Caracterização Estrutural das Galactomananas do Café Verde e Torrado - Ocorrência de Arabinogalactoglucomananas Acetiladas

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1 Caracterização Estrutural das Galactomananas do Café Verde e Torrado - corrência de Arabinogalactoglucomananas Acetiladas NUNES, Fernando M., 1* DMINGUES, M. Rosário, 2 CIMBRA, Manuel A. 2 1 Departamento de Química, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal. 2 Departamento de Química, Universidade de Aveiro, Aveiro, Portugal. fnunes@utad.pt Resumo As galactomananas são o polissacarídeo mais abundante das infusões de café torrado. Com o objectivo de determinar a estrutura detalhada destes polissacarídeos, foi desenvolvida uma técnica selectiva baseada na cromatografia de ácido aminofenilborónico imobilizado em Sepharose-6B que permitiu a purificação das galactomananas presentes em infusões de café verde e em cafés submetidos a diferentes graus de torra. A análise por espectrometria de massa utilizando como fonte de ionização o electrospray (ESI-MS) das fracções obtidas após hidrólise enzimática específica com endo-β-mananase permitiu determinar que as mananas das infusões dos cafés verdes e torrados se encontram acetiladas (11 e 8 mol, respectivamente) na posição -2 dos resíduos manose. Também foram detectados resíduos de manose duplamente acetilados e consecutivamente acetilados. As mananas dos cafés verde e torrados contêm resíduos de galactose como cadeia laterais (1 e 3 mol, respectivamente). Neste trabalho foram detectados, inequivocamente, e pela primeira vez, em todas as infusões de café, resíduos de arabinose como cadeias laterais das galactomanananas (2 mol no café verde e <,9 mol nos torrados). A análise por metilação, a hidrólise específica com glicosidases e a análise dos oligossacarídeos reduzidos e metilados por GC-EI-MS permitiu determinar pela primeira vez que as mananas das infusões de café verde contêm na sua cadeia principal resíduos de glucose em ligação β-(1 4) (6 mol), mostrando que se tratam de arabinogalactoglucomananas acetiladas. Nas infusões de café torrado os resíduos glucose (2) foram detectados apenas como resíduos do terminal redutor da cadeia de manana. Palavras-chave: Café; torra, galactomananas, galactoglucomananas, acetilação, ESI-MS/MS 1. Introdução café é uma das bebidas mais consumidas em todo o mundo. Nas infusões de café, os polissacarídeos são o componente mais abundante do material de alto peso molecular. Eles são responsáveis pela viscosidade da bebida (Ehlers, 198), contribuem para a sensação cremosa sentida durante a degustação conhecida como corpo (Illy e Viani, 1995) e são responsáveis pela estabilidade da espuma do café expresso (Nunes et al., 1997) e pela retenção de substâncias voláteis que contribuem para o aroma da bebida (Mayer, 1975). As galactomananas representam cerca de 7 dos polissacarídeos das infusões de café torrado e, com as arabinogalactanas do tipo II, são os seus principais polissacarídeos (Nunes e Coimbra, 21, 22a,b). processo de torra aumenta a extractabilidade das galactomananas do grão de café e é responsável pela diminuição do

2 peso molecular e do grau de ramificação destes polissacarídeos (Nunes e Coimbra, 21, 22a,b). De forma a proceder a uma caracterização estrutural mais detalhada, as galactomananas dos extractos aquosos de café verde e torrado foram purificados utilizando técnicas suaves para manter intactas as suas características estruturais. As galactomananas assim purificadas foram sujeitas a hidrólise enzimática com uma endo-β- D-mananase específica e os oligossacarídeos resultantes foram analisados por ESI-MS. As novas características estruturais foram confirmadas por ESI-MS/MS, análise de metilação e GC-EI-MS. 2. Material e métodos As galactomananas foram extraídas com água a 8ºC/2 min a partir dos gãos moídos e desengordurados de café verde (Brasil, arábica não lavado) e de cafés torrados da mesma origem com diferentes graus de torra (5, 8 e 1 de perda de peso seco em relação à massa seca de café verde). material de alto peso molecular foi obtido por