AVALIAÇÃO DE MEDULA ÓSSEA EM CÃES PANCITOPÊNICOS DE UMA POPULAÇÃO HOSPITALAR DA REGIÃO CENTRO-OESTE DO BRASIL

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS AVALIAÇÃO DE MEDULA ÓSSEA EM CÃES PANCITOPÊNICOS DE UMA POPULAÇÃO HOSPITALAR DA REGIÃO CENTRO-OESTE DO BRASIL ANGELA FERRONATTO GIRARDI CUIABÁ MT 2014

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS AVALIAÇÃO DE MEDULA ÓSSEA EM CÃES PANCITOPÊNICOS DE UMA POPULAÇÃO HOSPITALAR DA REGIÃO CENTRO- OESTE DO BRASIL Autor: Angela Ferronatto Girardi Orientadora: Prof.ª Dr.ª Valéria Régia F. Sousa Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias, área de concentração: Medicina Veterinária, da Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. CUIABÁ MT 2014

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6 DEDICATÓRIA Aos meus pais e irmãs, por renunciarem aos próprios sonhos para ajudar na realização dos meus.

7 AGRADECIMENTOS A gratidão ao único Deus é imensurável. Pelo discernimento, pela paciência, pela esperança, pela paz. À minha família, agradeceria com a minha própria vida. Pelo apoio incondicional, pela fé que me ensinaram a ter, pelo amor verdadeiro, único e eterno. Ao meu Matias, por ser meu porto seguro, meu escudo e meu amor. Agradeço minha orientadora, por acreditar em mim, por fazer despertar minha inclinação pela ciência e por ter sempre a palavra certa no final das contas. A todos do setor pela ajuda no decorrer do projeto. À Professora Dra. Arleana de Almeida, pelo auxílio incondicional, e em especial, Amanda, por ter se tornado uma grande amiga. Aos meus amigos, de dentro e de fora do Hospital Veterinário, minha profunda alegria em compartilhar esse fim de ciclo com quem só posso agradecer, pelo apoio, pelas coisas diárias, pela amizade, pela lealdade. Aos laboratórios de Patologia Clínica, Patologia Geral, Biologia Molecular e Microbiologia Veterinários do Hospital Veterinário e aos professores responsáveis. Ao professor Nayro Xavier de Alencar e sua orientada Carla Honse, pelo compartilhamento de seu conhecimento e pela acolhida na Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense. À CAPES, pelo auxílio concedido. À todos os funcionários do Hospital Veterinário, pela ajuda, pelos risos, pela convivência.

8 RESUMO AVALIAÇÃO DE MEDULA ÓSSEA EM CÃES PANCITOPÊNICOS DE UMA POPULAÇÃO HOSPITALAR DA REGIÃO CENTRO-OESTE DO BRASIL A pancitopenia pode estar associada a distúrbios intra e extramedulares. Quando a etiologia não é óbvia o exame de medula óssea é necessário. O estudo tem como objetivo avaliar a prevalência da pancitopenia, relatar e discutir alterações de medula óssea e diagnósticos diferenciais em cães pancitopênicos. A ocorrência de pancitopenia aos hemogramas realizados num período de 13 meses consecutivos em um hospital veterinário foi avaliada, e após autorização dos proprietários dos cães pancitopênicos foi obtido aspirado de medula óssea. Esfregaços foram confeccionados e corados por Giemsa, onde contagem diferencial de 500 células foi realizada e foram avaliadas relação mielóide: eritróide, celularidade, megacariócitos e exame parasitológico direto. PCR para Leishmania (Leishmania) infantum chagasi e Ehrlichia canis foi realizado a partir do aspirado de medula óssea. Hemogramas de 3120 caninos com diversas alterações clínicas foram analisados para identificar pancitopenia, que representaram 167 (5.4%) cães. Destes, foi obtida autorização de proprietários de 65 cães pancitopênicos para coleta de medula óssea. Interpretação de características quantitativas foi realizada a partir do esfregaço de medula óssea e a etiologia foi firmada em 46 (70.8%) destes, que incluiu infecção por E. canis e L. chagasi, anemia aplásica idiopática, insuficiência renal crônica e co-infecções. Em 17 (26.2%) animais não foram observadas alterações medulares. O achado mais observado foi hiperplasia mielóide e eritróide em 16 (24.6%) cães. A prevalência de pancitopenia observada foi elevada comparando a outros dados relatados em literatura, fato que pode ter ocorrido devido ao número de casos decorrentes de doenças infecciosas (58,5%) nos caninos avaliados: número expressivo decorrente de sua característica endêmica. Palavras-chave: Canino. Citologia. Citopenia. Hemoparasitos. Mielograma.

9 ABSTRACT BONE MARROW EVALUATION IN PANCYTOPENIC CANINE OF A HOSPITAL POPULATION IN MID-WEST REGION OF BRAZIL The pancytopenia can be associated with intra and extra medullary disorders. When the etiology is not obvious, the examination of bone marrow is necessary. The study aims to evaluate the prevalence of pancitopenia, report and discuss bone marrow alterations and pancitopenia differential diagnosis in dogs. The occurrence of pancitopenia in blood counts performed over a period of 13 consecutive months at a veterinary hospital was evaluated, and with approval of the owners of dogs, bone marrow aspirate was obtained. Smears was prepared and stained by Giemsa, where 500 cells differential count was performed and were assessed myeloid:erythroid ratio, cellularity, megakaryocytes and cytological examination. PCR for Leishmania (Leishmania) infantum chagasi and Ehrlichia canis was conducted from the bone marrow aspirate. Blood counts of 3120 canines, with several clinical changes were analyzed to identify pancitopenia, which accounted for 167 (5,4%) dogs. Of these, authorization was obtained from owners of 65 dogs for bone marrow collection. Interpretation of quantitative characteristics was carried out from the bone marrow smear and the etiology was established in 46 (70.8%) of these, which included infection by E. canis and L. chagasi, idiopathic aplastic anemia, chronic renal failure and co-infections. In 17 (26.2%) animals were not observed medullary changes. The most observed finding was myeloid and erythroid hyperplasia in 16 (24.6%) dogs. The prevalence of pancitopenia observed was high when compared with data reported in the literature, which may be due to the number of cases due to infectious diseases (58,5%) in evaluated canine: expressive number due to its endemic feature. Keywords: Cytology. Canine. Cytopenia. Hemoparasites. Myelogram.

