Universidade Federal da Bahia Escola de Medicina Veterinária Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos

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1 Universidade Federal da Bahia Escola de Medicina Veterinária Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos AVALIAÇÃO DO SÊMEN DE CAPRINOS DA RAÇA BÖER POR MEIO DO TESTE HIPOSMÓTICO SIDNEY GONÇALVES GONZALEZ ALVES Salvador Bahia 2006

2 ii SIDNEY GONÇALVES GONZALEZ ALVES AVALIAÇÃO DO SÊMEN DE CAPRINOS DA RAÇA BÖER POR MEIO DO TESTE HIPOSMÓTICO Dissertação apresentada à Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos, na área de Reprodução Animal. Orientador: Prof. Dr. Marcos Chalhoub Coelho Lima Salvador Bahia 2006

3 iii AVALIAÇÃO DO SÊMEN DE CAPRINOS DA RAÇA BÖER POR MEIO DO TESTE HIPOSMÓTICO SIDNEY GONÇALVES GONZALEZ ALVES Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos. Salvador, 24 de outubro de Comissão Examinadora: Prof. Dr. Marcos Chalhoub Coelho Lima - UFBA Orientador Dr. Jeferson Ferreira da Fonseca EMBRAPA CAPRINOS Prof. Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho - UFBA

4 iv Dedico esta dissertação a memória de meus avós Manoel Reinaldo Alves, Albino Gonzalez Martinez, Hildete Conceição Gonçalves Gonzalez e a minha avó Maria de Lourdes Assis Alves; Aos meus pais José Carlos Assis Alves e Jacira G. G. Alves; A minha irmã Bianca G. G. Alves; E todas as pessoas que se fizeram especiais nos mais diversos momentos de minha vida.

5 v AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus e a seu filho Jesus Cristo. Agradeço a José Carlos Assis Alves, meu Pai, a minha Mãe, Jacira Gonçalves Gonzalez Alves e a minha irmã Bianca, por fazerem parte de minha vida. Ao meu orientador Dr. Marcos Chalhoub Coelho Lima, pela paciência, ensinamentos e disponibilidade. Pelo privilégio de ter sido seu aluno e por admirar seu trabalho em prol da Medicina Veterinária. Ao sempre presente professor e amigo Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho por todos os momentos e ensinamentos. Agradeço a amizade e o companheirismo de meus colegas de curso que se fizeram e se farão presentes por toda a minha vida. Em especial aos mais próximos como Alexandre Augusto, Ana Karine, Ana Paula Portela, Carmo Biscarde, Daniela Freitas, Marta Vasconcelos e Raul Santana. A meu amigo e irmão Rodrigo Freitas Bittencourt (Rodrigão), pela confiança, pela presença constante nesses anos de universidade e principalmente pelos inúmeros momentos de descontração compartilhados. Aos professores da Escola de Medicina Veterinária da UFBA, especialmente professor José Resende, por seus ensinamentos que ajudaram a compor muito do pouco que sei. Agradeço aos meus amigos e irmãos da Gbraz que a muito fazem parte de minha vida e com os quais já dividi vários momentos, sejam de alegria ou de tristeza, mas com certeza os momentos de alegria foram e serão os mais freqüentes. Agradeço a todos que de maneira direta ou indireta ajudaram-me a transpor mais esse degrau de minha vida e que vocês se mostrem presentes e continuem a auxiliar-me na minha carreira profissional. E por fim, agradeço aos Animais por tudo o que são e representam.

6 vi "Só quando se vêem os próprios erros através de uma lente de aumento e se faz exatamente o contrário com os erros dos outros, é que se pode chegar à justa avaliação de uns e de outros. (Mohandas Karamchand Gandhi)

7 vii ÍNDICE LISTA DE TABELAS ix LISTA DE FIGURAS x LISTA DE ABREVIATURAS xi RESUMO xii SUMMARY xiii 1. INTRODUÇÃO GERAL 1 2. REVISÃO DE LITERATURA O espermatozóide e seu metabolismo A membrana espermática O teste hiposmótico (HOST) Soluções hiposmóticas e osmolaridade Tempo de incubação e fixação com formol-salina tamponada EXPERIMENTO I: O teste hiposmótico na avaliação do sêmen in natura de caprinos da raça Böer: Efeito da solução, osmolaridade e tempo de incubação Resumo 16 Abstract Introdução Material e métodos Os locais e animais experimentais Colheita e avaliação seminal O teste hiposmótico Delineamento experimental Resultados e discussão Características do sêmen in natura Determinação da osmolaridade Avaliação da solução e tempo de incubação Repetibilidade intra-ensaio Conclusões Referências bibliográficas EXPERIMENTO II: Influência da solução e da osmolaridade sobre os resultados do teste hiposmótico na avaliação do sêmen congelado de caprinos da raça Böer Resumo 33 Abstract Introdução Material e métodos 35

