Extração Sólido-Líquido de Compostos Fenólicos em Casca de Manga. Operações Unitárias

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1 LICENCIATURA EM BIOTECNOLOGIA Extração Sólido-Líquido de Compostos Fenólicos em Casca de Manga Operações Unitárias Docente: Inês Seabra ARLINDO CIMA /JOÃO PIRES /JÚLIO PIRES de janeiro de 2018

2 ÍNDICE ÍNDICE... 1 RESUMO INTRODUÇÃO MANGIFERA INDICA L COMPOSTOS FENÓLICOS DESCRIÇÃO GERAL PRESENTES NA MANGIFERA INDICA L EXTRAÇÃO SÓLIDO-LÍQUIDO DESCRIÇÃO GERAL FATORES QUE PODEM INFLUENCIAR NA EFICIÊNCIA OBJETIVOS MATERIAIS E MÉTODOS PREPARAÇÃO DA MATÉRIA-PRIMA E DETERMINAÇÃO DA HUMIDADE PELO MÉTODO GRAVIMÉTRICO MATERIAIS: PROCEDIMENTO EXTRAÇÃO SÓLIDO-LIQUIDO MATERIAIS: PROCEDIMENTO: AFERIÇÃO DO RENDIMENTO DE EXTRAÇÃO: TEOR DE COMPOSTOS FENÓLICOS NO EXTRACTO MATERIAIS: SOLVENTES E PADRÃO UTILIZADOS: PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES: PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS PARA ANÁLISE ESPECTROFOTOMÉTRICA: CONSTRUÇÃO DA RETA DE CALIBRAÇÃO ANÁLISE DAS AMOSTRAS DE EXTRATO: ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (TESTE DE CAPTURA COM DPPH) MATERIAIS: SOLVENTES E REAGENTES: PROCEDIMENTO: RESULTADOS E DISCUSSÃO: GERAL: DESCRIÇÃO ESPECÍFICA: CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXO PROTOCOLO 1: ANEXO PROTOCOLO ANEXO PROTOCOLO

3 ANEXO PROTOCOLO ANEXO EQUAÇÕES: ANEXO TABELA 1 - DETERMINAÇÃO DA HUMIDADE DA MATÉRIA-PRIMA TABELA 2 - DETERMINAÇÃO DO RENDIMENTO DAS EXTRAÇÕES TABELA 3 - CURVA PADRÃO DE ÁCIDO GÁLICO FIGURA 1 - CURVA PADRÃO DE ÁCIDO GÁLICO TABELA 4 - TEOR DE FENÓLICOS NOS EXTRATOS TABELA 5-ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS (DPPH) TABELA 6-CONTROLO DO ENSAIO DE DPPH

4 RESUMO A planta Mangifera indica L., mais conhecida como a manga, tem origem nas florestas do sul e sudeste da Ásia, mais precisamente na Índia. A produção de manga em Portugal é pouco significativa, devido as condições climatéricas. A principal aplicação/utilização da manga é para a alimentação humana, mas este fruto possui também qualidades terapêuticas, já que ajuda a tratar de anemias, bronquites, feridas e tosse. Possui propriedades diuréticas e é rica em calorias. Neste trabalho prático foi realizada uma atividade laboratorial repartida por quatro protocolos laboratoriais fornecidos pela docente Inês Seabra de 2012, onde foi realizado o rendimento de extração, o teor de compostos fenólicos e a atividade antioxidante relativos à casca manga, onde variámos o tempo, a concentração do solvente e razão entre o sólido e o solvente. No final verificou-se que existe uma elevada concentração fenólica mesmo que tenha sido feita uma diluição das soluções dos estratos. Foi constatado que os melhores solventes são os que são constituídos por uma porção de H 2O e EtOH. Para a confirmação destes resultados será necessário proceder á realização de mais ensaios estudando mais especificamente as condições a variar. 3

5 1-INTRODUÇÃO 1.1- Mangifera indica L. A planta Mangifera indica L., mais conhecida como a manga, tem origem nas florestas do sul e sudeste da Ásia, mais precisamente na Índia. Este fruto foi introduzido em África e no Brasil. O nome da fruta vem da palavra do idioma malaiala manga e foi popularizada na Europa pelos portugueses. A árvore deste fruto é de grande porte e pode chegar até 30 metros de altura, com uma copa densa. Possui folhas de coloração avermelhada quando é jovem e posteriormente verdeescura. As suas flores são pequenas, róseas ou esverdeadas. O fruto tem uma forma alongada e ovoide, já a casca é esverdeada com algumas manchas pretas, amarelas ou róseas quando está maduro. Possui uma polpa carnosa, suculenta, comestível e fibrosa, com cor amarela. A semente é achatada de tamanho variável. Geralmente aceitam qualquer tipo de solo, mas adaptam-se melhor em regiões de clima quente e chuvoso. O período ideal para o plantio é nas estações mais chuvosas. A propagação é feita por sementes ou enxertia. A produção mundial deste fruto é feita essencialmente em regiões de clima tropical e subtropical: sul da Ásia, América do Sul, América Central e nas porções sul e central de África e Austrália. O grande comércio deste fruto é dominado atualmente pela Índia, devido ao seu volume gigantesco de produção. A produção de manga em Portugal é pouco significativa, devido as condições climatéricas do país não serem as mais apropriadas para o crescimento e desenvolvimento da árvore do fruto, mas estão a ser desenvolvidas técnicas para o desenvolvimento do fruto em países mediterrânicos. A principal aplicação/utilização da manga é para a alimentação humana, mas este fruto possui também qualidades terapêuticas, já que ajuda a tratar de anemias, bronquites, feridas e tosse. Possui propriedades diuréticas e é rica em calorias. Falando agora da sua composição química (Tabela 2), este fruto é riquíssimo em vitamina A (principalmente quando está maduro) e contém quantidades significativas de vitaminas do complexo B e vitamina C, para além de alguns sais minerais, como o ferro e o potássio, por exemplo. Este fruto é rico em compostos fenólicos (Adaptado de ROSSETTO, s.d.). 4

