SIMP.TCC/Sem.IC. 2018(13); FACULDADE ICESP / ISSN:

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1 CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA BIOTÉCNICAS DA REPRODUÇÃO APLICADAS À CONSERVAÇÃO DE FELÍDEOS SELVAGENS REPRODUCTION BIOTECHNOLOGIES APPLIED TO THE CONSERVATION OF WILD FELID Como citar esse artigo: Silva ACP, Bonorino RP. BIOTÉCNICAS DA REPRODUÇÃO APLICADAS À CONSERVAÇÃO DE FELÍDEOS SELVAGENS. Anais do 13 Simpósio de TCC e 6 Seminário de IC da Faculdade ICESP. 2018(13); Annelise Cristina Pacheco da Silva Rafael Prange Bonorino Resumo: Diante do grau de ameaça crescente à qual a maioria das populações de felídeos selvagens é continuamente submetida, é necessário direcionar esforços conjuntos e interdisciplinares para conservação dessa espécie. Com o objetivo de manter e maximizar a variabilidade genética, técnicas de reprodução são propostas como ferramentas auxiliares. Nesse sentido, instituições que fazem reprodução ex situ de felídeos selvagens compartilham a grande responsabilidade de ajudar a prevenir o desaparecimento desses carnívoros em todo o mundo. Para tanto, denota-se a importância de pesquisa científica, a necessidade de ampliar o conhecimento e aprimorar as técnicas empregadas em reprodução assistida. O objetivo desta revisão é compilar as informações disponíveis sobre as características reprodutivas da família Felidae e as biotecnias reprodutivas aplicáveis a essas espécies em perigo de extinção. Palavras-Chave: Técnicas, Reprodução, Selvagens. Abstract: Regarding the increasing threat posed upon most of wild felid populations, joint and interdisciplinary efforts need to be forwarded for their conservation. In order to keep and maximize genetic variability, breeding techniques are proposed as auxiliary tools. This way, institutions that do ex situ breeding of wild felids share the great responsibility of helping to prevent the disappearance of these carnivores worldwide. Therefore, most of the biography on this field indicates the importance of scientific research and the need to broaden the knowledge and improve the techniques used in assisted reproduction. The objective of this review is the compilation of available information on the reproductive characteristics of the Felidae family, as well as the reproductive biotechnology applicable to these jeopardized species. Keywords: Techniques, Reproduction, Wild Animals rafabonorino@hotmail.com INTRODUÇÃO A criação de populações de animais selvagens em cativeiro tornou-se um importante instrumento para a conservação de espécies, dada à crescente destruição dos ecossistemas do mundo e à consequente ameaça à vida selvagem (ADANIA, et. al., 2005). No intuito de buscar o controle dos efeitos da rápida perda de diversidade genética, esforços devem ser direcionados para a conservação da fauna em várias frentes estratégicas, tais como a reprodução de animais em cativeiro como ferramenta auxiliar (CUBAS, et. al., 2014). Há uma discussão entre pesquisadores sobre a necessidade de um maior esforço para a compreensão da biologia reprodutiva de espécies selvagens ameaçadas a fim de aumentar a eficiência reprodutiva, diminuir a taxa de mortalidade neonatal em cativeiro e criar bancos de reserva genômica (MELLEN, 1991; BROWN et. al., 1994; MORATO E BARNABÉ, 1998; MOREIRA et. al., 2001; KLEIMAN et. al., 2010). Até mesmo pesquisadores que não concordam integralmente com a estratégia de reprodução em cativeiro sugerem que, caso não haja a possibilidade de conservação das espécies em seu habitat natural, a reprodução em cativeiro pode ser uma alternativa viável (SNYDER et. al., 1996). Portanto, diante das numerosas ameaças à vida selvagem, a preocupação é investir nas ações para a conservação ex situ, para tanto, é fundamental conhecer as características fisiológicas básicas e reprodutivas das espécies. O objetivo deste trabalho é revisar e 2319

2 discutir as biotécnicas aplicadas à reprodução mais utilizadas como ferramentas para auxiliar a conservação de felídeos ameaçados. Reprodução De Felinos Selvagens No Brasil, foram relatadas oito espécies de felídeos selvagens divididos em felinos de grande porte (> 20kg), representados pelos gêneros Puma, com uma espécie e Panthera, com 1 espécie; e felinos de pequeno e médio porte (<15kg) que compreende os gêneros Leopardus com três espécies, o gênero Oncifelis com duas espécies e o gênero Herpailurus, com apenas uma espécie (PAZ, 2013). Para escapar das ameaças de extinção, métodos alternativos de manejo têm sido estudados no sentido de minimizar a diminuição da variabilidade genética das populações. Entretanto, a