 (96,15) Redonda 3 (1,48) 2 (4,00) 0 (0,00) TECIDO AO REDOR ** Espessado 140 (68,97) 6 (12,00) 7 (26,92) Normal 63 (31,03) 44 (88,00) 19 (73,08) MARGEM ** Circunscrita 9 (4,43) 16 (32,00) 0 (0,00) Não circunscrita 194 (95,57) 34 (68,00) 26 (100,00) CALCIFICAÇÕES ** Ausente 173 (85,22) 49 (98,00) 8 (30,77) Presente 30 (14,78) 1 (2,00) 18 (69,33) ECOGENECIDADE *** Heterogêneo 87 (42,86) 28 (56,00) 21 (80,77) Hipoecogênico 11 (57,14) 22 (44,00) 5 (19,23) EF ACÚSTICO POST ** Ausente 82 (40,39) 24 (48,00) 17 (65,38) Reforço 36 (17,33) 21 (42,00) 3 (11,54) Sombra 85 (41,87) 5 (10,00) 6 (23,08) LIMITES ** Abrupto 85 (41,87) 45 (90,00) 21 (80,77) Halo 118 (58,13) 5 (10,00) 5 (19,23) ORIENTAÇÃO **** Não paralela 179 (88,18) 34 (68,00) 22 (84,62) Paralela 24 (11,82) 16 (32,00) 4 (15,38)

47 Artigo para Publicação 47 Ao comparar as características morfológicas ultrassonográficas dos tumores divididos nos subtipos luminal, triplo negativo e HER2, verificou-se que cada subtipo tem a associação a certo grupo de características distintas. Os tumores luminais são pleomórficos, apresentam tecido ao redor espessado, margem não circunscrita, ausência de microcalcificações em seu interior, efeito acústico posterior ausente ou presença de sombra, presença de halo ecogênico e orientação não paralela a pele. Figura 1 Características morfológicas ultrassonográficas de tumor luminal Os tumores triplo negativos se apresentam com forma oval e circunscritos quando comparados aos luminais e HER2. Também apresentam tecido ao redor normal, ausência de microcalcificações em seu interior, efeito acústico posterior ausente ou presença de reforço, limites abruptos e orientação mais paralela a pele.

48 Artigo para Publicação 48 Figura 2 Características morfológicas ultrassonográficas de tumor triplo negativo Os tumores HER2 positivo são pleomórficos, apresentam tecido ao redor normal, margem não circunscrita, presença de microcalcificações em seu interior, heterogêneos, ausência de efeito acústico posterior, limites abruptos e orientação não paralela a pele. Figura 3 Características morfológicas ultrassonográficas de tumor HER2 positivo Os tumores luminais foram, por sua vez, divididos nos subgrupos: luminal A, luminal B e luminal híbrido. Assim, das 203 lesões luminais, 76 (37,43%) pertenciam ao subgrupo luminal A, 93 (45,81%) pertenciam ao subgrupo luminal B e 34 (16,76%) pertenciam ao subgrupo luminal híbrido.