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Valores hematológicos de normalidade e classificação das citopenias em caninos adultos, segundo Jain (1993) e Weiss, Evanson e Sykes (1999)...17 Tabela 2. Interpretação de RME e celularidade em caninos pancitopênicos, avaliados no período de maio de 2012 a maio de Tabela 3. Associações estatisticamente significantes entre severidade de citopenias e diagnóstico etiológico, avaliados em cães pancitopênicos no período de maio de 2012 a maio de Tabela 4. Severidade de achados hematológicos e características quantitativas de medula óssea em cães pancitopênicos, avaliados no período de maio de 2012 a maio de

11 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Maturação celular das linhagens eritrocíticas e leucocíticas...20 Figura 2. A Sítio de coleta na crista ilíaca após tricotomia. B Anestesia local em sítio de coleta...24 Figura 3. Aspiração de medula óssea de crista ilíaca em um cão...25 Figura 4. Fotomicrografia de mielograma de cão pancitopênico. Coloração de Giemsa. Aumento de 10x. A - Hipo/aplasia medular. B Hiperplasia medular. C Celularidade normal medular. Aumento de Figura 5. Fotomicrografia de mielograma de cão pancitopênico. Coloração de Romanowsky. A Gamonte de Hepatozoon sp em leucócito. Aumento de 100x. B Babesia sp intraeritrocitária. Aumento de 100x. C Hiperplasia eritróide. Aumento de 40x. D Hiperplasia mielóide. Aumento de 40x...31

12 LISTA DE ABREVIATURAS HOVET UFMT: Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso RME: relação mielóide:eritróide EMC: erliquiose monocítica canina LVC: leishmaniose visceral canina DPP: Dual Path Plataform ELISA: ensaio imunoadsorvente ligado a enzimas

13 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Hematopoese Medula óssea em cães Pancitopenia Mielograma Coleta Características morfo-tintoriais celulares Pancitopenia causada por doenças infecciosas Erliquiose monocítica canina Leishmaniose visceral canina MATERIAL E MÉTODOS Procedimento ético Local de estudo Animais e amostragem Critério de inclusão e classificação de pancitopenia Coleta de sangue e medula óssea Mielograma Extração de DNA e reação em cadeia da polimerase Imunohistoquímica para parvovírus canino Desfecho clínico Estatística RESULTADOS Ocorrência de pancitopenia Dados dos animais Ocorrência e severidade de citopenias Alterações quantitativas Contagem de megacariócitos Diagnóstico etiológico Desfecho clínico Associações estatísticas DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS...42 APÊNDICE Artigo científico e comprovante de submissão...48

14 1 INTRODUÇÃO O exame de medula óssea é de utilidade diagnóstica e prognóstica na avaliação de um transtorno hematopoiético evidenciado por alterações hematológicas. É indicado em situações onde se suspeita de falha hematopoiética ou nas que não se atinge um diagnóstico definitivo apenas pelas anormalidades no sangue (ACEÑA, LISTE e GASCÓN, 1992; MORITZ et al., 2010). Entre as indicações para o exame está a pancitopenia, especialmente se esta for persistente e inexplicada (GRINDEM, NEEL e JUOPPERI, 2002; WEINZIERL e ARBER, 2013). Pancitopenia foi observada em aproximadamente 7% dos hemogramas em cães atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso (HOVET UFMT) durante o ano de 2011 (dados não publicados) e os distúrbios de medula óssea poderiam ser a causa primária deste achado. Com o mielograma é possível detectar desordens medulares, diferenciando de destruição periférica de células sanguíneas (MISCHKE e BUSSE, 2002). Outro aspecto que justifica o estudo da pancitopenia em cães é o fato de ser comum em doenças infecciosas como a leishmaniose visceral canina (LVC) e a erliquiose monocítica canina (EMC), que culminam em alterações medulares. Tais doenças são endêmicas na região do estudo. A leishmaniose visceral canina apresenta uma prevalência de 22,1% (ALMEIDA et al., 2012) a 64,5% (MOURA et al., 1999). Enquanto a erliquiose tem prevalência de 42,5% na cidade de Cuiabá (SILVA et al., 2010). Também se deve salientar a importância de um tratamento precoce e agressivo para estes pacientes pancitopênicos, devido à gravidade deste quadro. Ao estabelecer o diagnóstico correto, determinando a diferença entre destruição periférica e distúrbio medular, o tratamento com estimulantes medulares pode ser instituído aumentando a chance de melhora do paciente (KEARNS e EWINGS, 2006). As crescentes pesquisas com células-tronco de medula óssea na medicina veterinária aumentam a necessidade de enriquecer os conhecimentos básicos a respeito da mesma (MULLER et al., 2009).

15 Há muito relatado sobre o exame de medula óssea em cães, mas poucos estudos detalhados sobre alterações da medula em condições de doenças específicas, como na LVC e na EMC. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a prevalência de pancitopenia em uma população hospitalar, realizar diagnóstico diferencial para a condição hematológica, descrever e discutir as alterações medulares em cães pancitopênicos, relacionando ao diagnóstico morfológico e etiológico.

16 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Hematopoese A hematopoese é o processo no qual as células tronco (stem cells) se dividem e diferenciam para produzir vários tipos celulares sanguíneos. Inicia-se precocemente no desenvolvimento embrionário, no fígado, baço e medula óssea (JAIN, 1993) e continua ao longo da vida, primariamente na medula óssea (PEREIRA, CLARKE e DAMEN, 2007). Em animais jovens a hematopoese pode ocorrer no timo, fígado, linfonodos, rins, estômago e intestino (SIROIS e ANTHONY, 2005). Para a hematopoese ocorrer, deve haver um microambiente que é capaz de reconhecer e reter as stem cells e prover os fatores requeridos para possibilitar a proliferação, diferenciação e maturação dessas células. O microambiente hematopoiético consiste de células reticulares adventícias, células endoteliais, macrófagos, adipócitos, células ósseas de revestimento e elementos de matriz extracelular (TRAVLOS, 2006). A hematopoese é um processo contínuo, mas pode ser separado em estágios diferentes. O primeiro estágio envolve as células pluripotentes. Estas células têm duas funções primárias, manter-se por um processo de autorenovação e ter a habilidade de dar origem a todas as células hematopoiéticas. Dependendo da necessidade, o microambiente da medula e os fatores de crescimento influenciam as células pluripotentes a se diferenciarem em células tronco hematopoieticamente comprometidas de ambas as séries mielóide ou linfóide. Neste segundo estágio, estas células tem um potencial de auto renovação limitado, mas tem potencial para se diferenciarem e desenvolverem uma progênie madura. No processo de hematopoese há uma sucessão de células precursoras com capacidade de geração celular mas com cada vez menos capacidade de auto geração. Dependendo do tipo celular e grau de maturação, os agrupados de células presentes na medula óssea são designados como unidades formadoras de blastos ou de colônias (SIROIS e ANTHONY, 2005). Células tronco mielóides são as unidades formadoras de colônia multipotenciais para granulócitos, eritrócitos, monócitos e megacariócitos (TRAVLOS, 2006; METCALF, 2007).