8 viii Local e animais experimentais Congelação do sêmen Descongelação e avaliação seminal O teste hiposmótico Delineamento experimental Resultados e discussão Características do sêmen descongelado Avaliação da solução e osmolaridade Conclusões Referências bibliográficas CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS 49 APÊNCIDE 57

9 ix LISTA DE TABELAS Experimento I: O teste hiposmótico na avaliação do sêmen in natura de caprinos da raça Böer: Efeito da solução, osmolaridade e tempo de incubação. Tabela 3.1 Características físicas do sêmen in natura ( X ± s). 23 Tabela 3.2 Alterações morfológicas no sêmen in natura ( X ± s). 24 Tabela 3.3 Classificação dos espermatozóides quanto à morfologia no sêmen in natura. 24 Tabela 3.4 Percentual de reação dos espermatozóides caprinos ao teste hiposmótico em diferentes soluções ( X ± s). 25 Tabela 3.5 Percentual de reação dos espermatozóides caprinos ao teste hiposmótico em diferentes soluções e tempos de incubação ( X ± s). 27 Tabela 3.6 Variabilidade intra-ensaio do teste hiposmótico de cada ejaculado. 28 Experimento II: Influência da solução e da osmolaridade sobre os resultados do teste hiposmótico na avaliação do sêmen congelado de caprinos da raça Böer. Tabela 4.1 Características físicas do sêmen descongelado ( X ± s) 39 Tabela 4.2 Alterações morfológicas no sêmen descongelado ( X ± s) 39 Tabela 4.3 Tabela 4.4 Classificação dos espermatozóides quanto à morfologia no sêmen descongelado 40 Percentual de reação dos espermatozóides caprinos ao teste hiposmótico em diferentes soluções e osmolaridades ( X ± s) 41

10 x LISTA DE FIGURAS Figura 2.1 O espermatozóide e suas estruturas internas. 3 Figura 2.2 Representação diagramática da membrana plasmática e sua estrutura de mosaico fluido. 7 Figura 2.3 Representação gráfica dos possíveis dobramentos observados na cauda de espermatozóides submetidos ao teste hiposmótico. 9 Figura 3.1 Porcentagem de alterações observadas no teste hiposmótico conforme região da cauda do espermatozóide caprino. 26 Figura 4.1 Algumas variações de reações hiposmóticas, classificadas como cauda fortemente enrolada, apresentadas pelos espermatozóides caprinos descongelados. 42

11 xi LISTA DE ABREVIATURAS AD - Água destilada CAB - Cabeça do espermatozóide CBRA - Colégio Brasileiro de Reprodução Animal CDFA - Diacetato de carboxifluoresceína CG - Cauda geral CIT - Solução de Citrato de sódio CLO - Solução de Cloreto de sódio COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal CONC - Concentração espermática FCIT - Solução de Frutose + Citrato de sódio FRU - Solução de Frutose FST - Formol-salina tamponada GCD - Gota citoplasmática distal GCP - Gota citoplasmática proximal HO - Hiposmótico(a) HOST - Teste hiposmótico (Hypoosmotic swelling test) IA - Inseminação artificial IP - Iodeto de propídio MP - Motilidade progressiva MT - Motilidade total PI - Peça intermediária da cauda do espermatozóide PP - Peça principal da cauda do espermatozóide PT - Peça terminal da cauda do espermatozóide SAC - Solução de Sacarose SPSS - Statistical Package for the Social Sciences (Pacote Estatistico para Ciências Sociais) TURB - turbilhão ou movimento de massa VIG - vigor espermático VOL - volume

