2. METODOLOGIA 3. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
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- Ronaldo Lage Farias
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1 4 1. INTRODUÇÃO A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) possui uma incidência de 15% a 20% de todas as leucemias no adulto, equivalendo a 1,6 casos por 100 mil habitantes. Esta doença apresenta uma maior predominância no sexo masculino, e sua incidência aumenta em indivíduos após os cinquenta anos. A primeira neoplasia humana relacionada a uma alteração cromossômica foi a LMC. Nowell e Hungerford em 1960, através de estudos das células de medula óssea em pacientes com LMC, observaram a presença de um pequeno cromossomo denominado Philadelphia (Ph) em 100% dessas células, o que foi considerado um marco para a citogenética tumoral 1, 2. A LMC é uma doença de origem clonal, caracterizada pela presença do cromossomo Philadelphia (Ph), que resulta da fusão dos genes BRC e ABL através de uma translocação recíproca entre os braços longos dos cromossomos 9 e 22 (t(9;22) (q34;q11)). Este rearranjo desencadeia a produção de uma proteína com atividade tirosino quinase desregulada, levando a uma expansão de células hematopoiéticas 3, 4. O fator de risco mais comumente associado ao surgimento da LMC é a exposição a radiações ionizantes em altas doses. Acredita-se que os agentes químicos, biológicos e a predisposição genética não exercem muita influência no aparecimento dessa doença 3. Este tema traz a importância de haver diferentes parâmetros e as limitações para o diagnóstico laboratorial completo da Leucemia Mielóide Crônica, assim como a necessidade de se identificar o nível em que a doença se encontra, para que dessa forma a terapêutica seja eleita adequadamente, aumentando as chances de remissão completa da doença. Esta revisão visa compilar os métodos de identificação da LMC sob a organização de um fluxo diagnóstico.
2 5 2. METODOLOGIA Trata-se de uma revisão bibliográfica onde foram realizadas as seguintes etapas: identificação do problema (elaboração do tema, estabelecimento das palavras-chave e dos critérios de inclusão/exclusão de artigos), seleção de artigos e análise qualitativa dos dados. A fase da coleta dos dados ocorreu no início de novembro de 2012 até o mês de março de A análise qualitativa dos dados efetivou-se pelo emprego da apreciação do conteúdo temático. A primeira fase desse processo foi a pré-análise que constituiu na seleção e na organização do material, com a realização da literatura flutuante e a constituição do corpus; a segunda etapa abrangeu a exploração do material e na terceira etapa, foi feito o tratamento dos dados. O levantamento foi realizado através da internet, nos seguintes bancos de dados da Biblioteca Virtual de Saúde (BVS): Base de dados digital produzida pela NLM National Library of Medicine, USA (PubMed), Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciências da Saúde (Lilacs), Literatura Internacional em Ciências da Saúde (Medline) e Scientific Electronic Library Online (SciELO). Além disso, foram utilizados dados presentes em livros base na área estudada, bem como prospectos e anexos relacionados ao tema proposto, revistas não indexadas onde a importância justifique a ação, publicados entre os anos de 2003 a Foram excluídos artigos que não estavam de acordo com o objetivo e tema proposto do trabalho e/ou estavam repetidos em mais de uma base de dados, e em idiomas diferentes do português, inglês e espanhol. 3. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Existem diversas metodologias que levam ao diagnóstico da leucemia mielóide crônica, envolvendo desde exames de rotina que apenas sugerem a patologia, aos altamente especializados. Tais exames são complementares entre si, e o fluxo diagnóstico segue a lógica da persistência da suspeita a cada etapa realizada. Diante de um elevado número de granulócitos ao hemograma, deve-se investigar a princípio se é decorrente de infecção e/ou inflamação. O exame de fosfatase alcalina
3 6 leucocitária irá distanciar a suspeita das causas infecciosas/inflamatórias quando for observada redução da atividade desta enzima, apontando para a possibilidade de doença mieloproliferativa. A investigação diagnóstica deverá então ser conduzida adiante, com a avaliação do estado medular a partir de um mielograma acompanhado de biópsia medular. Se nos exames citogenéticos (cariótipo ou hibridização in situ por fluorescência) for identificada a presença do cromossomo Philadelphia, está diagnosticada a LMC. Caso o cromossomo não seja evidenciado no exame, o passo seguinte é a realização do método Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) qualitativo para detecção do produto do gene BCR-ABL. A presença do transcrito do BCR-ABL é patognomônica de LMC. O PCR quantitativo é o método mais sensível para monitoramento pós tratamento, dada a sua alta capacidade de detecção de uma única célula leucêmica entre centenas de milhares de células normais. 