reprodução de animais selvagens em cativeiro enfrenta dificuldades tais como a falta de identificação taxonômica de animais por parte de profissionais que atuam em cativeiros, o que gera formações de casais de espécies distintas, porém fenotipicamente semelhantes. Essa semelhança leva à hibridização (PAZ, 2013). Outros fatores que interferem na reprodução são: recintos inadequados, estresse, doenças, deficiências nutricionais, alterações genéticas e comportamentais. (MELLEN,1991 e PAZ, 2013). Levando em consideração que a manutenção da diversidade genética é dependente da reprodução, as biotecnologias da reprodução surgem como importantes ferramentas para a preservação de espécies ameaçadas de extinção, frente à necessidade de desenvolvimento de métodos que aumentem a fertilidade desses animais, bem como técnicas que visem à reprodução por meio de métodos artificiais (HOWARD, 1993). Características Reprodutivas Gerais A sazonalidade reprodutiva é um dos fatores mais variáveis entre as espécies. Em gatos domésticos (Felis catus), o fenômeno da estacionalidade está intimamente ligado ao fotoperíodo (STABENFELDT, 1993 e Johnston et. al., 1996). Entretanto, esse fator em animais selvagens também está relacionado à maior ou menor oferta de alimento durante as estações do ano (EWER, 1975). Outro aspecto que pode variar entre as diferentes espécies de felinos é o mecanismo de ovulação. De acordo com JOHNSTON (1996) e outros autores, estudos que utilizaram dosagens hormonais séricas ou plasmáticas confirmaram que alguns felinos selvagens como tigresas (pantera tigres) (SEAL et. al., 1985), leopardo das neves (Phanthera uncia) (SCHMIDT et. al., 1993), onças pintadas (Panthera onca) (WILDT et. al., 1979) e pumas (Puma concolor) (BONNE, et. al.,1981), possuem mecanismos de ovulação reflexa ou induzida, assim como a gata doméstica. (JOHNSTON; ROOT; OSLON, 1996; SHILLE; LUNDSTROM; STABENFELDT,1979; TSUITSUI; STABENFELDT,1993). Como exemplo, MORAIS E MOREIRA (2001) citam que as fêmeas de leopardo (Panthera pardus) apresentam dois mecanismos de ovulação em duas diferentes situações: quando mantidas isoladas, mostram perfil hormonal típico de ovuladoras reflexas; quando alojadas em dupla de fêmeas, ovularam, provavelmente estimuladas pelo contato físico entre elas (SCHIMDT et. al., 1988). Leoas (Panthera leo) isoladas dos machos mostraram um padrão distinto dos demais felinos relatados. (SCHIMDT et. al.,1979). Nesse caso, foi comprovado, por dosagens hormonais séricas e visualização de corpo lúteo, que esta espécie apresenta ovulação espontânea com frequência superior a outros felinos descritos. Felinos do gênero Leopardus são poliéstricos e podem ciclar durante o ano todo, sendo o gato maracajá (Leopardus wiedii) o único no gênero apresentar ovulações espontâneas (MORAIS et. al., 1996; MOREIRA et. al., 2001). Em fêmeas de jaguatirica que ovularam e não foram fecundadas, TEBET (1999) e outros autores afirmam que houve um período de aumento das concentrações séricas de progesterona e inibição de estro, denominado de pseudogestação ou diestro, semelhante ao das gatas domésticas (TEBET, 1999 e FELDMAN; NELSON, 1996). Ao analisar do ponto de vista evolutivo, o processo de ovulação induzido ou espontâneo pode estar relacionado com o grau de sociabilidade das espécies, dentre outros fatores. Dessa forma, felinos que possuem hábitos solitários, necessitam evolutivamente de um período de estro mais longo e oócitos mais viáveis por mais tempo, a fim de que a ovulação ocorra após o encontro entre casais na natureza. (EWER,1975) 2320

3 Avaliação Reprodutiva Inicialmente, a avaliação deve incluir exame clínico, exame ginecológico ou andrológico, bem como histórico do animal e do manejo adotado. Outras abordagens incluem métodos não invasivos como o monitoramento de esteroides fecais e ultrassonografia (PAZ, 2013). A constatação de estrógenos e progestinas fecais tem sido utilizada na caracterização e monitoramento do ciclo estral e no diagnóstico de gestação em fêmeas. Por outro lado, em machos, esse diagnóstico tem sido usado na caracterização de uma possível sazonalidade pela dosagem hormonal de andrógenos, bem como para verificação da correlação volume testicular, produção espermática e quantidade de metabolitos e testosterona (PAZ, 2013). Nesse contexto, tal método de monitoração já foi realizado tanto em gatos domésticos quanto em felinos selvagens gato leopardo (Felis bengalensis), guepardo (acinonyx jubatus), pantera nebulosa (Neofelis nebulosa) e leopardo das neves (Panthera uncia) onde foi descrito com sucesso e vem sendo amplamente