6 Tabela 1-Classificação botânica da Mangifera Indica L (WIKIPEDIA, 2017) Tabela 2-Composição química da Mangifera Indica L (SILVA; CALISTO, 2013) 1.2-Compostos fenólicos Descrição Geral Quanto aos compostos fenólicos podem ser definidos como substâncias possuidoras de anel aromático com ou mais grupos de hidroxilos e têm sido submetidos a variados e intensivos estudos devido a sua direta influencia na qualidade dos alimentos. Englobam uma gama enorme de substâncias, entre elas os ácidos fenólicos, os quais, devido á suas composições químicas possuem propriedades antioxidantes (SOARES, 2002). Com a estrutura de um anel aromático ligado diretamente a apenas um grupo hidroxilo, é constituído o composto fenólico mais comum, o fenol simples. Relativamente á existência destes compostos na natureza, podem ser classificados como: pouco e largamente distribuídos na natureza. No conjunto com pouca distribuição existe um numero muito restrito. No grupo que abrange a grande maioria (larga distribuição), encontram-se aqui os fenólicos geralmente de todo o reino vegetal (SOARES, 2002). Os compostos fenólicos podem ser classificados em vários grupos consoante o número de carbonos presentes na molécula (Tabela 3) (SHAHIDI, 2004). 5

7 Tabela 3 - Classificação de alguns compostos fenólicos (adaptado de Shahidi & Naczk, 2004). Estrutura C6 Classe Fenólicos Simples C6 C1 C15 Ácidos fenólicos e compostos relacionados Flavonas C6, C10, C14 Quinonas Taninos Oligómeros e Polímeros Atualmente existem vários estudos realizados com legumes, frutas, sementes, cascas e madeira, que revelam a presença de compostos fenólicos com propriedades antioxidantes e anticancerígenas (MOURE, 2000), e de acordo com King (1999) citado por Angelo (2006), de todos os compostos fenólicos, destacam-se os flavonóides, os ácidos fenólicos e os taninos como os mais comuns antioxidantes fenólicos de fonte natural. Entre as componentes da planta na qual se insere as funções de crescimento e desenvolvimento os flavonoides apresentam um especial destaque. Muitas destas funcionalidades são essenciais para a sobrevivência, como a atração de animais polinizadores e dispersores de sementes, estimulação da bactéria Rhizobium para a fixação de azoto e assimilação de minerais provenientes das folhas. Os flavonoides também são conhecidos por aumentarem a tolerância das plantas frente a fatores abióticos e são empregados como agentes de defesa contra herbívoros e patógenos (ANDERSON, 2005). Os flavonoides possuem uma estrutura básica formada por C6-C3-C6, o difenil propano (Figura 1), sendo os compostos mais diversificados do reino vegetal. Consistem em dois anéis aromáticos interligados por três carbonos que geralmente forma uma estrutura heterocíclica oxigenada (BRAVO, 1998). Figura 1 - Difenil propano- Estrutura geral de um flavonoide com os anéis A, B e C e sistema de numeração para diferenciação dos carbonos (ZIELINSKI, 2005). Os ácidos fenólicos podem ser então subdivididos em 3 grupos. O primeiro é composto pelos ácidos benzoicos (Figura 2), sendo que a estrutura possui sete átomos de carbono (C6- C1). O segundo é constituído pelos ácidos cinâmicos (Figura 3), com nove átomos de carbono (C6-C3) (SOARES, 2002). 6

8 R1=OH Ácido Salicilico; R1=R4=OH Ácido Gentísico; R3=OH Ácido p-hidroxibenzóico; R2=R3=OH Ácido Protocatequínico; R2=OCH3; R3=OH Ácido Vanilico; R2=R3=R4=OH Ácido Gálico; R2=R4 = OCH3; R3=OH Ácido Siríngico R1=R2=R3=R4=H Ácido cinâmico; R1=OH Ácido o- cumárico; R2=OH Ácido m-cumárico; R3=OH Ácido p- cumárico; R2=R3=OH Ácido cafeico; R2=OCH3; R3=OH Ácido ferúlico; R2=R4=OCH3; R3=OH Ácido sinápico Figura 2-Ácidos benzoicos Figura 3-Ácidos cinâmicos Por fim a cumarinas (Figura 4) formam o terceiro grupo e são derivadas do ácido cinâmico por ciclização da cadeia lateral do ácido o-cumárico (SOARES, 2002). Figura 4-Cumarinas Os compostos fenólicos são constituintes muito importantes no mundo hortícola e frutícola. Através da quantificação destes conseguimos obter informações a respeito da atividade antioxidante, qualidade do alimento e dos potenciais benefícios á saúde (TALCOTT, et al, 2003). Segundo Da Mota (2011), os taninos integram, em conjunto com os flavonóides, os compostos fenólicos responsáveis pela adstringência e gosto amargo das plantas. São dotados de propriedades biológicas diversas, relacionadas com o seu potencial como quelantes iónicos e agentes precipitantes de proteínas e antioxidantes. Compreendem ainda, compostos polifenólicos solúveis em água, que podem ter uma massa molecular elevada e são divididos, de acordo com a sua estrutura e origem biogenética, em dois grupos principais: taninos hidrolisáveis (Figura 8-(e) e (f)) e condensados (Figura 8-(g)). Os taninos hidrolisáveis são ésteres de ácidos fenólicos e açúcares, em geral, glucose e dividem-se em galotaninos 7