3.1 Hemograma A manifestação inicial da LMC normalmente é insidiosa, de modo que muitas vezes a suspeita diagnóstica parte de exames laboratoriais de rotina realizados sem que haja sintomatologia associada 5,6,7. O diagnóstico desta doença se dá, a princípio, através das alterações presentes no hemograma, principalmente à análise microscópica do esfregaço de sangue periférico (SP). Em 95% dos casos há uma acentuada leucocitose que frequentemente supera a ordem de células/ mm 3, e pode exceder células/ mm 3 2,7. Porém, apesar de usualmente elevada, em alguns casos a contagem global de leucócitos pode ser normal ou até mesmo reduzida, inclusive com neutropenia. A LMC possui três fases marcadas por critérios hematológicos que permitem diferenciá-las 2,8 : Fase crônica: Presença de granulócitos em todas as fases de maturação no SP, com predominância de granulócitos maduros em comparação com a linhagem mais jovem (blástica) 2,5. Há, porém, um desvio à esquerda não escalonado devido à presença significativa de mielócitos. As contagens de blastos e promielócitos normalmente estão abaixo de 10%. O eritrograma revela-se com ausência de
4 7 anemia ou discreta anemia normocítica e normocrômica. Plaquetas situam-se dentro dos valores de referencia no princípio da doença, com desenvolvimento de plaquetose evidente no curso da fase crônica, com valores acima de / mm 3 8. Figura 1 Fase crônica da LMC: Todos os graus de maturação granulocítica presentes no sangue periférico, de forma escalonada Fase acelerada: Na maioria dos casos, há uma evolução para esta fase da doença, caracterizada pelo aumento na contagem global de leucócitos, com aumento na porcentagem de células blásticas e promielócitos (figura 2), entre 10 e 19% no sangue periférico ou na medula óssea. A basofilia inexplicada (> 20% de basófilos) é um achado comum (figura 3), e um maior número de basófilos no sangue periférico está associado a um pior prognóstico 2,5. Pode haver presença de uma plaquetopenia com valores abaixo de plaquetas /mm 3, ou pelo contrário, uma plaquetose acima de de plaquetas/mm 3. Figura 2 Aumento no número de blastos 8 Figura 3 Intensa basofilia Fase Blástica: Geralmente a transformação da fase crônica até a fase acelerada ocorre de forma lenta, progredindo por último para a fase blástica, mas há casos de rápida evolução da fase crônica à blástica. De acordo com os conceitos da
5 8 organização mundial de saúde (OMS), a fase blástica torna-se evidente quando há presença de mais de 20% de blastos no sangue periférico ou na medula óssea figra 4), quando há proliferação extramedular dos blastos, ou na presença de grandes agregados de blastos à biópsia de medula 2,8,9. Figura 4 - Numerosos blastos em sangue periférico 3.2 Fosfatase Alcalina Leucocitária A fosfatase alcalina leucocitária (LAPA) constitui um importante parâmetro para diferenciar a LMC das reações leucemóides e de outras doenças mieloproliferativas, visto que se encontra significantemente reduzida ou ausente em mais de 90% dos pacientes com LMC, ao passo que se mostra elevada nas demais situações supracitadas. Durante a remissão da doença, a atividade da fosfatase alcalina leucocitária pode se manter reduzida, enquanto que nas fases aceleradas e blásticas da LMC há aumento da atividade desta enzima 3,10,7. Porém, os resultados fornecidos neste exame servem apenas para auxílio diagnóstico, devendo ser correlacionados com outros métodos de diagnóstico da LMC e com dados clínicos. Em 1929, Kay sugeriu pela primeira vez a presença da fosfatase alcalina nos leucócitos. Apenas em 1955 Kaplow introduziu um método prático de coloração para a demonstração histoquímica da atividade desta enzima, e poucos anos mais tarde, o aperfeiçoamento do método por Ackerman garantiu a expressão semi-quantitativa dos resultados 11.
6 9 B A Figura 5 - Coloração típica da reação fortemente positiva em granulócito (A), indicando intensa atividade da LAPA; ausência de coloração em granulócito (B), característica da ausência de atividade da LAPA Mielograma e Biópsia de medula As amostras para realização de mielograma e biópsia de medula óssea podem ser obtidas numa mesma punção aspirativa. O mielograma revela aumento marcante no número de elementos celulares, resultante da proliferação granulocítica. Observamse granulócitos em todos os estágios de maturação, com predomínio de linhagens celulares mais jovens, como promielócitos e mielócitos. Precursores basofílicos e eosinofílicos geralmente encontram-se aumentados, assim como o número de megacariócitos; a relação mieloeritroide é desviada a favor dos elementos granulocitopoéticos em detrimento da fração eritropoética. Em alguns pacientes, são observados macrófagos contendo pigmentação azulada, ou por vezes semelhantes às células de Gaucher. Frequentemente há dificuldade ou impossibilidade de aspiração da medula em virtude da densidade das células condensadas, ou em função da evolução a uma fibrose reticulínica medular 3,7. A biópsia de medula óssea cuja celularidade encontra-se aumentada, apresenta elevação no número de precursores neutrofílicos. Os megacariócitos apresentam-se com hipolobulação nuclear, e são menores que o normal 14.