utilizado para avaliar a função ovariana em felinos neotropicais tais como: jaguatirica, gato-do-matopequeno e gato maracajá (MORAIS et. al., 2001). O esfregaço de células da vagina pode ser obtido por meio de escova ginecológica ou swabs com auxílio de espéculo, feito a partir da porção média da vagina e depositado, por rotação da escova, sobre lâminas histológicas. Alguns estudos sobre as espécies selvagens de felídeos neotropicais e africanos demonstraram que a técnica é útil para o estudo do ciclo estral e diagnóstico do estro (CUBAS et. al., 2014). Além disso, o uso da ultrassonografia tem sido adotado no diagnóstico de gestação de inúmeras espécies selvagens e também no diagnóstico de patologias de trato reprodutor feminino, tais como piometras e neoplasias (PAZ, 2013). Reprodução Assistida de Felinos Selvagens Muitas técnicas desenvolvidas em animais domésticos estão sendo gradualmente aplicadas em animais de zoológico (DESSER, et. al., 1986; COMIZZOLI et. al., 2000). De acordo com os estudos, inúmeras tentativas de inseminação artificial (IA) têm sido realizadas em diferentes espécies de carnívoros tais como: suçuarana (Felis concolor), leopardo (Panthera pardus saxicolor), guepardo (acinonyx jubatus), tigre pardo (Panthera pardus saxicolor), tigre (Panthera tigres altaica), jaguatirica (Leopardus pardalis) gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus) e onça pintada (Phantera onca) (DESSER et. al., HOWARD et. al., 1992 e SILVA et. al., 2000). De mesma forma, tentativas de aplicação de fertilização in vitro (FIV) têm sido feitas em felinos selvagens mantidos em cativeiro, tais como tigre (Panthera tigres altaica) e gato-domato-pequeno (Leopardus trigrinus) (DONOGHUE et. al., 1990; MORATO et. al., 2000, SWANSON et. al., 2004). Os protocolos reprodutivos artificiais ainda apresentam pouco sucesso quando aplicados em animais selvagens. Existem várias razões para isso; dentre elas, é possível destacar o pouco conhecimento da fisiologia básica das espécies, baixa qualidade do sêmen e/ou oócitos e dificuldade na adaptação de metodologias utilizadas em modelos experimentais (PAZ, 2013). Diante do pouco espaço disponível em zoológicos para manutenção de populações geneticamente viáveis de espécies ameaçadas, a criação de bancos de germoplasma com sêmen, oócitos, embriões e células surge como estratégia no sentido de garantir a diversidade genética das populações (LASLEY, et. al.,1994). Dentro dessa perspectiva, estratégias que utilizem estas técnicas serão capazes de contribuir para o desenvolvimento de um manejo adequado e para conservação de inúmeras espécies de carnívoros ameaçados (PAZ, 2013). Apesar das técnicas utilizadas para reprodução assistida em animais selvagens sejam semelhantes às utilizadas em animais domésticos, o uso confiável delas requer atenção individualizada, bem como pesquisa científica para cada espécie de interesse. Tais técnicas consistem em: colheita, avaliação e criopreservação do sêmen; inseminação artificial (IA); fertilização in vitro (FIV); transferência de embriões (PAZ, 2013). Colheita de Sêmen Existem dois métodos para a colheita de sêmen em animais selvagens. O primeiro é o método não-ejaculatório, que consiste na colheita de sêmen da cauda do epidídimo de animais que vieram a óbito ou foram submetidos à castração 2321

4 ou vasectomia. O segundo é o método ejaculatório, que consiste na recuperação do sêmen após o coito, com utilização de vagina artificial, manipulação digital ou eletroejaculação (COSTA e MARTINS, 2008). No método não-ejaculatório, ao utilizar os testiculos após o óbito ou castração, o epididimo é lavado e/ou macerado em meio de cultura HEPES acrescido de HAM S F10 e os espermatozóides são recuperados após a centrifugação. Os testículos são refrigerados a 5 C logo após o obito ou retirada dos mesmos por castração e os espermatozóides vivos podem ser recuperados até doze horas (HOWARD,1993). Os protocolos de manipulação digital ou de vagina artificial para a coleta do sêmen são indicados por promover uma ejaculação natural e ejaculados normais; no entanto, necessitam de treinamento intensivo dos animais e, por isso, são mais efetivos em canídeos do que em felinos selvagens (PAZ, 2013). O método mais utilizado em felinos selvagens é a eletroejaculação, devido ao fato de poder ser feita em animais anestesiados. Porém, em felídeos, tem a desvantagem frequente de causar contaminação pela urina sobre o líquido ejaculado nos casos em que a voltagem excede o mínimo necessário para ejaculação ou quando o eletrodo está posicionado muito cranialmente. Para minimizar essa