9 (açúcares esterificados com ácido gálico) e elagitaninos (açúcares esterificados com ácido elágico). A hidrólise origina ácido gálico (Figura 8-(a)), ácido elágico (Figura 8-(b)) ou o seu derivado, o ácido hexahidroxidifénico (Figura 8-(c)) e o respectivo resíduo de monossacarídeo. Os taninos condensados (proantocianidinas) são polifenóis constituídos por catequina e leucoantocianidina unidas entre si por ligações carbono-carbono que só em condições especiais são clivadas. Figura 8- Exemplo de alguns compostos fenólicos: (A) ácido gálico; (B) ácido elágico; (C) ácido hexahidroxidifénico (HHDP); (D) catequina; (E) estrutura típica de um elagitanino; (F) estrutura típica de um galotanino; (G) e estrutura típica de uma proantocianidinas (Adaptado de Mota, 2011) Presentes na Mangifera indica L. De acordo com (BERARDINI, et al, 2005) e (RIBEIRO, et al, 2008), a manga (Mangifera indica L.) têm presente na constituição da sua casca cerca de seis compostos fenólicos, são eles: mangiferina, isomangiferina, quercetina diglicosídeo, quercetina 3-O-glucosídeo e canferol 3-O-glucosídeo. A mangiferina (Figura 5) e derivados (isomangiferina) possuem várias atividades como antioxidante, imunomodulatória e anti-inflamatória. Figura 5-Mangiferina 8

10 Quercetina (Figura 6) é um flavonoide natural que possui propriedades farmacológicas, tais como anti-inflamatória, anti carcinogénica (atua no sistema imunológico), antiviral, influencia na inibição de cataratas em diabéticos, anti-histamínicas (antialérgicas), cardiovascular, entre outras atividades. No caso da manga são encontrados o quercetina diglicosídeo, quercetina 3- O-glucosídeo (Figura 7). Figura 6-Quercetina Figura 7- Quercetina 3-O-glucosídeo Canferol (Figura 8) é um flavonol natural, família dos flavonoides, que está presente em diversos alimentos derivados de vegetais e frutos. No seu estado puro, o canferol é um sólido cristalino de coloração amarelada, com um ponto de fusão alto comparativamente com a água ( ºC), ligeiramente solúvel em água e fortemente solúvel em etanol aquecido e éteres. Do ponto de vista fisiológico, o canferol age como um antioxidante ao reduzir o stress oxidativo e vários estudos sugerem que o consumo de canferol pode reduzir o risco de vários cancros em humanos. Na manga esta presente um derivado da estrutura original, o canferol 3- O-glucosídeo (Figura 9). Figura 8- Canferol Figura 9- Canferol 3-O-glucosídeo 1.3-Extração sólido-líquido Descrição Geral A operação de extração é uma operação de separação/purificação muito comum a nível industrial. Nesta operação, a separação do soluto da mistura de alimentação é promovida pela adição de outro composto, designado por solvente. 9

11 O conceito de extração aplica-se a alimentações sólidas ou líquidas, às quais se pretende retirar o soluto, seja para o obter num estado mais puro por constituir o produto objeto do processo, seja para remover impurezas (Química, 2016). A extração possui um vasto campo de aplicação nas análises de fármacos, no tratamento de minérios, mas também na indústria alimentar, de cosmética e na produção de óleos essenciais, assim como na purificação de correntes efluentes com vista a retirar contaminantes indesejados e tóxicos. Os principais mecanismos de separação baseiamse nos seguintes processos: adsorção, partição (fase normal e reversa), troca iônica e exclusão. Esses mecanismos estão associados a processos químicos, físicos e mecânicos que atuam durante a separação. Dentre as principais forças químicas e físicas atuantes entre as moléculas do soluto e do solvente, destacam-se as ligações de hidrogénio, interações dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido e interações iônicas (Jardim, 2010). É também de realçar que existem diversos fatores que podem influenciar o rendimento de uma extração nomeadamente: a temperatura, a composição do solvente, o tamanho das partículas, o tempo de retenção, o gradiente de concentração, o ph e a agitação do meio (Seabra, 2015). Figura 10- Processo de filtração Fatores que podem influenciar na eficiência Vinculados ao material: quantidade, natureza, teor de humidade, tamanho das partículas; Vinculados ao líquido: escolha do solvente, seletividade e quantidade; Vinculados ao sistema: temperatura, agitação, ph, tempo de extração. Estes fatores têm influência no rendimento da extração e consequentemente na leitura final do teor de antioxidantes. De acordo com Siqueira et al. (1997) o antioxidante é qualquer substância que, quando presente em baixas concentrações, comparado ao substrato oxidante, retarda ou inibe o processo de oxidação. Quanto à determinação do teor de compostos fenólicos totais é feita através do método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau onde se utiliza o ácido gálico como padrão de referência. 10

12 2-OBJETIVOS Com a presente atividade experimental pretendeu-se averiguar se a casca de Mangifera indica L. é ou não matéria-prima viável para a extração de compostos fenólicos, recorrendo à operação unitária extração sólido-líquido convencional. Pretendeu-se também estudar o efeito da composição do solvente (mistura EtOH e H2O) e tempo com a finalidade de determinar quais as condições experimentais testadas eram mais favoráveis à obtenção de compostos fenólicos como á atividade antioxidante (teste de captura com DPPH) desta matéria-prima. 3-MATERIAIS E MÉTODOS Foram utilizados os protocolos (Nº1, Nº2, Nº3 e Nº4) e respetivamente escritos pela docente da unidade curricular, Inês Seabra em No decorrer da atividade existiram algumas alterações e ajustes. Serão então indicadas abaixo os ajustes/alterações feitas relativamente ao protocolo inicial (Anexo 1, 2, 3, 4: Protocolos Originais) Preparação da matéria-prima e determinação da humidade pelo método gravimétrico. Para a obtenção correta da nossa matéria-prima (casca de manga), foi necessário extraí-la da polpa e caroço. De seguida foi triturado de modo a obter um granulado muito fino, pois existiu por parte dos alunos uma previa secagem em casa Materiais: Matéria prima triturada; Placas de Petri sem tampa (3); Espátula; Exsicador; Estufa (aproximadamente 103 ºC); Balança analítica (4 casas decimais); Caneta de acetato Procedimento Colocou-se as placas de Petri na estufa a cerca de 103 ºC durante meia hora (30 minutos), para que estas secassem devidamente; 2. De seguida as placas foram removidas da estufa, colocadas num exsicador, deixando-as arrefecer até atingir a temperatura ambiente; 3. Identificou-se com caneta de acetato as placas (3) e anotou-se a sua respetiva massa. A cada placa foi adicionada aproximadamente 0,5 gramas de amostra;