12 xii ALVES, S.G.G. Avaliação do sêmen de caprinos da raça Böer por meio do teste hiposmótico. Salvador, Bahia, f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal dos Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes fatores sobre os resultados do teste hiposmótico (HOST) para o sêmen in natura e congelado de caprinos da raça Böer. O primeiro experimento testou o efeito do tipo de solução, da osmolaridade e do tempo de incubação a 37 C sobre o percentual de reação hiposmótica do espermatozóide caprino in natura, especificamente de machos da raça Böer, e a repetibilidade na leitura desta reação. Para tal, utilizaram-se 24 ejaculados, divididos em três etapas, provenientes de cinco reprodutores. Para o HOST, foram utilizadas uma solução de água destilada (0mOsmol/Kg), duas soluções de açúcar, duas de eletrólitos e uma associação de açúcar-eletrólito, estas cinco últimas, em quatro diferentes osmolaridades: 50, 100, 150 e 200mOsmol/Kg H 2 O. Observaram-se neste primeiro experimento, resultados mais expressivos (82,30±4,49%) utilizando eletrólitos, sendo sugerida a solução de citrato de sódio a 50mOsmol/Kg H 2 O, incubada por 15 minutos a 37ºC, com uma repetibilidade na leitura de 4,26±1,68%, para a realização do HOST no sêmen in natura de caprinos da raça Böer. O segundo experimento testou o efeito da solução e da osmolaridade nos resultados do HOST para o sêmen caprino congelado. Utilizaram-se, para tal, 12 doses de sêmen, provenientes de dois reprodutores da raça Bôer, incubadas em seis soluções, sendo uma de água destilada (0mOsmol/Kg), duas soluções de açúcar, duas de eletrólitos e uma associação de açúcar-eletrólito, estas cinco últimas, em três diferentes osmolaridades: 50, 100, 150mOsmol/Kg H 2 O. A acentuada diferença osmótica entre o espermatozóide e a água destilada proporcionou à osmolaridade de 0mOsmol/Kg uma média de reação hiposmótica (56,42%) superior (P<0,05) às osmolaridades de 100 e 150mOsmol/Kg H 2 O, as quais apresentaram médias de 52,00% e 50,18% respectivamente. Os resultados observados, neste segundo experimento, e a facilidade de obtenção, apontam a água destilada como uma possibilidade de solução para realização o HOST (15 minutos de incubação a 37 C) no sêmen congelado de caprinos da raça Böer. PALAVRAS-CHAVE: Caprino; sêmen; teste hiposmótico; osmolaridade; Böer.

13 xiii ALVES, S.G.G. The hypoosmotic swelling test in goat semen of the Boer breed. Salvador, Bahia, f. Dissertation (Master s Degree in Animal Science of the Tropics) - School of Veterinary Medicine, Federal University of Bahia, SUMMARY The aim this study was to evaluate the effect of different factors on the results of hypoosmotic swelling test (HOST) in fresh and frozen goat semen of the Boer breed. In the first experiment, twenty-four ejaculated were used, of five male goats, for tested of evaluate the influence of solution, osmolarity and incubation time at 37 C on the percentile of hypoosmotic reaction of goat spermatozoid, specifically of the Boer breed, and to verify the intra-assay variability of the HOST. Were used solutions of distilled water, two solutions of sugar, two electrolytes and an association of sugar-electrolyte. The omolarity of the solutions varied from 50 to 200, at 50mOsmol/Kg H 2 O increments. The distilled water (0mOsmol/Kg) was used also as solution. It was observed, in this first experiment, better results using electrolytes. In this first experiment, the sodium citrate solution 50mOsmol/Kg H 2 O, incubated by 15 minutes, with low intra-assay variability of 4.26%±1.68, was the suggested solution for Boer goat HOST. The second experiment tested the membrane integrity frozen goat sperm using the HOST and compare different solutions in frozen semen. The parameters of total and progressive motility and mass movement of twelve semen samples were evaluated post-thaw and incubated, for 15min/37ºC, in six different solutions: distilled water (0mOsmol/Kg), two sugars, two electrolytes and sugar-electrolyte association, these five last in three different osmolarities (50, 100 and 150mOsmol/Kg H 2 O). The elevated osmotic difference between the spermatozoa and distilled water provided to 0mOsmol/Kg osmolarity an average superior reaction (56.42%) to 100 and 150mOsmol/Kg H 2 O osmolarities (P<0.05), which presented averages of 52.00% and 50.18% respectively. The distilled water, based on the observed results, in this second experiment, and in the acquisition easiness, was the suggested solution to HOST (15min/37 C) in the frozen goat semen of Boer breed, with 56% of sperm exhibiting HOST percentage. KEY-WORDS: Goat; semen; hypoosmotic swelling test; osmolarity; Boer breed.