17 Uma série de células hematopoieticamente comprometidas é gerada então, e perde toda a capacidade proliferativa à medida que progressivamente se torna madura (METCALF, 2007). O terceiro estágio ocorre na diferenciação de células tronco hematopoeticamente comprometidas, influenciadas por vários fatores de crescimento, em células progenitoras linhagem-específicas (TRAVLOS, 2006). Em cães e gatos, hematopoese ocorre continuamente na medula óssea vermelha. A produção, diferenciação e maturação são reguladas por citocinas como a eritropoietina e a trombopoetina, que estimulam a produção de eritrócitos e plaquetas, respectivamente, ou por fatores de crescimento (SIROIS e ANTHONY, 2005; METCALF, 2007), como o fator estimulante de colônia granulocítica (G-CSF) responsável por regular a produção de leucócitos (COLIJN e MACKEY, 2005). O processo de eritropoiese ocorre em uma unidade microanatômica denominada de ilha eritroblástica, a qual é formada por um macrófago central (denominada de célula enfermeira ou célula babá) circundado por um anel de células eritróides em desenvolvimento. À medida que as células eritróides vão maturando, estas se distanciam do macrófago e fazem contato com as células endoteliais dos sinusóides através das moléculas de adesão e com isso entram na circulação sanguínea (JAIN, 1993). Megacariopoiese ocorre adjacente ao endotélio. Plaquetas são liberadas diretamente no sangue por processos citoplasmáticos dos megacariócitos que penetram pela parede dos vasos sinusóides para o lúmen sinusal (TRAVLOS, 2006). A formação de plaquetas resulta da maturação de megacariócitos, pela replicação de seu DNA, que ocorre sem divisão celular, resultando em um núcleo grande, lobulado e polipóide. Trombopoietina e algumas citocinas hematopoiéticas estimulam a maturação e crescimento dos megacariócitos (BATTINELLI, HARTWIG e ITALIANO, 2007). Granulopoiese ocorre em focos menos distintos (TRAVLOS, 2006). As células progenitoras mielóides passam por quatro mitoses (COWELL et al., 2008). Segundo Stockham e Scott (2008), de acordo com o estágio de maturação, os leucócitos são divididos em três compartimentos: mitótico ou de proliferação (constituídos de mieloblastos, promielócitos e mielócitos),

18 maturação (metamielócitos e bastonetes) e de reserva (neutrófilos e bastonetes). Depois da maturação, as células hematopoiéticas, reguladas pelas células de barreira, transpassam a parede dos vasos sinusóides para entrar na corrente sanguínea (TRAVLOS, 2006). O tempo de maturação de um leucócito desde seu primeiro estágio até um neutrófilo maduro e sua liberação no sangue periférico é de cinco a seis dias em cães (STOCKHAM e SCOTT, 2008). O tecido hematopoiético é sensível a influências externas e pode ser suprimido em resposta a restrição dietética, má nutrição, inflamação crônica, toxicidade e desordens proliferativas ou neoplásicas (TRAVLOS, 2006). Em razão disto, é necessário o estudo da medula óssea em cães. 2.2 Medula óssea em cães A medula óssea é o principal órgão hematopoiético, responsável por armazenar os precursores eritróides, mielóides e megacariocíticos, além de ser um tecido linfóide primário e secundário (TRAVLOS, 2006). Em animais jovens, tecido hematopoiético ativo é encontrado em ossos longos e chatos. Em adultos, este tecido está concentrado em ossos chatos e extremidades de ossos longos. Independentemente da localização, a média de celularidade medular é de 80% aos dois meses de idade e diminui para uma média de 66% aos dois anos de idade (COWELL et al., 2008; TRAVLOS, 2006; STOKOL, 2010). A medula óssea não aparenta ser um material homogêneo. É formada de células agrupadas específicas em maturação (SIROIS e ANTHONY, 2005). A medula óssea consiste de ilhas de tecido hematopoiético e células adiposas circundadas por vasos sinusóides intercalados dentro de uma malha de osso trabecular (TRAVLOS, 2006), formando dois compartimentos, do estroma medular e das células hematopoéticas (KIERSZENBAUM, 2008). O compartimento do estroma medular é formado por células adiposas, fibroblastos, células estromais, células endoteliais vasculares, macrófagos, e vasos sanguíneos. As células endoteliais, os fibroblastos e as células estromais produzem fatores de crescimento hematopoiéticos e citocinas. As células endoteliais impedem a saída de células hematopoiéticas da medula óssea para

19 o sangue. As células adiposas fornecem uma fonte de energia local e sintetizam fatores de crescimento. Os macrófagos removem as células apoptóticas e os núcleos residuais dos eritroblastos ortocromáticos, impedindo que partículas entrem no tecido medular, enquanto os osteoblastos e osteoclastos mantêm e remodelam o tecido ósseo esponjoso em torno do tecido medular. O compartimento de células hematopoiéticas é constituído por vários tipos celulares que ocupam sítios preferenciais na medula óssea e possuem capacidades diferentes de auto renovação, crescimento, diferenciação e maturação (KIERSZENBAUM, 2008). O osso esponjoso ou trabecular apresenta uma matriz mais porosa, organizada em trabéculas preenchidas por medula óssea vermelha, na qual há produção ativa de células sanguíneas a partir de células mesenquimais, possuindo, assim, metabolismo mais intenso que o osso cortical (BETTI, 2004). A medula óssea possui um extenso suprimento sanguíneo. Em ossos longos e planos, o suprimento sanguíneo do osso e da medula é interconectado por uma rede de vasos no endósteo (TRAVLOS, 2006). A inervação medular ocorre com nervos mielinizados e não mielinizados que adentram pelos canais nutritivos. Feixes nervosos seguem as arteríolas com ramos que servem o músculo liso de vasos, ou, ocasionalmente terminando no tecido hematopoiético entre as células hematopoiéticas (TRAVLOS, 2006). O estudo da estrutura medular foi aprimorado pelo desenvolvimento dos métodos de obtenção de amostras de medula óssea, que possibilitou que os procedimentos de coleta fossem realizáveis em laboratórios de patologia e não somente em hospitais e centros especializados (ALVES, 2009) e ainda a compreensão do processo de hematopoese, e o estudo de condições patológicas como a pancitopenia, descrita a seguir. 2.3 Pancitopenia O termo pancitopenia (de origem grega, pan significa todo) não se refere a uma doença e sim ao desenvolvimento simultâneo de diminuição de células das três linhagens presentes no sangue periférico, em relação aos parâmetros