7 10 Figura 6 - Mielograma na LMC. Neutrofilia com desvio a esquerda, eosinofilia e basofilia estão presentes Figura 7 - Biópsia de medula óssea evidenciando hipercelularidade com hiperplasia mieloide e desvio à esquerda com megacariócitos hipolobulados e aumento de células mieloides imaturas. 3.4 Estudo citogenético clássico e molecular O cromossomo Philadelphia clássico é uma alteração resultante da translocação entre os cromossomos 9 e 22 [t(9;22) (q34.1; q11.2)] presente em 90 a 95% dos casos sugestivos de LMC 3,12,13. A fusão entre os braços curtos dos referidos cromossomos dá origem a um gene quimérico denominado BCR-ABL. Existe a possibilidade de anomalias cromossômicas adicionais estarem presentes (5 a 10% dos casos), originando as variantes simples e até complexas do cromossomo Philadelphia. Variantes simples contam com a participação de um terceiro cromossomo, e variantes complexas envolvem dois cromossomos além do 9 e A pesquisa de dessas alterações cromossômicas constitui ferramenta diagnóstica crucial para a LMC, além de ser de extrema utilidade na determinação de fatores prognósticos e conduta terapêutica. Na LMC, o cariótipo medular e a hibridização in situ por fluorescência (FISH) são as duas técnicas disponíveis para monitorar a resposta citogenética ao tratamento Cariótipo O cariótipo medular é o exame de escolha para a identificação da presença e quantificação de metáfases do cromossomo Philadelphia, além de ser um dos métodos de acompanhamento do tratamento 5,12,14. Uma vez dado o diagnóstico, o
8 11 cariótipo deve continuar a ser realizado semestralmente com vistas a acompanhar a remissão citogenética completa, obtida quando se verifica o desaparecimento do cromossomo Ph. Além disso, este exame permite a detecção das anomalias cromossômicas adicionais 12, q+ 22 Ph BCR-ABL Figura 9 Ilustração do gene BCR-ABL, resultante da translocação t(9;22)(q34;q11). Figura 8 - Cariótipo de paciente com Leucemia Mielóide crônica, evidenciando a translocação entre os cromossomos 9 e FISH A hibridização in situ por fluorescência é um método mais sensível do que o cariótipo para a detecção do gene BCR-ABL, porém não é capaz de detectar as anomalias cromossômicas adicionais 12. O FISH é um método recomentado quando as alterações presentes no cariótipo são pouco esclarecedoras mas permanece a suspeita de LMC, ou na ausência de metáfases 3,12.
9 12 Figura 10 - FISH evidenciando o gene BCR e o gene ABL não rearranjados como sondas nas cores verde e vermelha, respectivamente (setas verdes). A seta vermelha indica a presença do gene BCR- ABL, na qual se observa a fusão de sondas verde e vermelha Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (RT-PCR) A detecção da translocação 9:22 nem sempre é possível por métodos citogenéticos, o que pode ser atribuído a uma amostra sem metáfases suficientes ou adequadas, e também a uma superatividade da atividade mitótica das células não-leucêmicas sobre as leucêmicas 20. A Reação em Cadeia da Polimerase qualitativa em tempo real (RT-PCR) é uma técnica extremamente sensível que permite a detecção dos transcritos formados pelo gene BCR ABL 20, sendo uma ferramenta crucial ao diagnóstico de LMC quando não há identificação da mutação nos exames citogenéticos. O tratamento da LMC visa à remissão hematológica completa, porém um restrito número de células leucêmicas persiste até a fase final do tratamento, o que caracteriza a Doença Residual Mínima (DRM). A DRM deve ser continuamente monitorada de modo a detectar possível risco de recidiva em pacientes já tratados. O grau de inibição leucêmica após tratamento pode ser avaliada através da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-PCR), a qual se tornou o padrão-ouro para monitorar quantidade de transcritos do BCR-ABL devido à possibilidade de detectar uma célula leucêmica em 10 5 células normais 18, 19.
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