13 4. Por último as placas foram colocadas novamente na estufa a 103 ºC. Após 2 horas retiraram-se as placas da estufa, deixando-se arrefecer no exsicador antes de proceder a nova pesagem (no nosso constatou-se que a massa inicial/ húmida era a mesma que a massa final/ seca, devido a ter sido feita uma prévia secagem em casa dos alunos, como já foi mencionado). 5. Com a junção de todos os dados obtidos como se pode observar no Anexo 3- Tabela 1 procedeu-se então ao cálculo da humidade de cada uma das amostras (Equação 1-Anexo 2), como também o desvio padrão e coeficiente de variação dos valores de humidade obtidos (Equação 2-Anexo 2) Extração sólido-liquido. Relativamente extração sólido-liquido, o procedimento realizou-se de forma diferente ao que está descrito no protocolo (Nº2-Extracão sólido-líquido) Materiais: Frascos de plástico, previamente etiquetados, para armazenamento dos extratos (6); Copos (6); Matéria-prima; Micro-pipeta; Filtro; Funil de Vidro; Balança analítica; Tanque de Banho-Maria termoestatizado; Caneta de acetato; Provetas; Eppendorfs; Suporte para eppendorfs; Cronómetro; EtOH; H2O. 12

14 3.2.2-Procedimento: 1. De modo a avaliar diferentes condições experimentais, elaborou-se o seguinte plano de extração (Tabela 4), para o mesmo equipamento, copo em banho termoestatizado. Tabela 4-Plano de extração Matéria-prima Solvente Tempo (min.) Razão sólido:solvente (m/v) H2O 45 1:20 EtOH:H2O (25:75) 45 1:20 EtOH:H2O (50:50) 45 1:20 Manga(Mangifera Indica ) EtOH:H2O (75:25) 45 1:20 EtOH:H2O (100) 45 1:20 EtOH:H2O (50:50) 30 1:20 2. Em primeiro lugar, foi montado o equipamento de extração, tanque para banho termoestatizado para aquecer até a temperatura pretendida (40ºC). 3. Em seguida, identificaram-se os copos segundo o plano de extração (Tabela 4) e colocou-se em cada um, 1 g de matéria-prima e cerca de 20 ml de solvente de acordo com as razões sólido: solventes definidos no plano de extração (Tabela 4). Iniciou-se as seis extrações, colocando o copo respetivo a cada extração no tanque para banho termoestatizado a 40 ºC e iniciou-se a contagem do tempo. Ao fim de 30 minutos, retirou-se o copo 6 (EtOH: H2O 50/50), de modo a estudar a variável tempo. 4. Os extratos obtidos foram, então, filtrados e armazenados em frascos devidamente rotulados Aferição do rendimento de extração: 5. Determinou-se, em primeiro lugar, o volume de extrato obtido na extração com o auxílio de uma proveta. 6. Em seguida, pesaram-se 18 eppendorfs na balança analítica e pipetaram-se para os mesmos, amostras de 1,5 ml de cada extrato, em triplicado. 7. As amostras nos eppendorfs foram colocadas na estufa com a tampa aberta, a 40ºC, durante sensivelmente uma semana, até que o solvente evaporasse por completo. 13

15 8. Por fim, foram pesados os eppendorfs com o extrato, em princípio, já sem nenhum vestígio de solvente. 9. Calcularam-se então as massas de extrato correspondentes ao volume de extrato do eppendorfs e ao volume total de extrato obtido, utilizando as Equações (3) e (4), respetivamente do Anexo 5. Com estes valores, foi possível, através da Equação (5) do Anexo 5, calcular o rendimento das extrações em base seca. Todos os valores aferidos anteriormente podem ser consultados no Anexo 6-Tabela Teor de compostos fenólicos no extracto Materiais: Espátula; Copo de precipitação de 500 ml; Tubos de ensaio; Pipetas automáticas (20 µl; 100 µl; 1mL; 5mL); Espectrofotómetro e cuvetes de plástico; Vórtex; Cronómetro. Solventes e Padrão utilizados: Água destilada; Reagente de Folin; Na2CO3; Etanol; Padrão de composto fenólico (ácido gálico) Preparação das soluções: Foram preparadas previamente, uma solução de carbonato de sódio a 17% (m/v) e uma solução padrão de ácido gálico (3,2 mg de ácido gálico/2 ml de etanol), sendo esta a soluçãomãe de ácido gálico Preparação dos extratos para análise espectrofotométrica: Das 18 amostras secas preparadas em , selecionaram-se 6, garantindo que correspondiam às 6 diferentes extrações efetuadas, sendo as restantes armazenadas para uma eventual necessidade de repetir o ensaio. As amostras selecionadas foram diluídas primariamente com etanol (600 µl) ou água (600 µl) dependendo da sua razão extrato: solvente, recorrendo ao vórtex e ultrassons para garantir a solubilização total dos extratos. 14