20 de referência para indivíduos saudáveis, incluindo anemia, trombocitopenia e leucopenia (WEISS, EVANSON e SYKES, 1999). De acordo com Jain (1993) os valores de referência normais para cães encontram-se na Tabela 1, assim como uma classificação para a severidade destas. A ocorrência da condição hematológica é descrita por alguns autores e varia de acordo com a área geográfica estudada, de acordo com o caráter endêmico de doenças infecciosas que a provocam (WEISS, 2006). Prevalências de 1.85% (em casos de pancitopenia associada à hipo/aplasia medular) a 2.4% são relatadas em estudos realizados nos Estados Unidos (WEISS, EVANSON e SYKES, 1999; BRAZZEL e WEISS, 2006). No Brasil não há dados publicados da prevalência de pancitopenia em cães. Tabela 1 - Valores hematológicos de normalidade e classificação das citopenias em caninos adultos, segundo Jain (1993) e Weiss, Evanson e Sykes (1999). Classificação Citopenias Normalidade Leve Moderada Severa Anemia (hematócrito = %) <20 Leucopenia (neutrófilosx10 3 /µl) ,6 1 2 <1 Trombocitopenia (plaquetasx10 3 /µl) <20 Distúrbios medulares que incluem diminuição da hematopoese ou a inefetividade da mesma (aplasia medular, mielofibrose, mielonecrose, mielodisplasias e mieloftise) podem levar à pancitopenia, que pode estar relacionada ainda à destruição periférica de células sanguíneas (WEISS, EVANSON e SYKES, 1999). Segundo Brazzel e Weiss (2006) tais achados medulares podem estar associados a diferentes agentes etiológicos. Dentre as causas infecciosas serão abordadas de forma mais detalhada nesta revisão, a erliquiose monocítica canina e a leishmaniose visceral. Aplasia medular pode ter origem infecciosa, toxicidade a drogas e radiação e ainda pode ser classificada como idiopática, na exclusão de todas as outras causas (MORAES e TAKAHIRA, 2010). Muitos agentes

21 quimioterápicos atuam em tecidos neoplásicos e normais que se encontram em intensa divisão celular, levando a aplasia medular (FARO et al., 2008). Há relatos de pancitopenia pelo uso de fenobarbital, que provavelmente se dá por uma supressão medular transitória (KHOUTORSKY e BRUCHIM, 2008). A consequência destas injúrias para a medula óssea pode ser a substituição de tecido rico em precursores hematopoiéticos por um tecido rico em fibroblastos, a mielofibrose (WEISS e SMITH, 2002) ou por tecido adiposo (BRAZZEL e WEISS, 2006). Os sinais clínicos são inespecíficos, geralmente ligados à menor taxa destas células e a afecções subjacentes. Tendências hemorrágicas e palidez de mucosas são as mais comuns, relacionadas à trombocitopenia e anemia, respectivamente. Os sinais incluem febre de origem desconhecida e infecções persistentes associados à leucopenia. Apesar da inespecificidade dos outros sinais clínicos, estes podem direcionar o diagnóstico (KEARNS e EWINGS, 2006). Um histórico acurado do animal aliado ao exame físico e exames para doenças infecciosas é essencial para determinar a causa da pancitopenia (KEARNS e EWINGS, 2006). A avaliação da medula óssea é geralmente essencial para o correto diagnóstico (LUCIDI e ROSATO, 2009) e pode ser realizada através do aspirado de medula óssea ou histopatologia de medula óssea (KEARNS e EWINGS, 2006). A leucopenia e a trombocitopenia são as primeiras citopenias a surgir, devido sua meia-vida curta quando comparada aos eritrócitos (WEISS, 2003). A doença é infrequentemente diagnosticada e a forma idiopática costuma ser responsável por mais de 67% dos casos caninos (BRAZZEL e WEISS, 2006). 2.4 Mielograma Até recentemente, desordens de medula óssea em animais eram raramente avaliadas e tratadas agressivamente e apresentavam um prognóstico ruim (WEISS, 2003). Mas a biopsia de medula óssea pode ser utilizada quando as anormalidades hematológicas são de difícil diagnóstico

22 através de exame de sangue (THRALL, BAKER e LASSEN, 2004). Também é indicada em estadiamento e diagnóstico de neoplasias, detecção de agentes infecciosos, estimativa de estoques de ferro e avaliação de febre de origem desconhecida (STOKOL, 2010). Esta avaliação morfológica pode ser obtida por esfregaço de aspirado de medula óssea e por coleta de amostras de biopsia. A punção aspirativa é um procedimento mais simples e confortável, mas a biopsia propriamente dita fornece dados mais fidedignos como o grau de celularidade medular e o diagnóstico de mielofibrose e de mieloesclerose (CURY, 2003). No entanto, o aspirado tem a vantagem de demonstrar a morfologia celular mais detalhadamente (STOKOL, 2010). O mielograma permite a detecção de hemoparasitos, incluindo protozoários e infecções fúngicas e bacterianas que podem estar associados à pancitopenia (STOKOL, 2010) Coleta Aspiração de medula óssea geralmente é dolorosa e geralmente requer sedação combinada com analgesia local ou sistêmica, ou anestesia geral. A técnica consiste na aspiração por pressão negativa de uma seringa acoplada a uma agulha (DEFARGES et al., 2013). Para pequenos animais, o sítio de coleta deve ser escolhido pelo clínico de acordo com a idade, tamanho e condição do animal (RASKIN e MESSICK, 2012). Amostras de medula óssea podem ser coletadas do úmero, ílio e do fêmur. Aspirados oriundos do esterno apresentam menor dificuldade no procedimento e produzem amostras de qualidade similar àquelas coletadas no ílio e úmero (DEFARGES et al., 2013). O ílio apresenta-se prontamente acessível e por isso é bastante abordado na coleta de medula óssea. Em animais pequenos, devido à fina espessura da crista ilíaca, a via transilíaca é preferida em relação ao acesso de forma paralela a esta localização anatômica (RASKIN e MESSICK, 2012) Características morfo-tintoriais celulares