14 1 1. INTRODUÇÃO GERAL A caprinocultura é uma atividade econômica explorada em todos os continentes, estando presente em áreas sob as mais diversas características edafoclimáticas. Entretanto, somente em alguns países esta atividade apresenta expressão econômica, sendo, na maioria dos casos, desenvolvida de forma empírica e extensiva, com baixos níveis de tecnologia (LEITE, 2000). Segundo dados de MACHADO e SIMPLÍCIO (1995) a baixa oferta e o uso irregular de machos caprinos elege a inseminação artificial (IA) como um importante instrumento na difusão de características genéticas e fenotípicas consideradas essenciais no melhoramento do rebanho caprino nacional. Isto se torna possível porque poucos machos, altamente selecionados, podem, por meio da IA, inseminar milhares de fêmeas por ano (NUNES, 2001 e FOOTE, 2002). Entretanto, os processos de colheita e manipulação do sêmen, também podem acarretar alterações deletérias à membrana plasmática do espermatozóide, comprometendo a capacidade fertilizante do ejaculado. Afinal, o espermatozóide é uma célula complexa que se torna infértil quando um dos vários aspectos bioquímicos ou morfológicos é afetado (MELO, 1999). O método tradicional para estimar essa capacidade de fertilização é a avaliação subjetiva da motilidade espermática. Segundo GARNER e HAFEZ (2003), a motilidade espermática por si só, não é um método totalmente seguro para predizer a real capacidade fertilizante do reprodutor, pois espermatozóides móveis podem apresentar alterações na membrana plasmática de difícil visualização durante a avaliação da motilidade. Por isso que, a combinação de vários fatores numa análise multifatorial seria segundo MELO (1999), o mais apropriado para o diagnóstico da funcionalidade do espermatozóide. A integridade osmótica da membrana plasmática deve ser considerada como requisito mínimo essencial à viabilidade celular, pois, a membrana plasmática é responsável, através das trocas com o meio externo, pelo equilíbrio osmótico celular. Com base nesta integridade osmótica, JEYENDRAN et al. (1984) propuseram o teste hiposmótico ou HOST (Hypoosmotic Swelling Test), como um novo ensaio na avaliação da funcionalidade da membrana plasmática do espermatozóide.

15 2 Devido a sua morfologia singular, o espermatozóide, ao ser submetido a uma condição hiposmótica, não consegue manter o equilíbrio osmótico intracelular, em decorrência do grande influxo de água para o interior da célula, sofrendo com isso, alterações na sua morfologia espermática. A metodologia empregada atualmente para o HOST é de simples confecção e tem desempenhado papel importante no diagnóstico da qualidade seminal. Contudo, na tentativa da padronização e desenvolvimento do HOST para as diversas espécies de animais domésticos, alguns pesquisadores vêm testando variações no protocolo descrito inicialmente por JEYENDRAN et al. (1984). Assim, objetivou-se neste estudo observar os efeitos de alguns fatores sobre o percentual de reação hiposmótica do espermatozóide caprino in natura e congelado, de machos da raça Böer, através da: (1) da observação da solução que promove maior percentual de reação hiposmótica (HO), (2) da osmolaridade que permite maior reação HO e (3) do tempo de incubação necessário para ocorrência desta reação.

16 3 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 O espermatozóide e seu metabolismo Os gametas masculinos ou espermatozóides são únicos entre as células quanto à forma e à função, pois, quando maduros, são células terminais, produtos finais de processos complexos de desenvolvimento, não passando por outras divisões ou diferenciações (AX et al., 2003). Os espermatozóides são células alongadas (Fig. 2.1), compostas por uma cabeça de perfil fino, que comporta o núcleo com sua cromatina altamente condensada compreendida por um número haplóide de cromossomos, e uma cauda, responsável pela motilidade celular. O espermatozóide é completamente envolto pela membrana plasmática (GARNER e HAFEZ, 2003). Figura 2.1 O espermatozóide e suas estruturas internas. (Fonte: adaptado de SENGER, 2003).