diálise (12-14 kda de poro). A fracção rica em galactomananas (Et5) foi obtida por precipitação do material de alto peso molecular com soluções a 5 em etanol (Nunes and Coimbra 21). material foi posteriormente fraccionado por cromatografia de troca aniónica em Q-Sepharose FF e a fracção não retida (QSA) foi em seguida fraccionada por cromatografia em Sepharose contendo ácido aminofenilborónico imobilizado. material retido na coluna foi selectivamente eluído utilizando tampão contendo mm de manitol (PB2). As fracções PB2 provenientes dos café verde e torrados foram hidrolisadas com uma endo-β-(1 4)-D-mananase e os oligossacarídeos obtidos foram separados por cromatografia de exclusão molecular em Biogel P-2. As fracções contendo os oligossacarídeos com DP2 e DP3 foram analisados por espectrometria de massa utilizando uma fonte de electrospray (ESI-MS). A estrutura dos iões pseudomoleculares obtidos foi confirmada após dissociação por colisão com um gás (CID-ESI-MS/MS). A composição das fracções oligossacarídicas obtidas foi avaliada por análise enzimática utilizando várias glicosidases (β-manosidase, β-glucosidase e α- glucosidase), por análise de metilação e por análise por GC-EI-MS dos oligossacarídeos reduzidos e metilados (Nunes et al., 25). 3. Resultados e discussão A fase estacionária de PBA-Sepharose contém grupos de ácido borónico que complexam os grupos cis-diol dos resíduos de manose em ligação (1 4) e os resíduos galactose em posição terminal (Weith, 197). A utilização desta cromatografia em Sepharose contendo ácido aminofenilborónico imobilizado permitiu a retenção na coluna das galactomananas e a sua eluição com manitol (Figura 1). As fracções obtidas a partir do café verde estavam livres de arabinogalactanas e glucanas, apresentando as fracções dos cafés torrados cerca de 2 de arabinogalactanas.

3 U. A PB1 PB2.2.1 CManitol (M) Volume (ml) Figura 1 Separação da fracção de galactomananas do café verde por cromatografia de PBA- Sepharose. Açúcares (absorvância a 49 nm); Absorvância a 28 nm; Concentração de Manitol A análise de metilação mostrou que as fracções de galactomananas purificadas continham resíduos de arabinose em posição terminal e resíduos glucose em ligação (1 4). De forma a avaliar se estes resíduos de açúcar eram uma característica das galactomananas ou eram uma contaminação com outros polissacarídeos, procedeu-se a uma caracterização mais detalhada, tendo as galactomananas sido hidrolisadas de uma forma selectiva e suave utilizando uma endo-β-(1 4)-D-mananase (livre de actividade endoglucanase e arabinogalactanase). As fracções oligossacarícas obtidas após separação por cromatografia de exclusão molecular (Figura 1b) foram analisadas por ESI- MS.. 49 nm 2, 1,8 1,6 1,4 1,2 1,,8,6,4,2 V DP3 DP2 DP1,, Volume (ml) Figura 2 Separação por cromatografia de exclusão molecular dos oligossacarídeos obtidos após hidrólise com endo-β-d-mananase da galactomanana do café verde purificada por PBA- Sepharose. Legenda: Açúcares (absorvância a 49 nm); Absorvância a 28 nm; DP3, DP2 e DP1, correspondem ao volume de eluição dos oligossacarídeos com grau de polimerização 3, 2 e monossacarídeos, respectivamente.,95,85,75,65,55,45,35 28 nm s espectros de ESI-MS obtidos para as fracções DP3 (Figura 3) provenientes dos cafés verde e torrados foram bastante semelhantes na natureza dos iões presentes. s iões oligossacarídeos mais abundantes foram observados a 527 e 365 para os aductos de sódio ([M+Na] + ) de tri- e di-hexoses e a 543 e 381 para os respectivos aductos de potássio ([M+K] + ). A 497, com uma diferença de massa de 132 Da relativamente ao ião 365, foi identificado um ião de um trissacarídeo contendo um resíduo de pentose e dois resíduos de hexose. espectro de ESI-MS da Figura 3 mostra também iões intensos a 569 e 47, com uma massa superior em 42 Da relativamente aos iões identificados como di- e trissacarídeos, correspondendo possivelmente a iões [M+Na] + de tri- e dissacarídeos acetilados. ião 423 pode ser atribuído a iões [M+K] + de di-hexoses acetiladas e o ião a 449 a iões [M+Na] + de di-hexoses diacetiladas.