23 A morfologia das células encontradas na medula óssea é descrita por Jain (1993), Harvey (2001) e Thrall, Baker e Lassen (2004) (Figura 1), e a identificação de cada célula ou atipias propicia um diagnóstico mais preciso, assim como de patógenos indutores de pancitopenia, como a erliquiose monocítica canina e a leishmaniose visceral (STOKOL, 2010; RASKIN e MESSICK, 2012). Figura 1. Maturação celular das linhagens eritrocíticas e leucocíticas. Fonte: HARVEY (2001) 2.5 Pancitopenia causada por doenças infecciosas Erliquiose monocítica canina (EMC) Entre as causas infecciosas de aplasia medular deve-se citar a infecção crônica por Ehrlichia canis, uma bactéria intracelular obrigatória pertencente à família Anaplasmataceae, que apresenta tropismo por leucócitos (principalmente monócitos) (RIKIHISA et al., 1991; DUMLER et al., 2001) que leva a pancitopenia aplásica (MANZILLO et al., 2006). Esta fase da aplasia

24 medular está relacionada a altos títulos de anticorpos (BUHLES, HUXSOLL e HILDEBRANDT, 1975). Tal fato remete a necessidade de diagnóstico para tratamento adequado e melhora clínica do animal. Para o diagnóstico podem ser utilizadas várias técnicas, mas a detecção do agente em medula óssea determina a etiopatogenia nesta fase da doença, como fator desencadeador da aplasia medular. Trombocitopenia, anemia e leucopenia geralmente estão presentes na fase subclínica da doença, que pode evoluir para a fase crônica, caracterizada por pancitopenia (HARRUS et al., 1999; WANER, 2008). Erliquiose monocítica canina é endêmica no Brasil, portanto deve ser considerada como a principal causa de pancitopenia canina (LUCIDI e ROSATO, 2009). Na capital do estado de Mato Grosso, Cuiabá, a prevalência é de 42,5% (SILVA et al., 2010). As condições que levam a mielossupressão na EMC ainda devem ser elucidadas. Embora Siarkou et al. (2007) tenha confirmado que não há variabilidade no gene 16S rrna de E. canis, sendo que é um gene conservado do gênero, é necessário estudar outros genes para determinar o papel da variabilidade de cepas envolvidas no estabelecimento de lesões de medula óssea. Além disso, é aceito o papel do sistema imune do hospedeiro como determinante da severidade dos sinais clínicos (TAJIMA e RIKIHISA, 2005) Leishmaniose visceral canina A Leishmaniose Visceral (LV) é um agravo à saúde pública mundial, causada no Brasil pelo protozoário Leishmania chagasi (Leishmania infantum chagasi). Transmitida por insetos vetores, os flebotomíneos, que afetam homens, animais domésticos e silvestres na maioria das regiões brasileiras (BRASIL, 2006). Com o processo de urbanização da leishmaniose visceral, o cão detém maior importância como reservatório do parasito (SOUZA et al., 2010). De uma infecção cutânea localizada, o parasito pode ser disseminado por via linfática ou hematógena, infectando macrófagos na medula óssea, linfonodos, fígado e baço, assim como rins e trato gastrointestinal (REIS et al., 2006).

25 Os principais sinais clínicos observados são lesões de pele, mucosas pálidas, esplenomegalia, hepatomegalia, emagrecimento, linfonodos hipertróficos e onicogrifose (QUEIROZ et al., 2010). Todos esses sinais podem confundir a doença com outras doenças infecciosas, assim como desordens de malignidade, endócrinas e linfoproliferativas (BARRECA et al., 2000). A doença em humanos pode causar desordens hematológicas como pancitopenia, mielofibrose, mielodisplasia e hemofagocitose (REIS et al., 2006; DHINGRA et al., 2010). Em cães, a infecção pode causar disfunção na produção de eritrócitos, granulócitos, monócitos, linfócitos e plaquetas (ABREU et al., 2011). O diagnóstico clínico de LV em cães pode ser simples em animais sintomáticos. Nestes casos é recomendado um teste com alta especificidade para a confirmação. Em animais assintomáticos ou oligossintomáticos, um teste com alta sensibilidade é mais indicado (GOMES et al., 2008). O diagnóstico presuntivo é geralmente realizado por testes sorológicos, como o DPP (Dual Path Plataform) e ELISA (ensaio imunoadsorvente ligado a enzimas) preconizados pelo Ministério da Saúde (BRASIL, 2006), em conjunção a dados clínicos e epidemiológicos (REIS et al., 2006). O diagnóstico conclusivo pode ser realizado pela visualização de amastigotas de Leishmania spp em esfregaços de medula óssea, linfonodos, pele, sangue periférico, baço e fígado. As amostras são examinadas por microscopia óptica sob imersão de óleo (GOMES et al., 2008; MAIA e CAMPINO, 2008). O diagnóstico por PCR é baseado na amplificação in vitro de sequências de nucleotídeos específicos presentes no parasita (GOMES et al., 2008). A técnica de PCR tem sido considerada teste-ouro por alguns autores, já que pode apresentar sensibilidade próxima a 100% (MOREIRA et al., 2007). Apresenta sensibilidade maior que técnicas sorológicas e de cultura (GOMES et al., 2008). Há pouca informação na literatura sobre celularidade de medula óssea em cães naturalmente infectados com L. chagasi, apesar de haver alguns relatos disponíveis sobre as alterações patológicas que ocorrem neste órgão durante a leishmaniose visceral canina (ABREU et al., 2011). Em humanos, um estudo relata normo a hipercelularidade medular (DHINGRA et al., 2010).

26 A identificação de eritrofagocitose, hipoplasia e displasia da série eritróide e hiperplasia mielóide (mielóide, neutrofílica e eosinofílica) foram detectadas em cães subdivididos em três grupos: assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos, de acordo com os sinais clínicos apresentados por cães naturalmente infectados (FOGLIA-MANZILLO et al., 2006).