16 Por fim ainda procedemos a mais uma diluição devido á concentração do estrato ainda ser muito elevada, ou seja, retiramos para um novo eppendorfs cerca de 200 µl da solução obtida nos eppendorfs anteriores e acrescentamos 600 µl de H2O (diluição 1: 4) Construção da reta de calibração Foram utilizados 6 tubos de ensaio, sendo um deles o "branco", e os restantes referentes à curva de calibração. De seguida foram colocadas, nos tubos de ensaio, entre 0 a 20 μl (0, 4, 8, 12, 16, 20) alíquotas de solução mãe e adicionou-se etanol até perfazer um volume de 20 μl. O tubo de ensaio sem solução-mãe representou o "branco". De seguida, adicionaram-se 1580 μl de água destilada a todos os tubos de ensaio e mais 20 μl de água no "branco" para o volume final ser igual aos restantes tubos de ensaio. Iniciou-se a contagem do tempo (auxílio do cronómetro do telemóvel), no momento que se adicionou 100 μl de reagente de Folin-Ciocalteu ao primeiro tubo, o "branco". Passado 30 segundos, adicionaram-se 300 μl da solução de carbonato de sódio e, após agitação, colocouse o tubo em banho termoestatizado a 40ºC, onde permaneceu durante 30 minutos. Este procedimento foi repetido, sequencialmente para os restantes tubos. Foram, então, medidos os valores de absorvância de cada amostra no espectrofotómetro a 765 nm em cuvetes de plástico. Para tal, calibrou-se o espectrofotómetro com a leitura do "branco", fazendo-se em seguida a leitura das restantes amostras. Os valores obtidos podem ser consultados no Anexo 6-Tabela 3. Com estes resultados, procedeu-se à construção da curva de calibração (Anexo 6-Figura 1) Análise das amostras de extrato: A análise das amostras foi feita em triplicado, pelo que foram transferidas três alíquotas (20 μl) de cada amostra previamente diluídas (assim como as amostras em 3.3.4) para tubos de ensaio, perfazendo um total de 18 tubos. De seguida, adicionaram-se 1580 μl de água destilada a todos os tubos de ensaio. Procedeu-se então da maneira referida em Por fim, foi determinado o teor de compostos fenólicos de cada amostra. Para tal recorreuse à equação da reta de calibração e à Equação (7) do Anexo 5, o que permitiu obter o teor de fenólicos expresso em mg EAG/mL de solução. Pelas Equações (8) e (9) do Anexo 5 foi possível calcular o teor de fenólicos expresso em % EAG (m/m) onde se pode observar no Anexo 6-Tabela Atividade antioxidante (teste de captura com DPPH) Materiais: Balança analítica (4 casas decimais); Espátula; Cronómetro (telemóvel); Tubos de ensaio; 15

17 Espectrofotómetro e cuvetes de plástico; Suporte para tubos de ensaio; Pipetas automáticas; Vórtex. Solventes e Reagentes: Água destilada; Etanol; Radical DPPH Procedimento: 1. Inicialmente foi preparada, com uma concentração molar de 0,3 mm, uma solução de DPPH com etanol. Esta solução foi preparada para todos pois seria necessária colocar 1 ml por cada amostra de todos os grupos; 2. De seguida, diluiu-se os extratos em etanol e água destilada (750 µl de etanol a 99.5% e 250 µl H2O); 3. Preparou-se uma solução para cada estrato (com a mesma concentração 21.4 mg/ml) previamente calculada, utilizando um tubo de ensaio com 10 ml com etanol a 75%; 4. No seguimento foram adicionados 2,5 ml da solução de cada extrato em 3 tubos de ensaio de modo a o processo se feito em triplicado; 5. 3 tubos de ensaio foram utilizados como controlo onde foram adicionados 2,5mL de etanol 75%; 6. Também foram feitos brancos, respetivos a cada estrato onde consistia em adicionar 2,5 ml de extrato juntamente com 1 ml de etanol em um novo tubo de ensaio; 7. Foi então ligado o cronómetro do telemóvel e adicionado 1 ml da solução DPPH de 15 em 15 segundos; 8. No final do processo, antes da leitura, foram colocados num local privados de luz. 9. Por fim foram lidas as absorvâncias no espectrofotómetro (Anexo 6-Tabela 5). Com as absorvâncias obtidas foi possível calcular a percentagem de atividade antioxidante (%AA) através da Equação 10 do Anexo 5. 16

18 4-RESULTADOS E DISCUSSÃO: 4.1-Geral: Para avaliar e quantificar os compostos fenólicos presentes na casca de manga, foram considerados o rendimento da extração e o teor de compostos fenólicos dos extratos como também a atividade antioxidante. Em seguida são apresentados os resultados obtidos, sendo que as tabelas auxiliares para a obtenção dos resultados, incluindo a percentagem de humidade das matérias-primas, encontram-se no Anexo Descrição específica: Após a realização da primeira parte da atividade experimental, foi determinada a humidade das amostras de matéria-prima (casca de manga), como a sua média, desvio padrão e consequentemente coeficiente de variação (Tabela 5). Tabela 5 Humidade em percentagem da matéria-prima. Humidade (%) Ensaio Média DP CV 11,6 11,6 9,4 10,9 1,3 11,5 Assim podemos verificar que a matéria-prima apresentava baixa humidade pois, como já referido anterior, existiu uma previa secagem em casa dos alunos, onde o seu valor foi 10,9± 1,3 %, obtendo assim um coeficiente de variação (CV) de 11,5 %. Foi então avaliado o fator tempo e concentração de etanol, nos três processos (rendimento de extração, teor de fenólicos e atividade antioxidante), como podemos observar no Figura 11 que teve como base as Tabelas (2), (4) e (5) presentes no Anexo 6 como já foi referido. Figura 11-Efeito do tempo de extração (minutos) no rendimento de extração, teor fenólico e atividade antioxidante em %. 17