ocorrência, uma das alternativas seria a drenagem da urina por cateterização ou cistocentese antes do início dos eletrochoques (GONÇALVES et. al., 2014). A associação de fármacos Tiletamina- Zolazepam tem sido o protocolo anestésico mais utilizado para a realização deste procedimento pelo fato de não determinar alterações significativas no líquido ejaculado. A associação de cloridrato de ketamina e cloridrato de xilazina, combinados na mesma seringa, tem sido utilizada para colheita de sêmen em pequenos felinos. Porém, segundo DOOLEY (1991), essa associação de fármacos parece estar relacionada a eventos de ejaculação retrógrada (PAZ, 2013). eventual auxílio da ultrassonografia transretal para localizar a próstata. Em leões africanos foi descrita a utilização de um cateter urinário canino (com diâmetro de 2,6 ou 3,3 mm), inserido aproximadamente 30 cm na uretra para permitir a coleta de sêmen no lúmen do cateter por capilaridade. Em ambos casos houveram relatos de sucesso com o uso dessa técnica em gato-daselva (Felis chaus) (KHEIRKHAN et. al., 2017). Avaliação do Sêmen A avaliação do sêmen é realizada em relação ao volume, ph e concentração espermática, porcentagem de motilidade, motilidade progressiva e morfologia espermática (PAZ, 2013). A análise química do plasma seminal também pode ser realizada, como a osmolaridade. Autores têm reportado os parâmetros espermáticos normais para várias espécies de felídeos (PAZ, 2013). Na prática, a motilidade espermática e a viabilidade as quais utilizam, por exemplo, a coloração com eosinanigrosina a morfologia e a concentração espermática devem ser avaliadas. Outrossim, a determinação da integridade da membrana espermática e acrossomal por meio da eletromicroscopia de transmissão ou microscopia com fluorescência, a análise química do sêmen como, por exemplo, a osmolaridade do plasma seminal e outros parâmetros podem ser importantes para a avaliação tanto do sêmen fresco como do congelado-descongelado (MOREIRA, 2017). Um outro método, mais novo, é a cateterização uretral, descrita para o gato doméstico e para espécies selvagens, como o leão-africano (LUEDERS, 2012). Nesta técnica, utiliza-se um fármaco anestésico que também estimule a liberação de sêmen na uretra, como a medetomidina (um α2-agonista), associado a outro como, por exemplo, a cetamina, com 2322

5 porcentagem de clivagem de embriões, o que mostra que o meio contendo lecitina de soja é uma alternativa efetiva à gema de ovo para a criopreservação espermática nessas duas espécies de felídeos não-domésticos (VANSANDT et.al., 2016). A substituição de um meio de criopreservação baseado em gema de ovo por uma opção quimicamente definida ou seja, livre de proteína animal pode representar um avanço no controle de qualidade e biosseguridade para o banco de sêmen de felídeos; contudo, é uma técnica que ainda deve ser testada em outras espécies (MOREIRA, 2017). Figuras 2 e 3. Colheita de semên e espículas do pênis de gato do mato pequeno (Leopardus trigrinus) Fonte: Foto Tatiane Micheletti/Itaipu Binacional Criopreservação do Sêmen em Felídeos A preservação do sêmen é uma técnica importante para a manutenção de recursos biológicos em animais selvagens e domésticos. Historicamente, o sêmen de felídeos nãodomésticos tem sido congelado em meios com gema de ovo. Entretanto, a inclusão de gema de ovo causa alterações que, resultam em possíveis variações entre partidas ou lotes na produção, contaminação microbiana e possíveis restrições regulamentares relacionadas ao transporte internacional de sêmen (MOREIRA, 2017). Em pesquisas e práticas veterinárias anteriores adota-se preferencialmente a utilização de meios comerciais pela facilidade de obtenção e maior controle de qualidade com relação aos ingredientes, tais como antimicrobianos e ovos SPF (Specific Pathogen Free) MOREIRA (2017) e VANSANDT et. al., 2016) publicaram um artigo em que testaram em gato-de-pallas (Otocolobus manul) e gato-pescador (Prionailurus viverrinus) um meio de criopreservação que continha lecitina de soja versus um meio com gema de ovo. Os resultados foram similares em relação à Um novo método de preservação foi desenvolvido para permitir que o sêmen seja armazenado por um longo período em um refrigerador a 4 C. Os espermatozóides são liofilizados em uma solução contendo 10 mm Tris e 1 mm EDTA. Ao usar esse método, o nitrogênio líquido não é requerido para o armazenamento e transporte do sêmen. Os autores demonstraram que o sêmen de chimpanzé, girafa, onça-pintada, doninha e rato-de-pelo-longo permaneceu viável após o congelamento a seco. Em todas as espécies, pronúcleos