27 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Procedimento ético O estudo foi aprovado pelo CEUA sob número /12-2 e os procedimentos de coleta só foram realizados nos caninos dos proprietários que assinaram o termo de livre consentimento. 3.2 Local de estudo A localização do estudo se deu no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso, município de Cuiabá, localizado no centro-sul do Estado de Mato Grosso. A região apresenta clima tropical quente e subúmido (IBGE, 2010). O HOVET-UFMT atende diversas especialidades veterinárias, incluindo clínica médica, cirúrgica e anestesiologia de pequenos animais, diagnóstico por imagem e patologia clínica. O local também conta com laboratório de patologia veterinária, biologia molecular, microbiologia e virologia e rickettsioses. No HOVET-UFMT, atualmente são atendidos cerca de 3000 cães ao ano. 3.3 Animais e amostragem No período de maio de 2012 a maio de 2013 foi avaliado o número total de hemogramas e cães atendidos para estabelecer a ocorrência de pancitopenia no local do estudo. Dentre os cães pancitopênicos foram coletadas amostras de aspirado de medula óssea de 65 cães (nos quais houve autorização dos proprietários) atendidos no HOVET-UFMT. Dados como idade, sexo, raça, sinais clínicos, histórico de exposição a drogas mielossupressoras e vacinação foram coletados. 3.4 Critério de inclusão e classificação de pancitopenia No estudo foram incluídos cães com pancitopenia encontrados ao hemograma, de acordo com o proposto por Jain (1993) e as citopenias foram

28 classificadas conforme a severidade (WEISS, EVANSON e SYKES, 1999) (Tabela 1). 3.5 Coleta de sangue e medula óssea Amostras de sangue foram coletadas por punção de veias jugular ou cefálica, e processadas de acordo com Jain (1993), utilizando-se de contador de células automatizado. Os procedimentos de coleta foram realizados após anestesia dissociativa [cetamina (Cetamin, Rhobifarma, Brasil) e midazolam (Midazolam, Hipolabor, Brasil) na dose de 10mg/kg e 0.5 mg/kg, respectivamente, e botão anestésico local com lidocaína a 2% (2 a 5 mg/kg, Anestésico L, Eurofarma, Brasil)], tricotomia e antissepsia da região da crista ilíaca (Figura 2). Figura 2. A Sítio de coleta na crista ilíaca após tricotomia. B Anestesia local em sítio de coleta. Fonte: Arquivo pessoal. A técnica consistiu de aspiração de uma fração de cerca de um ml de medula óssea (Figura 3), que foi coletada da crista ilíaca ou esterno através de agulhas descartáveis 40x12mm e seringas de 20 ml. Após a coleta, a alíquota foi acondicionada em um tubo com EDTA e armazenada a -20 o C. Do aspirado de medula óssea foram feitos esfregaço e/ou squash, submetidos à coloração de Giemsa.

29 Figura 3. Aspiração de medula óssea de crista ilíaca em um cão. Fonte: Arquivo pessoal. 3.6 Mielograma A contagem diferencial foi realizada a partir de 500 células em cada esfregaço, em microscópio óptico com aumento de 40x, contando-se somente as células dispostas sem sobreposição, com distinção de tipos celulares (JAIN, 1993; MISCHKE e BUSSE, 2002). Relação mielóide:eritróide (RME) e celularidade foram avaliados e interpretados em conjunto, de acordo com Grindem, Neel e Juopperi (2002) e agrupados segundo as alterações quantitativas (Tabela 1). Contagem de megacariócitos e exame parasitológico direto também foram realizados. 3.7 Extração de DNA e reação em cadeia da polimerase Após a extração de DNA, realizada pelo método fenol-clorofórmio (SAMBROOK e RUSSEL, 2001) as amostras foram testadas para a espécie Leishmania (Leishmania) infantum chagasi utilizando primer RV1: 5- CTTTTCTGGTCCCGCGGGTAGG-3 e RV2: 5- CCACCTGGCCTATTTTACACCA -3, que amplifica uma sequência de 145pb (LACHAUD et al., 2002). Para E. canis os primers utilizados foram baseados na seqüência parcial do gene 16S rrna, ECC (5 - AGAACGAACGCTGGCGGCAAGCC - 3 ) e ECB (5 - CGTATTACCGCGGCTGCTGGC - 3 ), e no PCR nested para amplificação da espécie E. canis foram ECAN (5 - CAATTATTTATAGCCTCTGGCTATAGGA- 3 ) e HE3 (5 -TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT - 3 ), que amplificam fragmentos de 458 e 398 pares de bases, respectivamente (MURPHY et al.,

30 1998). O produto de amplificação foi fracionado por eletroforese em gel de agarose 2 e 1.5%, respectivamente para Leishmania chagasi e para E. canis e analisado em transiluminador (UV-300nm). 3.8 Imunohistoquímica para parvovírus canino Adicionalmente, amostras de biopsia de medula óssea [fragmentos de 2x5mm, obtidas por meio de cânula para biopsia de medula óssea (13GX10cm, Biomedical, São Paulo, Brasil)] dos caninos com menos de um ano de idade foram testadas pela técnica de imunohistoquímica (OLIVEIRA et al., 2009) para parvovírus canino. 3.9 Desfecho clínico Os cães foram acompanhados quanto à evolução do quadro clínico, durante a abordagem terapêutica da pancitopenia, e isto foi confrontado com a severidade das citopenias Estatística A associação entre os resultados obtidos neste estudo foram avaliados através do software R ( pelo teste de qui-quadrado ou exato de Fischer. As diferenças foram consideradas significantes quando o valor p foi < 0.05.

31 4 RESULTADOS 4.1 Ocorrência de pancitopenia No período do estudo, foram realizados 3840 hemogramas de 3120 caninos com diversas alterações clínicas, dentre os quais 167 (5.4%) apresentaram pancitopenia. Destes, 65 (2.1%) cães compuseram o grupo de caninos nos quais a medula óssea foi examinada. 4.2 Dados dos animais A idade média dos cães avaliados foi de 3.5 anos, variando de dois meses a 13 anos. As fêmeas foram representadas por 38 (58.5%) animais e machos 27 (41.5%). Cães com raça definida incluíram 37 (56.9%) indivíduos, enquanto 28 (43.1%) não apresentavam definição de raça. Os sinais clínicos mais frequentes foram anorexia (56 = 86.2%), linfadenomegalia (47 = 72.3%), palidez de mucosas (45 = 69.2%), emagrecimento (38 = 58.5%) e sinais digestórios (33 = 50.8%). O uso de drogas mielossupressoras não foi relatado pelos proprietários. Em relação à vacinação, 39 (60%) dos caninos foram vacinados com vacinas polivalentes, incluindo imunização contra parvovirose e cinomose. 4.3 Ocorrência e severidade de citopenias De acordo com os achados no eritrograma, a forma mais frequente de anemia foi a severa, em 29 (44.6%) cães, seguida por anemia leve em 22 (33.8%) e moderada em 14 (21.6%). Em relação a neutropenia, 23 (35.4%) cães apresentaram a forma leve, 19 (29.2%) a forma severa, 15 (23.1%) apresentaram leucopenia sem neutropenia e 8 (12.3%) moderada. Trombocitopenia severa foi a forma mais frequente, em 33 (50.8%) cães, seguida por trombocitopenia moderada em 28 (43.1%) e leve em quatro (6.1%) cães.