19 Como se pode verificar pelos resultados obtidos na Figura 11 foi obtido um maior rendimento da extração ao fim de 45 minutos (23,8), o que significa que o aumento do tempo de extração compensou relativamente á quantidade de compostos fenólicos extraídos. O menor rendimento aos 30 minutos pode dever-se ao decorrer ainda do processo de extração, ou seja, ainda estão a ser obtidos compostos fenólicos ao fim de 30 minutos. Os valores dos desvios-padrão são 8,1 no tempo de extração de 45 minutos e 9 no tempo de extração 30 minutos. É importante mencionar que o rendimento é razoável, mas baixo, pois na extração inicial, as soluções apresentaram-se muito concentradas o que levou a uma diluição de 1: 4. Relativamente ao teor fenólico, podemos observar que a extração feita a 45 minutos apresenta, ligeiramente, uma concentração superior (13,2 > 12,9). Assim podemos extrapolar que existe um aumento, ainda que seja pequeno, na extração de compostos fenólicos. Este aumento reduzido pode significar que o tempo ótimos de extração foi atingido muito provavelmente no intervalo de tempo minutos. Os valores dos desvios-padrão são 2 e 1,8, respetivos ao aumento do tempo. Por fim a atividade antioxidante, ao longo tempo, apresenta comportamento idêntico á evolução do teor fenólico, sendo que aqui o aumento é muito mais vincado e notório, sendo que, aos 45 minutos de extração apresentava uma percentagem de 61,2 crescendo de 48,1 ao passar de 15 minutos. Os desvios-padrão obtidos são de 7,2 e de 2,8, sendo o primeiro de 30 minutos e o segundo de 45 minutos. Em última análise encontra-se um gráfico (Figura 12), que pretende correlatar o resultado obtidos dos três processos (rendimento de extração, teor de fenólicos e atividade antioxidante) em função da concentração do solvente testado, durante o mesmo tempo (45 minutos). Figura 12-Efeito da composição do solvente no rendimento de extração, teor fenólico e atividade antioxidante em %. No que diz respeito ao rendimento da extração, para todas as razões diferentes de solvente a que obteve melhor resultado foi 25: 75 e 75/25. Para além disso também se pode constatar que quando o solvente é constituído por mistura de H2O com EtOH a rentabilidade é maior 18

20 (excetuando o caso 50:50 devido a erros). Comparativamente aos ensaios puros tanto de água destilada como de etanol é possível verificar uma afinidade similar, ou seja, existem compostos fenólicos muito compatíveis com a água e com o etanol). Na leitura dos teores fenólicos como na atividade antioxidante podemos constatar, apesar de o gráfico não replicar muito bem os acontecimentos que deveriam ter ocorrido, que com o aumento da concentração de EtOH na composição do solvente também deveria existir um aumento progressivo nos valores obtidos, o que não se constatou totalmente e devidamente, pois o que obteve maior percentagem foi 50: 50 decrescendo a partir daí. Estes resultados poderiam ter sido influenciados pelo plano de extração, pois foi decidido que seria 45 minutos nos três processos (rendimento de extração, teor fenólico e atividade antioxidante), enquanto que o tempo ótimo para o processo seria entre minutos, como foi anteriormente mencionado. Apesar de tudo, pode mesmo assim observar-se alguma tendência do aumento dos valores, o que indica que os solventes mais seletivos e adaptados para a extração dos compostos fenólicos da matéria-prima eleita (casca de manga) são os que possuem maior teor etílico. De modo a obter resultados mais conclusivos e concretos seria necessário proceder á realização de mais ensaios. 19

21 5-CONCLUSÃO Com a execução desta atividade experimental composta em quatro parte, foi possível retirar várias conclusões. Desde logo, em primeiro lugar, das condições laboratoriais descritas, as que se aproximam das condições ótimas para a extração variam consoante a matriz vegetal utilizada. Relativamente a casca da manga, o maior teor de compostos fenólicos, 13,2 ± 19, foi obtido utilizando um solvente com razão de EtOH: H2O 50: 50 (v/v) e um tempo de extração de 45 minutos. Assim sendo, a matéria-prima é passível de ser utilizada, uma vez que apresenta bons teores de compostos fenólicos, pelo menos nas condições experimentais analisadas (importante de referir novamente que, após a obtenção do extrato foi necessário fazer uma diluição 1: 4 pois era muito concentrado). A matéria-prima apresenta-se com grande potencial para a aplicação como antioxidante nos alimentos (enriquecimento nutricional), nos cosméticos (retardamento do envelhecimento), como entre outras áreas. Logo, sendo a casca, um resíduo muito abundante e uma fonte de produtos de elevado valor acrescentado, deve ser considerado no desenvolvimento do conceito de biorefinaria aplicada as indústrias. Para que num futuro próximo, a casca de manga, possa ser utlizada como fonte, seria necessário efetuar estudos mais pormenorizados para determinar a natureza dos compostos fenólicos e poder-se-ia testar outras condições laboratoriais, como por exemplo o efeito equipamento de extração e a temperatura de extração, e assim encontrar formas de aumentar o teor de compostos fenólicos nos extratos. Concluímos assim que, é possível afirmar que os objetivos delineados inicialmente foram cumpridos parcialmente com êxito, pois foi possível extrair e quantificar os compostos fenólicos através das diferentes condições experimentais descritas, com rendimentos e teores de compostos fenólicos bastante satisfatórios. Pode-se afirmar ainda que alguns resultados não são fiáveis, visto que os valores de coeficientes de variação referentes aos respetivos ensaios são superiores em alguns casos a 15, sendo que seria necessário repetir, novamente, os respetivos protocolos experimentais. 20