4 s iões correspondentes aos oligossacarídeos acetilados não foram observados nos espectros de ESI-MS após hidrólise alcalina Figura 3 Espectro de ESI-MS em modo positivo da fracção DP3 obtida por hidrólise enzimática das galactomananas purificadas a partir do café verde. aducto [M+Na] + de PentHex 2 ; aducto [M+Na] + de AcHex 2-3 ; aducto [M+K] + de AcHex 2-3 ; aducto [M+Na] + de Hex 2-3 ; aducto [M+K] + de Hex 2-3 ; aducto [M+Na] + de Ac 2 Hex 2. A quantidade de grupos acetilo nas fracções retidas (PB2) foi quantificada por análise por GC-FID e enzimaticamente após hidrólise alcalina. A quantidade de grupos acetilo contabilizou 3,9 desta fracção dos cafés verdes e entre 2,1 para a mesma fracção proveniente dos cafés torrados, mostrando que, em média, 11 mol e 8 mol dos resíduos manose das galactomananas se encontram acetiladas. Esta diminuição da abundância dos grupos acetilo pode dever-se à labilidade dos grupos éster durante o processo de torra, ou pela extracção de galactomananas com um menor grau de acetilação já presentes nos cafés verdes. De forma a confirmar as estruturas atribuídas aos iões [M+Na] + observados nos espectros de ESI-MS das fracções de cafés verdes e torrados, estes iões foram induzidos a fragmentar por colisão com um gás (MS/MS). Na Figura 4 mostra-se o espectro de ESI-MS/MS do ião [AcHex 2 +Na] + ( 47) e a interpretação da sua fragmentação. espectro de ESI-MS/MS mostra a presença de dissacarídeos acetilados pela presença do ião 245 identificado como [AcHex+Na] + resultante da perda de um resíduo hexose (-162 Da-Hex res ) a partir do ião pseudomolecular. s iões presentes a 35 e 364, resultante da perda de 12 e 43 Da a partir do ião pseudomolecular foram atribuídos a uma fragmentação do anel tipo (,2 A 2 ) contendo um grupo acetilo na posição -2 e clivagem homolítica do grupo acetilo, respectivamente. [AcHex+Na] ,2 A 2 [M+Na] + -Hex res (Y) (Z) -AcHex res -6 Da -CH 3 C [Hex res +Na] [Hex+Na] + -H H H H 185 (B) 227 (C) H H C 35 (,2 A CH 3 2 ) Figura 4 Espectro de ESI-MS/MS do aducto de [AcHex 2 +Na] + e interpretação da fragmentação observada. 364

5 Na figura 5, o espectro de ESI-MS/MS do ião [Ac 2 Hex 2 +Na] + ( 449) mostra a presença de dissacarídeos diacetilados pela presença do ião 287 identificado como [Ac 2 Hex+Na] + resultante da perda de um resíduo hexose (-162 Da-Hex res ) a partir do ião pseudomolecular. Este ião fragmento mostra que os dois grupos acetilados estão maioritariamente localizados no mesmo resíduo de açúcar. A presença do ião fragmento a 245 identificado como [AcHex+Na] + resultante da perda de um resíduo acetil-hexose (24 Da-AcHex res ) mostra a presença de dissacarídeos contendo resíduos acetilados consecutivos. A ocorrência de resíduos de hexose (Hex), acetil-hexose (AcHex) e diacetilhexose (Ac 2 Hex) onde as perdas de 9 e 12 Da, características de resíduos hexose em ligação 1 6 não estão presentes, mostram que a maioria, se não a totalidade dos resíduos acetilo são substituintes dos resíduos hexose em ligação 1 4. A presença de perdas de 12 Da dos iões oligossacarídeos acetilados e diacetilados indicam a ocorrência de acetilação na posição -2. No entanto, não se pode excluir a ocorrência de acetilação também nas posições -3 e -6. -AcHex res [M+Na] (Y) [Ac 2 Hex+Na] Hex res,2 A CH 3 C [AcHex+Na] [Hex + res +Na] Da H H H H C C H 3 C CH 347 (,2 A 3 2 ) 185 (B) 23 (C) 269 (Z) Figura 5 Espectro de ESI-MS/MS do aducto de [Ac 2 Hex 2 +Na] + e interpretação da fragmentação observada. espectro de MS/MS do ião [Pent.Hex 2 +Na] + ( 497 Figura 5) mostra a presença de um resíduo pentose ligado a um dissacarídeo de hexose. A perda de um resíduo pentose (-132 Da-Pent res ) a partir do ião pesudomolecular origina o ião fragmento a 365 identificado como [Pent.Hex 2 +Na] +. A perda de um resíduo de hexose (-162 Da) origina o ião fragmento a 335 identificado como [Pent.Hex+Na] +. As perdas de 6, 9 e 12 Da a partir do ião fragmento [Pent.Hex+Na] +, a 335, resultando nos iões a 275, 245 and 215, confirmam a ligação (1 6) do resíduo de pentose ao resíduo de hexose. Estes resultados indicam que as galactomananas dos cafés verde e torrados contêm resíduos de pentose como cadeias laterais. 46 [M+Na] + [PentHex+Na] Hex res 365 (Zα) [Hex 2 +Na] 347 (Yα) +,2 A 23 (C) Pent res,3 A (B), A [Pent+Na] ,2 A H H [Pent 3 res +Na] H 2 H (Y /,3 A 2 ) CH 2 H H H H Figura 6 Espectro de ESI-MS/MS do aducto de [Pent.Hex 2 +Na] + fragmentação observada. H 215 (Y /,4 A 2 ) 437 (,2 A 3 ); 275 (Y /,2 A 2 ) e interpretação da

6 De forma a verificar a presença de resíduos de glucose como parte integrante da estrutura das galactomananas dos café verdes e torrados, as fracções oligossacarídicas foram hidrolisadas utilizando β-glucosidase, α-glucosidase e β-manosidase. A β- glucosidase foi capaz de libertar glucose a partir dos oligossacarídeos provenientes do café verde, mas não o conseguiu a partir dos cafés torrados. A β-manosidase foi capaz de libertar glucose a partir dos oligossacarídeos provenientes dos cafés torrados mas não a partir das fracções do café verde. A α-glucosidase não foi capaz de libertar resíduos hexose de nenhuma das fracções. Estes resultados indicam que a distribuição dos resíduos glucose nos oligossacarídeos obtidos a partir das galactomananas dos café verde e torrados diferem, encontrando-se na posição não redutora das fracções provenientes dos cafés verdes, e provavelmente na posição redutora dos café torrados. A análise de metilação confirmou a presença de resíduos glucose na posição não redutora das fracções provenientes do café verde e a sua não existência nas fracções provenientes dos cafés torrados. De forma a determinar conclusivamente a presença de oligossacarídeo com estrutura Glc-Man e Glc-Man-Man nas fracções oligossacarídicas do café verde e a sua ausência nas fracções provenientes dos cafés torrados, as fracções oligossacarídicas foram reduzidas, metiladas e analisadas por GC-EI-MS (Figura 7). 6 Abundancia Glc-Manol Man-Manol Tempo (min) Figura 7 Identificação por GC-EI-MS de Glc-Man na fracção DP2 proveniente do café verde. Através do tempo de retenção e do espectro de EI-MS foi possível detectar os oligossacarídeos Glc-Manol e Glc-Man-Manol nas fracções provenientes dos café verdes, mas a sua detecção não foi possível nas fracções provenientes dos cafés torrados. Estes resultados mostram inequivocamente que os resíduos de glucose são parte integrante das galactomananas dos cafés verdes, contendo resíduos de glucose na cadeia principal em ligação β(1 4), apresentando uma estrutura de galactoglucomanana. Nos cafés torrados essa estrutura não é detectada, possivelmente por um efeito de diluição, já que durante a torra do café a quantidade de galactomananas extraídas aumenta cerca de 4 vezes, e estas galatomananas não contêm uma estrutura de glucomanana. 