foram formados após a injeção de espermatozóides congelados a seco em oócitos de camundongos. Embora preliminares, esses resultados podem ser úteis para o futuro estabelecimento de zoológicos liofilizados para a conservação de animais selvagens (KANEKO et. al., 2014). Controle ovariano para reprodução assistida Os protocolos de estimulação ovariana, aspiração folicular para recuperação de oócitos e a sincronização de receptoras requerem tratamento com injeções intramusculares de gonadotrofinas para induzir o desenvolvimento folicular, a maturação dos oócitos e/ou ovulação. Essas gonadotrofinas exógenas, como glicoproteínas, podem persistir por dias na circulação, entre 24 e 48 horas induzir a formação de anticorpos neutralizantes e modificar o ambiente uterino pela alteração endócrina. Além disso, pode prejudicar o (s) transporte (s) do (s) embrião (ões) pelo oviduto (CUBAS et. al., 2014). É comum a aplicação das gonadotrofinas sem o conhecimento da fase inicial do ciclo estral em que se encontra a fêmea, fato que leva a respostas inconsistentes. A utilização de técnicas para indução da inatividade ovariana prévia à 2323

6 aplicação de gonadotrofinas pode ser necessária para a obtenção de respostas mais consistentes (CUBAS et. al., 2014). A Gonadotrofina Coriônica equina (ecg) e a Gonadotrofina Coriônica humana (hcg) são utilizadas, respectivamente, para estimular o desenvolvimento folicular e induzir a ovulação, produzindo uma boa resposta ovariana com uma única aplicação. Outros hormônios utilizados são o Hormônio Folículo Estimulante suíno (pfsh) e o Hormônio Luteinizante suíno (plh), que são gonadotrofinas de meia vida curta (-2h), que tem a desvantagem de requerer múltiplas aplicações para produzir uma boa resposta ovariana (CRICHTON et. al., 2003). A estimulação ovariana com sucesso para a IA e FIV/ transferência de embriões foi obtida em pelo menos um terço de todas as espécies de felídeos; porém, as taxas de prenhez têm sido menores que 20% na maioria das espécies (BROWN, 2011). A maioria dos felídeos selvagens ovula de 37 a 42 horas após a aplicação de hcg, e o sucesso da IA aumenta se as inseminações são realizadas pós-ovulação, devido à interferência da anestesia (HOWARD et. al., 1992). O principal problema com as gonadotrofinas é a variabilidade na resposta, o que torna impossível extrapolar as doses de gonadotrofinas de uma espécie para outra com base apenas no tamanho corporal. Algumas vezes, os protocolos hormonais (e.g., ecg/hcg) não induzem desenvolvimento folicular suficiente para ocorrer ovulação ou causar hiperestimulação ovariana, com consequente produção excessiva de estrógenos. Por consequência, esse hiperestrogenismo altera o ambiente uterino e afeta a fertilização, a embriogênese e a implantação (CUBAS et. al., 2014). Após a terapia com gonadotrofinas exógenas, é possível ocorrer a secreção prematura ou hipersecreção de progesterona e/ou insuficiência luteal/luteólise prematura (MACKLON et. al., 2000). Entre os felídeos selvagens estudados, a fêmea de guepardo sp. teve resposta mais consistente à administração de gonadotrofinas exógenas, provavelmente devido à ausência de folículos ovarianos ou de corpo lúteo (CL), já que frequentemente demonstra aciclia intermitente e não apresenta ovulação espontânea (DONOGHUE, 1992; e BROWN et. al., 1996). Há especulações de que essa consistência na resposta ovariana do guepardo sp. é uma das razões pelas quais a IA tem sido relativamente bem-sucedida em fêmeas tratadas com ecg/hcg. Como o CL da gata é resistente à prostaglandina, há necessidade de desenvolver protocolos que induzam ao intervalo de quiescência ovariana antes da aplicação das gonadotrofinas exógenas, o que evita tanto a hiperestimulação (no caso de folículos ovarianos preexistentes) como a hipoestimulação (no caso da presença de tecido luteal) (CUBAS et. al., 2014). Uma estratégia proposta para tentar uniformizar a resposta ovariana é a utilização de progestinas sintéticas, como o levonorgestrel, ou análogos do Hormônio liberador de Gonadotrofina (GnRH) para diminuir temporariamente a atividade ovariana antes da estimulação com gonadotrofinas (PELICAN et.al., 2008). Inseminação Artificial Entre os felídeos, a Inseminação Artificial (IA) tem sido amplamente mais aplicada do que transferência de embriões. O melhor resultado da IA seguiu-se após o desenvolvimento da Inseminação laparoscópica, que permitiu a visualização da resposta ovariana após o tratamento com gonadotrofinas e a deposição direta de espermatozóides na porção cranial do(s) corno(s) uterino(s), ipsilateral ao ovário que apresentou