22 6-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARABBI, P.R. et al.; (2004); Flavonoids in vegetable foods commonly consumed in Brazil and estimated ingestion by the Brazilian population; Journal of Agricultural and Food Chemistry, Easton, v.52, p [Consult.14 out.2017] ANDERSEN, O.M.; MARKHAM, K.R.; (2005); Flavonoids: chemistry, biochemistry and applications; Boca Raton:CRC Press; chap 8, p [Consult.14 out.2017] ANGELO, P.M.; JORGE, N.; (2007); Compostos fenólicos em alimentos: uma breve revisão. Revista do Instituto Adolfo Lutz; ISSN [Consult.14 out.2017] BRAVO, L.; (1998); Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolismo na nutricional significance; Nutricion Reviews, New York, v.56, n.11, p [Consult.14 out.2017] BERARDINI, N. et al.; (2005); Screening of mango (Mangífera indica L.) cultivars for their contentes of flavonol O- and xanthone C- glysides, anthocyanins and pectin; Journal of Agricultural and Food Chemistry; Easton; v.53, p [Consult.14 out.2017] DA MOTA, I. F.; (2011); Extração em base aquosa de compostos polares da casca de Eucalyptus globulus na perspetiva da sua recuperação; Universidade de Porto; Dissertação de mestrado. [Consult.13 out.2017] DA SILVA, D.A.; CALISTO, S.M.M.; (2013); Avaliação Físico-Química e sensorial da manga tommy atkins submetida à desidratação; Universidade Tecnológica Federal do Parana- Curso Superior de Tecnologia em Alimentos; Disponível em:« pdf». [Consult.14 out.2017] JARDIM, I. C.; (2010): Extração em Fase Sólida: Fundamentos Teóricos e Novas Estratégias para Preparação de Fases Sólidas; p [Consult.14 out.2017] KING, A.; YOUNG, G. ; (1999); Characteristics and occurrence of phenolic phytochemicals; Journal of the American Dietetic Association; p [Consult.14 out.2017] LITZ, R.E.; (2009); The Mango: Botany, Production and Uses (2nd edition); ISBN [Consult.14 out.2017] LUTHRIA, D.L.; (2008); Influence of experimental conditions on the extraction of phenolic compounds from parsley (Petroselinum crispum) flakes using a pressurized liquid extractor; Food Chemistry, London, GB, 107(2), p [Consult.14 out.2017] MARKHAM, K.R.; (2005); Flavonoids: chemistry, biochemistry and applications; Boca Raton: CRC Press, cap 8, p [Consult.14 out.2017] MITIC, M.N. et al.; (2010); Antioxidant capacities and phenolic levels of different varieties of Serbian white wines; Molecules, Basel, Switzerland, 15(3), [Consult.14 out.2017] NEVES, L.C. et al.; (2009); Determinação da atividade antioxidante e do teor de compostos fenólicos e flavonoides totais em amostras de pólen apícola de Apis melífera; Braz. J. Food Technol., VII BMCFB; Disponível em:« [Consult.14 out.2017] 21

23 PINELO, M.; SINEIRO, J.; MARÍA, J. N.; (2005); Mass transfer during continuous solid liquid extraction. Escuela Técnica Superior de Ingeniería; Universidad de Santiago de Compostela. [Consult.14 out.2017] QUÍMICA, F. D.; (2016); Retrieved from: Portal Laboratórios Virtuais de Processos Químicos; Disponível em:« _content&task=view#inicio». [Consult.14 out.2017] RIBEIRO, S.M.R. et al.; (2008); Phenolic compounds and antioxidant capacity of Brazilian mango (Mangifera indica L.) varieties; Food Chemistry, Barking, v.110, p [Consult.14 out.2017] ROSSETTO, C.J.; (s.d.); Manga; Portal São Francisco; Disponível em:« [Consult.14 out.2017] SEABRA, I. J.; (2015); Metabólitos secundários das plantas; Operações Unitárias em Biotecnologia; Instituto politécnico de Coimbra: Escola Superior Agrária de Coimbra; Apresentação em power point. [Consult.14 out.2017] SHAHIDI, F.; NACZK, M.; (2004); Phenolics in Food and Nutraceutical; Boca Raton: CRC press; p ; ISBN [Consult.14 out.2017] SOARES, S.E.; (2002); Ácidos fenólicos como antioxidantes; Revista de Nutrição, Campinas, v.15, n.1, p [Consult.14 out.2017] TALCOTT, S.T. et al.; (2003); Phytochemical composition and antioxidante stability of fortified yellow passion fruit (Passiflora edulis). Journal of Agricultural and Food Chemistry, Easton, v.51, p [Consult.14 out.2017] WKIPEDIA; (s.d.); Mangifera indica; Disponível em:« [Consult.14 out.2017] ZIELINSKI, A.; (2015); Avaliação dos compostos fenólicos e atividade antioxidante in vitro de chás: classificação, modelagem e otimização por técnicas quimiométricas; State University of Ponta Grossa; Department of Food Engineering; Disponível em:« [Consult.14 out.2017] 22