4. Conclusões A análise por espectrometria de massa utilizando como fonte de ionização o electrospray (ESI-MS) das fracções obtidas após hidrólise enzimática específica com endo-β-mananase permitiu determinar que, quer as mananas das infusões dos cafés torrados como as dos cafés verdes, se encontram acetiladas (8 e 11 mol, respectivamente) na posição -2 dos resíduos manose. Também foram detectados resíduos de manose duplamente acetilados e consecutivamente acetilados. Pela primeira vez, utilizando a análise de ESI-MS/MS, foram detectados inequivocamente resíduos de

7 arabinose como cadeias laterais das galactomanananas, quer nas infusões de café verde, como nas do café torrado (2 e <,9 mol por análise de metilação, respectivamente). A análise de metilação, hidrólise específica com glicosidases e análise por GC-EI- MS dos oligossacarídeos reduzidos metilados, permitiu determinar que as mananas das infusões de café verde contêm na sua cadeia principal resíduos de glucose em ligação β- (1 4) (6 mol), mostrando que se tratam de arabinogalactoglucomananas acetiladas. Nas infusões de café torrado os resíduos glucose (2,3) foram detectados apenas como resíduos do terminal redutor da cadeia de manana. 5. Referências EHLERS, G. M Possible applications of enzymes in coffee processing. Proceedings of 9th International Colloquium on the Chemistry of Coffee, ASIC, Paris, ILLY, A.; VIANI, R. Espresso Coffee - The Chemistry of Quality; Academic Press: London, MAIER, H. G Linkage of flavor compounds to the coffee powder matrix (German). Proceedings of 7th International Colloquium on the Chemistry of Coffee, ASIC, Paris, NUNES F. M.;. DMINGUES, M. R.; CIMBRA, M. A. 25. Structural Features of Acetylated Arabinogalactoglucomannans from Green and Roasted Coffee Infusions. Carbohydrate Research, submetido. NUNES, F. M.; CIMBRA, M. A. 21. Chemical characterization of the high molecular weight material extracted with hot water from green and roasted arabica coffee. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, NUNES, F. M.; CIMBRA, M. A. 22b. Chemical characterization of the high molecular weight material extracted with hot water from green and roasted robusta coffees as affected by the degree of roast. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 5, NUNES, F. M.; CIMBRA, M. A.. Chemical characterization of galactomannans and arabinogalactans from two arabica coffee infusions as affected by the degree of roast Journal of Agricultural and Food Chemistry,, 5, NUNES, F. M.; CIMBRA, M. A.; DUARTE, A. C.; DELGADILL, I Foam Ability, Foam Stability and Chemical Composition of Espresso Coffee as Affected by the Degree of Roast. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, WEITH H. L.; WIEBERS J. L.; GILHAM P.T Synthesis of cellulose derivatives containing dihydroxyboryl group and a study of their capacity to form specific complexes with sugars and nucleic acid components. Biochemistry, 9,