ovulação. Entretanto, essa técnica ainda precisa ser aprimorada, especialmente nas espécies de pequeno porte, como o gato-domato-pequeno (MOREIRA, 2009). A eficácia na maioria das espécies tem sido baixa, com porcentagem de prenhez pós-inseminação inferior a 10% e frequente baixa sobrevivência da prole devido a problemas intrínsecos de saúde ou de agressão e negligência materna (CUBAS et. al., 2014). Em pequenos felídeos, uma barreira efetiva para aplicação da IA tem sido a baixa sobrevivência dos espermatozóides após a criopreservação e o descongelamento, especialmente levando-se em conta o baixo número total de espermatozóides recuperados. Embora a IA possa ser preferível por ser mais simples, a baixa disponibilidade de espermatozóides viáveis pode favorecer a aplicação de FIV e transferência de embriões (SWANSON, 2006). Animais híbridos, oriundos de cruzamentos 2324

7 de subespécies distintas ou genéricos, podem ser utilizados para pesquisa ou, no caso de fêmeas, também como receptoras para transferência de embriões (CUBAS et. al., 2014). De maneira geral, o sucesso do método de inseminação em carnívoros é influenciado pelo local de deposição do sêmen. Nas inseminações artificiais em que ocorre deposição do sêmen na vagina, ou seja, que utilizam métodos nãocirúrgicos, os resultados apresentados são inferiores quando comparados ao método cirúrgico com depósito de sêmen diretamente no corno uterino. Esse fato pode ser explicado pela necessidade da contenção química dos animais, já que a anestesia comprometeria o transporte do sêmen em fêmeas inseminadas pelo método nãocirúrgico (HOWARD,1993). A técnica de IA por vídeo-laparoscopia foi desenvolvida para que o depósito de sêmen fosse realizado de maneira menos invasiva, diretamente no corno uterino, onde ocorre a fertilização. Seguindo os protocolos de estimulação ovariana, os animais devem ser inseminados no período de 24 a 48 horas após a administração de hcg ou plh, ou seja, após o processo de ovulação, em que há necessidade de anestesia inalatória para a realização do procedimento (PAZ, 2013). Essa metodologia resultou em um aumento de 46% na gestação de guepardos sp. (HOWARD,1992). Da mesma forma, DONOGHUE (1993), relata o nascimento do primeiro filhote de tigre (Panthera tigres altaica) do programa SSP (Siberian Tiger Species Survival Plan), após esse procedimento de inseminação em femeas estimuladas com hcg e ecg. Este resultado demonstrou, pela primeira vez, a importância da reprodução assistida na produção de indivíduos geneticamente viáveis à população a partir de cruzamentos recomendados por um programa de manejo (DONOGHUE,1993). Produção e Fertilização in vitro A recuperação de oócitos para procedimentos de FIV é realizada pela técnica de laparoscopia. A visualização dos ovários e recuperação de oócitos em carnívoros é espécieespecífica. Os ovários dos felinos são facilmente acessados e os folículos são facilmente aspirados (PAZ, 2013). Tentativas de aplicação da FIV em animais selvagens após aspiração folicular por laparoscopia, recuperação de oócitos postmortem ou ovariohistectomia têm sido realizadas. Segundo SWANSON (1998), oócitos podem ser coletados de ovários refrigerados, com os quais é possível utilizar a técnica de aspiração folicular, com agulha e seringa descartáveis, ou a técnica de dilaceração do ovário e recuperação dos oócitos, com auxílio de estereomicroscópio. Esta segunda técnica é mais utilizada em animais de pequeno porte, que possuem ovário de pequeno diâmetro e nos quais a aspiração folicular é difícil de ser realizada. O meio de cultura indicado para aspiração e dilaceração dos ovários é o M199 (PAZ, 2013). A FIV é uma técnica bastante utilizada em animais silvestres, tendo sido testada em diversas espécies de felídeos neotropicais, como em gatos-do-mato-pequenos e jaguatiricas (SWANSON, 2001; SWANSON et. al., 2002) e em onças-pintadas (MORATO et. al., 2000). Apesar de ser uma técnica relativamente simples, a partir do momento em que se possui o oócito maturado e o sêmen capacitado, a produção in vitro de embriões (PIV) apresenta baixa taxa de sucesso para certas espécies de felídeos, mesmo quando os oócitos recuperados para o procedimento são de boa qualidade (MORATO et. al., 2000). A injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) é uma técnica de reprodução assistida que compreende uma alternativa à FIV convencional. Consiste na injeção de um único espermatozóide no interior do citoplasma do oócito com o auxílio de micromanipuladores. A ICSI pode ser utilizada para a obtenção de embriões em casos de problemas de infertilidade