32 4.4 Alterações quantitativas Alterações quantitativas foram averiguadas em todos os animais (Tabela 2) incluindo a interpretação conjunta de RME e celularidade (Figura 4). Tabela 2 - Interpretação de RME e celularidade em caninos pancitopênicos, avaliados no período de maio de 2012 a maio de RME Celularidade Interpretação Caninos Normal Normal 17 (26,2%) Normal Aumentada Hiperplasia mielóide e eritróide 16 (24,6%) Diminuída Hipoplasia mielóide e eritróide 17 (26,2%) Normal Hiperplasia mielóide e hipoplasia eritróide 1 (1,5%) Aumentada Aumentada Hiperplasia mielóide 3 (4,6%) Diminuída Hipoplasia eritróide 2 (3,1%) Normal Hiperplasia eritróide e hipoplasia mielóide 3 (4,6%) Diminuída Aumentada Hiperplasia eritróide 1 (1,5%) Diminuída Hipoplasia mielóide 5 (7,7%) 4.5 Contagem de megacariócitos

33 Em relação à contagem de megacariócitos, 40 (61.5%) animais apresentaram estimativa baixa de megacariócitos (zero megacariócitos/campo), sendo que 24 (36.9%) apresentaram trombocitopenia severa, 13 (20%) moderada e três (4.6%) leve. Estimativa normal de megacariócitos foi visualizada em 25 (38.5%) animais, que apresentaram um a seis megacariócitos/campo, sendo que 15 (23.1%) destes apresentaram trombocitopenia moderada, seguida por nove (13.8%) com severa e um com trombocitopenia leve. 4.6 Diagnóstico etiológico A etiologia foi firmada em 46 (70.8%) animais. De 17 (26.2%) animais que não apresentaram alterações medulares, em seis (9.2%) casos não foi possível obter diagnóstico, cinco (7.7%) apresentaram-se positivos para E. canis, quatro (6.2%) para L. chagasi, um para Babesia sp. (Figura 5) e outro para Babesia sp e E. canis associados. Hiperplasia mielóide e eritróide foi observada em sete (10.8%) cães positivos para E. canis, três (4.6%) cães para L. chagasi, três (4.6%) cães foram inconclusivos, dois (3.1%) apresentaram co-infecção por L. chagasi e E. canis e um apresentou gamontes de Hepatozoon sp (Figura 5). Dois casos de infecção por E. canis e três inconclusivos mostraram quadro de hipoplasia mielóide, enquanto hipoplasia mielóide e eritróide ocorreu em seis cães com anemia aplásica idiopática, cinco (7.7%) cães com diagnóstico inconclusivo, seguido por infecção por E. canis em três (4.6%), por L. chagasi em um, anemia aplásica associada a sepse e infecção fúngica sistêmica em um e em outro com aplasia associada a positividade para L. chagasi. Hiperplasia eritróide ocorreu em um cão com sinais de hemólise e infecção por E. canis (Figura 5). Enquanto a hiperplasia eritróide associada a hipoplasia mielóide ocorreu em três cães: um com infecção por E. canis, um com corpúsculo de Lentz e em outro não foi firmado diagnóstico etiológico. Hipoplasia eritróide foi observada em um cão infectado por E. canis e outro com insuficiência renal crônica. A hipoplasia eritróide somada a hiperplasia mielóide foi observada em um cão infectado por E. canis, no

34 entanto, hiperplasia mielóide (Figura 5) ocorreu no total de três cães, em dois com infecção por L. chagasi e em outro sem diagnóstico da etiologia. Cães que apresentavam aplasia medular (Figura 4) e nenhum histórico ou exame complementar que sugerisse a causa desta condição medular foram diagnosticados como anemia aplásica idiopática e perfizeram sete (10.8%) animais deste estudo. A média de idade destes cães foi de 3.8 anos, variando de 4 meses a 11 anos. Seis (9.2%) cães apresentaram anemia severa e um apresentou anemia moderada. Todos os cães apresentaram neutropenia e trombocitopenia severas. Um dos cães com anemia aplásica apresentou sepse e infecção fúngica sistêmica secundários, evidenciados pelo isolamento de Staphylococcus sp. na hemocultura e pela visibilização de hifas e leveduras em fígado, baço e pulmão, com confirmação pela PCR com o gene 18S. A B C Figura 4. Fotomicrografia de mielograma de cão pancitopênico. Coloração de Giemsa. Aumento de 10x. A - Hipo/aplasia medular. B Hiperplasia medular. C Celularidade normal medular. Aumento de 20x. Fonte: Arquivo pessoal.

35 Os animais testados para parvovírus canino pela técnica de imunohistoquímica compreenderam 13 de 18 animais com menos de um ano de idade e foram todos não-reagentes. 4.7 Desfecho clínico Dos 65 cães, 17 (26.2%) vieram a óbito durante abordagem terapêutica da doença primária. Nove (13.8%) foram submetidos à eutanásia. Dentre os 19 (29.2%) animais que apresentaram neutropenia severa, 12 (18.5%) foram a óbito. Em relação ao desfecho clínico, todos os animais com anemia aplásica idiopática foram a óbito. A B C D Figura 5. Fotomicrografia de mielograma de cão pancitopênico. Coloração de Romanowsky. A Gamonte de Hepatozoon sp em leucócito. Aumento de 100x. B Babesia sp intraeritrocitária. Aumento de 100x. C Hiperplasia eritróide. Aumento de 40x. D Hiperplasia mielóide. Aumento de 40x. Fonte: Arquivo pessoal. 4.8 Associações estatísticas

36 Associações significativas entre o diagnóstico etiológico e a severidade de citopenias encontram-se na tabela 3. Tabela 3 - Associações estatisticamente significantes entre severidade de citopenias e diagnóstico etiológico, avaliados em cães pancitopênicos no período de maio de 2012 a maio de Diagnóstico Citopenia Valor de p Aplasia idiopática Trombocitopenia severa Neutropenia severa 0,013 E. canis Trombocitopenia moderada L. chagasi Trombocitopenia moderada 0,09 Babesia sp Neutropenia moderada Houveram associações estatisticamente significativas entre severidade de citopenias e algumas alterações quantitativas, independente da etiologia,encontradas na tabela 4.