24 7-ANEXO Protocolo 1: 23

25 8-ANEXO Protocolo 2 24

26 25

27 9-ANEXO Protocolo 3 26

28 27

29 28

30 10-ANEXO Protocolo 4 29

31 30

32 11-ANEXO Equações: 31

33 12-ANEXO Tabela 1 - Determinação da humidade da matéria-prima. Matéria-prima Ensaio Caixa (g) Caixa + Amostra húmida (g) Caixa + Amostra seca (g) Amostra húmida (g) Amostra seca (g) Humidade (%) Ensaio Média DP CV 1 45,9 46,3 46,3 0,4 0,4 11,6 Manga(Mangifera Indica ) 2 48,1 48,6 48,5 0,5 0,5 11,6 10,9 1,3 11,5 3 46,4 47,0 47,0 0,6 0,6 9, Tabela 2 - Determinação do rendimento das extrações. Rendimento de extracção (%) Matéria-prima Solvente Tempo (min.) Razão sólido:solvente (m/v) MP base húmida extracção (g) Volume de extracto (ml) Volume alíquota (ml) Ensaio Eppendorf (g) Epp. + extracto seco (g) Extracto seco alíquota (g) xtracto seco total (g MP base seca (g) Ensaio Média DP CV 1,0 12 1,5 1 0,9139 0,9526 0,0387 0,3096 0,9 34,7297 H2O 45 1:20 1,0 12 1,5 2 1,0611 1,0914 0,0303 0,2424 0,9 27, ,2 4,9 16,8 1,0 12 1,5 3 1,0627 1,0912 0,0285 0,2280 0,9 25,5761 1,0 13,5 1,5 1 0,9127 0,9455 0,0328 0,2952 0,9 33,1144 EtOH:H2O (25:75) 45 1:20 1,0 13,5 1,5 2 1,0565 1,0872 0,0307 0,2763 0,9 30, ,4 1,6 5,0 1,0 13,5 1,5 3 1,0444 1,0742 0,0298 0,2682 0,9 30,0856 1,0 13,5 1,5 1 0,8885 0,9173 0,0288 0,2592 0,9 29,0760 EtOH:H2O (50:50) 45 1:20 1,0 13,5 1,5 2 1,0583 1,0726 0,0143 0,1287 0,9 14, ,8 8,1 34,1 Manga(Mangifera Indica ) 1,0 13,5 1,5 3 1,06 1,0876 0,0276 0,2484 0,9 27,8645 1,0 16 1,5 1 0,8981 0,933 0,0349 0,3723 0,9 41,7594 EtOH:H2O (75:25) 45 1:20 1,0 16 1,5 2 1,0469 1,0712 0,0243 0,2592 0,9 29, ,8 7,8 23,8 1,0 16 1,5 3 1,059 1,082 0,023 0,2453 0,9 27,5205 1,0 17 1,5 1 0,9475 0,9754 0,0279 0,3162 0,9 35,4701 EtOH:H2O (100) 45 1:20 1,0 17 1,5 2 1,0494 1,064 0,0146 0,1655 0,9 18, ,0 9,2 36,8 1,0 17 1,5 3 1,0396 1,056 0,0164 0,1859 0,9 20,8498 1,0 14 1,5 1 0,9161 0,9417 0,0256 0,2389 0,9 26,8026 EtOH:H2O (50:50) 30 1:20 1,0 14 1,5 2 1,0409 1,0623 0,0214 0,1997 0,9 22, ,1 3,4 14,7 1,0 14 1,5 3 1,0491 1,0683 0,0192 0,1792 0,9 20, Tabela 3 - Curva padrão de ácido gálico. Ponto Volume sol. ác. gálico Massa ác. gálico Conc. ácido gálico (ul) nos 20 ul (ug) nos 20 ul (mg/ml) Abs 765 nm Ord. Origem Declive 1 4 4, ,2047 0, , ,4093 0, , ,6140 0,564 3,87784E-02 1, , ,8187 0, , ,0233 0,807 32

34 12.4-Figura 1 - Curva padrão de ácido gálico. 1,2000 1,0000 0,8000 y = 1,11004E+00x + 3,87784E-02 R² = 9,50764E-01 0,6000 0,4000 0,2000 0, ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Solução de ácido gálico - x mg / ml EtOH 12.5-Tabela 4 - Teor de fenólicos nos extratos. Matéria-prima Manga(Mangifera Indica ) Solvente Tempo H2O 45 ETOH:H2O(25/75) 45 ETOH:H2O(50/50) 45 ETOH:H2O(75/25) ETOH:H2O(100/0) ETOH:H2O(50/50) 30 Massa extracto epp. (mg)*1000 Vol. Solv. epp. (ml) Conc. Solução Teor de fenólicos Teor de fenólicos (%) (mg EAG/mg extracto * 100) Amostra Abs 765 nm no epp. (mg/ml)-1/4 (mg EAG/mL sol.) Ensaio Média DP CV 38,7 1,2 8, ,415 0,499 6,195 38,7 1,2 8, ,421 0,506 6,277 6,3 0,1 2,1 38,7 1,2 8, ,434 0,521 6,456 32,8 1,2 6, ,336 0,412 6,026 32,8 1,2 6, ,307 0,380 5,555 5,8 0,2 4,1 32,8 1,2 6, ,325 0,400 5,847 28,8 1,2 6, ,782 0,907 15,114 28,8 1,2 6, ,67 0,783 13,042 13,2 1,8 13,8 28,8 1,2 6, ,585 0,688 11,469 34,9 1,2 7, ,481 0,573 7,877 34,9 1,2 7, ,528 0,625 8,594 8,7 0,8 9,7 34,9 1,2 7, ,591 0,695 9,556 27,9 1,2 5, ,437 0,524 9,013 27,9 1,2 5, ,314 0,387 6,664 7,6 1,2 16,4 27,9 1,2 5, ,338 0,414 7,122 25,6 1,2 5, ,015 0,055 1,039 25,6 1,2 5, ,514 0,609 11,425 12,9 2,0 15,7 25,6 1,2 5, ,651 0,761 14,277 33

35 12.6-Tabela 5-Atividade antioxidante dos extratos (DPPH). % Atividade Antioxidante Matéria-Prima Solvente Tempo Amostra Absorvância Ensaio Média D.P C.V 1 0,868 15,837 H2O ,793 23, ,836 18,940 19,295 3,649 18,912 B 0 X 1 0,626 48,028 ETOH:H2O(25/75) ,58 52, ,599 50,646 50,388 2,241 4,448 B 0,09 X 1 0,44 58,112 ETOH:H2O(50/50) ,399 62, ,385 63,445 61,215 2,771 4,527 Manga(Mangifera Indica) B 0,008 X 1 0,564 45,314 ETOH:H20(75/25) ,447 56, ,701 32,030 44,667 12,327 27,597 B 0 X 1 0,612 41,047 ETOH:H20(100/0) ,573 44, ,612 41,047 42,308 2,183 5,160 B 0,004 X 1 0,471 54,331 ETOH:H2O(50/50) ,517 49, ,617 40,175 48,125 7,238 15,039 B 0 X 12.7-Tabela 6-Controlo do ensaio de DPPH. Abs Controlo Ensaio Média D.P C.V 1 1, ,039 1, , , ,964 34