relacionados aos espermatozóides como: disponibilidade de espermatozóides em número limitado, espermatozóides imóveis ou com má morfologia (MICHELETTI et. al., 2011). A vantagem da IA em relação à ICSI e à FIV reside no fato de ser uma técnica aperfeiçoada e bastante utilizada em diversas espécies, a qual já permitiu a geração de filhotes em nove espécies de felídeos (Swanson e Brown, 2004; Swanson, 2006), incluindo a jaguatirica e o gato-do-mato-pequeno, as quais foram as primeiras gestações de felídeos silvestres por IA no Brasil (MORAES et al, 1997). Embora a ICSI e a FIV apresentem maior probabilidade de gerar embriões viáveis, já que há um maior controle do ambiente uterino e maiores chances de fecundação do oócito pelo 2325

8 espermatozóide, existem diversas vantagens na utilização da IA. Uma delas é o fato de ser um procedimento relativamente simples, embora ainda dependente do aperfeiçoamento de protocolos de indução do desenvolvimento folicular e da ovulação. Outra vantagem da IA é a possibilidade de utilização tanto de sêmen resfriado quanto do criopreservado, o que torna desnecessário o transporte de animais de uma instituição a outra para fins de acasalamento (MICHELETTI et. al., 2011). POPE e outros autores (1998) realizaram um dos primeiros trabalhos com a técnica de ICSI, onde produziram 10 embriões a partir de 18 oócitos recuperados de uma fêmea de gatomourisco (Puma yagouaroundi). Dentre os 10 embriões produzidos, cinco haviam sido inseminados com sêmen fresco e cinco com sêmen criopreservado. Embora não tenha ocorrido nenhum nascimento após a transferência dos embriões para gatas domésticas (transferência interespecífica), o trabalho demonstrou que a ICSI pode ser aprimorada e aplicada com sucesso em felídeos silvestres (POPE et.al., 1998). Em um estudo prévio, POPE e outros autores (1993) demonstraram que é possível a transferência interespecífica de embriões de gatos selvagens asiáticos (Felis sylvestris ornata) para gatas domésticas, com nascimento de filhotes viáveis. Essa técnica, porém, é extremamente dependente das espécies trabalhadas e dos protocolos utilizados; portanto, é necessário um desenvolvimento maior dessa alternativa a fim de possibilitar sua utilização de maneira eficiente em diferentes espécies. A ICSI é uma das técnicas de reprodução assistida mais caras em razão do custo do micromanipulador que realiza a injeção do espermatozóide. Em contrapartida, é também a técnica que pode apresentar a maior taxa de sucesso na concepção de embriões devido à precisão com que a fecundação é conduzida. Além disso, é uma técnica pouco utilizada em projetos de pesquisa sobre reprodução de animais silvestres, sendo raros os trabalhos produzidos até o momento (POPE et.al., 1993). Trabalhos com o uso dessa técnica foram desenvolvidos em leão (Panthera leo) e gatopescador (Prionailurus viverrinus), com bons resultados na obtenção de embriões a despeito de não ter ocorrido nenhum nascimento (POPE et. al., 2006 e MICHELETTI et. al., 2011). No Brasil, os primeiros embriões a serem produzidos foram de onça pintada (panthera onca). A estimulação ovariana com pfsh/plh produziu aproximadamente 25 folículos/fêmea (>80%); no entanto, apesar da recuperação de oócitos de excelente qualidade, as porcentagens de fertilização foram muito baixas (<25%) (PAZ, 2013). Transferência de embriões A transferência de embriões (TE), permite recolher embriões de uma fêmea doadora e transferi-los para fêmeas receptoras com a finalidade de completarem o período de gestação. Sua importância básica para reprodução animal consiste na possibilidade de uma fêmea produzir um número de descendentes muito superior ao que seria possível obter fisiologicamente durante sua vida reprodutiva (FIGUEIREDO et. al., 2008). A TE fornece base técnica para viabilizar a implementação de outras biotecnias, tais como a produção de clones e de animais transgênicos, e tem sido importante para a preservação da diversidade genética pela criopreservação de embriões (FIGUEIREDO et. al., 2008). Até o momento, dentre os felídeos neotropicais, somente a jaguatirica produziu filhotes após a transferência de embriões congelados (SWANSON, 2001; SWANSON, 2002). Após a detecção do estro natural, a ovulação da receptora foi induzida por GnRH e os embriões foram transferidos por vídeolaparoscopia diretamente ao óstio do oviduto. Dois animais ficaram prenhes e desenvolveram gestação e partos normais, sendo uma fêmea oriunda do Zoológico de Cincinnati/USA e a outra oriunda do Zoológico de São Bernardo do Campo/Brasil (SWANSON, 2002). No entanto, apenas o filhote oriundo dos EUA sobreviveu após o parto (PAZ, 2013). Banco de Germoplasma Os bancos de germoplasma apresentam, como principal objetivo, o resgate de populações que se extinguiram ou que tenham importantes características biológicas a serem preservadas (HIEMSTRA et. al., 2005), ou ainda espécies localmente adaptadas ou em risco de extinção (RAMOS et. al., 2011). A formação de bancos de germoplasma consiste, primeiramente, na criopreservação de gametas, embriões e células somáticas em 2326