37 Tabela 4 - Severidade de achados hematológicos e características quantitativas de medula óssea em cães pancitopênicos, avaliados no período de maio de 2012 a maio de Interpretação mielograma Normal Hiperplasia mielóide e eritróide Hipoplasia mielóide Hipoplasia mielóide e eritróide Hiperplasia eritróide e hipoplasia mielóide Hiperplasia mielóide Hipoplasia eritróide Hiperplasia eritróide Hipoplasia eritróide e hiperplasia mielóide Severidade Leve Moderada Severa Citopenias Sem neutropenia* P- value Anemia Neutropenia = Linfopenia e eosinopenia Anemia Neutropenia = Linfopenia e eosinopenia Anemia ,251 Neutropenia = eosinopenia 0,009 Anemia ,045 Neutropenia = linfopenia 0,002 Anemia Neutropenia Anemia ,093 Neutropenia Anemia Neutropenia Anemia Neutropenia Anemia Neutropenia = Linfopenia 0.231

38 5 DISCUSSÃO A prevalência de pancitopenia encontrada (5.4%) é maior do que as relatadas em outros locais, fato que se deve a endemicidade de algumas doenças infecciosas que a causam, como a EMC (SILVA et al., 2010) e a LVC (ALMEIDA et al., 2012)que representaram 37 (56.9%) casos. Um estudo nos Estados Unidos avaliou 4560 animais onde 2.4% foram pancitopênicos (WEISS, EVANSON e SYKES, 1999). Outro estudo no mesmo hospital-escola identificou o caráter não-endêmico para algumas doenças na região, pontuando como um possível fator que explicaria a menor prevalência encontrada por eles (WEISS, 2006). Autores relatam não haver predisposição sexual para pancitopenia. Predisposição racial também não foi associada (BRAZZEL e WEISS, 2006). Os sinais clínicos relatados, em sua maioria, foram inespecíficos. Os sinais clínicos decorrentes da pancitopenia são relacionados à menor taxa de células (anemia, leucopenia e trombocitopenia) e a afecções subjacentes (KEARNS e EWINGS, 2006). Não foi relatado uso de drogas mielossupressoras, o que foi representativo em outro estudo, devido ao amplo serviço de oncologia desenvolvido naquela localidade (WEISS, 2006), o que não ocorre no local do estudo. A maior parte dos animais apresentou anemia e trombocitopenia severas. Em casos de envolvimento de células precursoras ou progenitoras na medula óssea, as citopenias apresentam-se como moderadas a severas, em injúrias de evolução crônica, o que pode ter ocorrido nestes casos. Já em doenças de evolução aguda, trombocitopenia e leucopenia podem ocorrer antes de anemia, geralmente leve, devido ao maior período de meia-vida dos eritrócitos (KEARNS e EWINGS, 2006). Os animais que apresentaram estimativa normal de megacariócitos, em sua maioria apresentaram trombocitopenia moderada a severa, o que pode ser atribuído à estimulação de megacariócitos para sintetizar plaquetas em maior quantidade devido a uma destruição imunomediada (MATHAI et al., 2009). A ausência de alterações medulares foi observada em grande parte dos animais, seguida por hiperplasia das séries mielóide e eritróide. Este fato aliado

39 à pancitopenia permite inferir que a origem das citopenias se deve a destruição periférica, sequestro ou hematopoiese inefetiva onde a morte celular pode ocorrer no compartimento intramedular (KEARNS e EWINGS, 2006; STOKOL, 2010). Apesar de não terem sido identificados casos de parvovirose, infecções virais podem atacar células-tronco, causando hipoplasias transitórias, o que pode ter ocorrido com o animal com indícios de infecção pelo vírus da cinomose. A meia-vida curta de neutrófilos acentua o efeito de uma redução transitória na sua produção e pode resultar em leucopenia (REBAR, 1993). Apesar de haver hiperplasia, é sabido que o vírus da cinomose pode levar a um alto índice apoptótico, levando a citopenias em sangue periférico (ALMEIDA et al., 2009). Os casos aqui descritos de hiperplasia mielóide podem ter ocorrido devido à infecção por L. chagasi, que é considerada uma doença crônica. Em casos de inflamação crônicos, todos os compartimentos granulocíticos medulares estarão aumentados, assim como a celularidade medular (REBAR, 1993; IKEDAGARCIA et al., 2008). Hiperplasia eritróide, que foi decorrente de erliquiose nesse estudo, ocorre quando há aumento na demanda periférica de eritrócitos, como nos casos de hemólise. Os animais com babesiose, embora apresentassem valores de RME normal, estes estavam próximos ao limite inferior, sugerindo que pudessem estar evoluindo para uma hiperplasia eritróide. Na maioria dos casos, a medula é coletada após ter sido instalada uma anemia significante, de severidade considerável, como nos animais que apresentaram o achado medular, devido a hemólise de duração prolongada (REBAR, 1993). Cães pancitopênicos devem ser avaliados quanto à possibilidade de desenvolver sepse ou ainda de esta ser a causa da pancitopenia. Uma forma de diferenciar se a septicemia é a causa ou uma consequência da condição hematológica, é a presença ou ausência de desvio à esquerda de neutrófilos ao hemograma. A ausência deste, como no caso do animal citado, sugere que a supressão medular está ligada a outra causa e a condição de sepse é secundária, já que na sepse como causa primária de pancitopenia, há um aumento na leucopoiese e na mobilização de células maduras, resultando no desvio à esquerda (WEISS, 2005).

40 Além dos casos discutidos, a pancitopenia pode ocorrer ainda em casos onde há alteração de apenas uma linhagem medular, que pode ser explicada pelo fato de que uma citopenia pode levar a outras por mecanismos imunomediados (JAIN, 1993). A frequência de casos de anemia aplásica idiopática encontrada foi relativamente alta. A faixa etária dos cães acometidos foi ampla, quando comparado a outros estudos. A patogênese não é clara, mas pela resposta a terapia imunossupressora que alguns pacientes apresentam, há indícios de que apresente mecanismo imunomediado (WEISS, EVANSON e SYKES, 1999; WEISS, 2003; BRAZZEL e WEISS, 2006). Na ocorrência de pancitopenia, pode-se deduzir que o quadro de aplasia é crônico, já que o tempo de meiavida de eritrócitos é longo, sendo a última citopenia a ocorrer (FELDMAN, ZINKL e JAIN, 2000). Muitos casos de pancitopenia aplásica não são frequentemente diagnosticados. Em um hospital-escola, 77.8% dos cães com pancitopenia e hipocelularidade medular não obtiveram diagnóstico etiológico a partir do esfregaço de medula óssea ou por análise de histórico de exposição desses animais a agentes causadores de mielossupressão. Os autores relacionaram, então, a um diagnóstico de pancitopenia aplásica idiopática (BRAZZEL e WEISS, 2006). Mais da metade dos animais que apresentavam neutropenia severa evoluiu para óbito durante a abordagem terapêutica. O desfecho clínico da pancitopenia depende da causa associada, por isso é necessário um diagnóstico conclusivo para que se trace um prognóstico (WEISS, EVANSON e SYKES, 1999).