9 botijões criogênicos, no nitrogênio líquido a C, ou em sua fase de vapor a -150 C (DOMINGUES et. al., 2012). No entanto, a capacidade do material biológico de sobreviver ao processo de criopreservação depende de sua tolerância ao método específico (congelação lenta ou vitrificação), aos agentes crioprotetores, desidratação e velocidade de redução da temperatura (SANTOS et. al., 2010). No Brasil, existem bancos de germoplasma coordenados pela EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, por meio de um sistema conhecido como Plataforma Nacional de Recursos Genéticos e distribuídos para diversas instituições, como universidades federais e estaduais, institutos estaduais de pesquisa e desenvolvimento e empresas estaduais (Ferreira et. al., 2005). No tocante aos animais silvestres, o Jardim Zoológico de Brasília criou o primeiro Banco de Germoplasma de Animais Selvagens da América Latina, com a expectativa futura de perpetuação de muitas espécies da fauna brasileira, ameaçadas ou em perigo de extinção. O banco tem a finalidade de salvaguardar tanto gametas a serem utilizados em biotécnicas reprodutivas, como também células somáticas e células-tronco (FJZB, 2012). À semelhança desse projeto, o Banco Brasileiro de Germoplasma Animal (BBGA), também conhecido por Projeto Arca de Noé, tem por finalidade garantir a sobrevivência de inúmeras espécies. No mesmo local, funcionam os laboratórios de pesquisa do Centro Nacional de Recursos Genéticos e Biotecnologia da EMBRAPA (CENARGEN), onde se desenvolvem pesquisas na área de biotecnologia da reprodução animal, as quais servem de suporte ao BBGA (MATTOS, 2001). Além de identificar raça e espécies ameaçadas, o BBGA tem como objetivo a identificação de recursos genéticos, o conhecimento de suas características fenotípicas e de produção, a caracterização genética e avaliação do material coletado, assim como a valorização local dos recursos genéticos locais (BEM et al, 1997). Outra alternativa para a preservação de animais silvestres é a formação de bancos de células somáticas associadas à técnica de clonagem, uma vez que a obtenção de fibroblastos é simples, pois precisa de um pequeno fragmento de material e o cultivo de células fibroblásticas é considerado o mais apropriado para o uso de transferência nuclear de células somáticas (LEON-QUINTO et. al., 2011). CONSIDERAÇÕES FINAIS Apesar de avanços na área de reprodução assistida de animais selvagens, ainda há muito a ser desenvolvido. Para a maioria das espécies, faltam ainda trabalhos básicos de pesquisas que possibilitem futuras aplicações dessas técnicas, sendo muito variável o grau de êxito que será alcançado, já que demandam alto investimento em profissionais experientes, equipamentos e suprimentos, mas justificado pelos resultados significativos que trazem à conservação de espécies ameaçadas de extinção. Para melhorar as taxas de reprodução de espécies ameaçadas de extinção, é preciso ampliar a pesquisa básica em fisiologia reprodutiva e aprimorar as técnicas de reprodução assistida (como manipulação in vitro de gametas e embriões) e os protocolos hormonais para a indução de desenvolvimento folicular e ovulação. A biotecnologia aplicada à reprodução pode contribuir para minimizar o risco de extinção de inúmeras espécies consideradas vulneráveis ou ameaçadas e garantir um futuro para elas, tão importantes para a manutenção do equilíbrio natural do planeta. Agradecimentos Agradeço primeiramente a Deus, por iluminar sempre o meu caminho e pela oportunidade de poder a cada dia aprender mais. A minha família, amigos e professores, pelo apoio, parceria e orgulho demonstrado. A todos os profissionais da Medicina Veterinária que participaram de toda trajetória da minha graduação: Dra. Ana Carolina Rodarte, Dr. Bruno Alvarenga, Dr. Elber Costa, Dra. Juliana Pigossi, Dr. Matheus Rabello Krüger, Dr. Rodrigo Rabello, entre tantos outros, minha eterna gratidão pela ajuda, paciência e por compartilhar seus conhecimentos e experiências. Aos meus animais de estimação, pelo amor incondicional e amizade. 2327

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