17 4 Sobre a cabeça do espermatozóide encontra-se o acrossoma ou capa acrossomal, uma fina cobertura com dupla camada de membranas que envolvem intimamente o núcleo espermático. O acrossoma contém as enzimas hidrolíticas necessárias à penetração no oócito (BRINSKO, 1999). Segundo GARNER e HAFEZ (2003), esta penetração inicia-se com a fusão do segmento equatorial do acrossoma, juntamente com a porção anterior da região pósacrossomal, à membrana oócitária durante a fertilização. Este fenômeno é denominado de reação acrossomal que, conforme observado por GONÇALVES et al. (2002), só ocorre com a capacitação do espermatozóide pelo trato genital feminino na migração espermática. A cauda do espermatozóide encontra-se dividida em quatro discretas divisões anatômicas: o colo (conexão da cauda com a cabeça), a peça intermediária, a peça principal e a peça terminal. A articulação do colo, com o núcleo espermático, ocorre em uma concavidade do núcleo identificada como fossa de implantação (BARTH e OKO, 1989). A peça intermediária apresenta-se como uma estrutura flagelar do tipo 9+(9+2), isto é: nove fibras densas que circundam nove pares de microtúbulos, e estes envolvem dois filamentos simples de microtúbulos. O axonema é composto pela estrutura 9+2 de microtúbulos sendo recoberto, junto com as fibras que o circundam, por uma bainha em forma de hélice composta por numerosas mitocôndrias (JASKO, 1992). A bainha da peça principal é composta por fibras, como se fossem costelas, e é esta característica que a distingui da peça intermediária. O annulus é a região que separa essas duas bainhas; a peça terminal está na região mais distal e começa onde termina a bainha fibrosa. Inicialmente, o arranjo 9+2 do axonema permanece intacto na peça terminal, e mais distalmente, os pares de microtúbulos dissociam-se e terminam, restando no final somente os microtúbulos centrais (BARTH e OKO, 1989). Segundo DE ROBERTIS e DE ROBERTIS JR. (1993) e STRYER (1996c), os pares de microtúbulos periféricos do axonema deslizam uns sobre os outros, para produzir o encurvamento, resultando no movimento da cauda do espermatozóide. Em uma cauda de espermatozóide intacta, os raios resistem a esse movimento de deslizamento, que é então convertido em um encurvamento local; a nexina, que é uma proteína muito distensível, mantém juntos os pares de microtúbulos durante este processo de deslizamento para que o movimento da cauda do espermatozóide possa ocorrer.

18 5 Antigamente, acreditava-se que depois de formado, os espermatozóides traziam consigo a energia necessária à sua meta fisiológica; sabe-se hoje, que estas células são capazes de efetuar trocas metabólicas com o meio onde se encontram e essas trocas são facilitadas pelo caráter filiforme do espermatozóide, o qual lhe confere grande permeabilidade (MIES FILHO, 1987). O espermatozóide maduro não possui um sistema de reparação celular, nem é capaz de sintetizar novas enzimas. Conseqüentemente, a maioria dos constituintes necessários para a função ou metabolismo espermático é sintetizada durante a espermatogênese, restando ao espermatozóide somente as funções de manutenção e produção de energia (AMANN e GRAHAM, 1992). Os espermatozóides retiram a energia necessária à sua fisiologia do substrato extracelular, sendo esta derivada principalmente dos carboidratos (AMANN e GRAHAM, 1992). Embora faltem muitas das organelas associadas aos processos metabólicos, os espermatozóides possuem as enzimas envolvidas nas reações da glicólise, no ciclo de Krebs, na oxidação de ácidos graxos e no transporte eletrônico (GARNER e HAFEZ, 2003). Os glicídios são considerados a reserva energética e o intermediário metabólico, podendo ser rapidamente mobilizados para gerar glicose, que é a principal fonte para a produção de energia (STRYER, 1996b), mas conforme observado por AMANN e GRAHAM (1992), nem todos os açúcares ou carboidratos, podem ser metabolizados pelos espermatozóides. A glicose é transportada através da membrana plasmática por proteínas específicas, proporcionando a principal fonte de adenosina trifosfato (ATP) para os espermatozóides durante o metabolismo aeróbico (SCHMITT et al., 2003). Esta atividade aeróbica fornece a maioria da energia que será convertida em ATP, e embora este ATP seja utilizado em grande parte para manter a motilidade espermática, alguma parte também é usada na manutenção dos processos ativos de transporte da membrana plasmática, impedindo a perda de componentes iônicos vitais ao espermatozóide (GARNER e HAFEZ, 2003).

19 6 2.2 A membrana espermática As propriedades biológicas e biofísicas das membranas celulares, incluindo a membrana espermática, são determinadas pela sua composição molecular. Essa composição é especialmente interessante na tecnologia da reprodução animal, pois exerce influência na fusão da membrana espermática durante a fertilização e nas mudanças físicas que ocorrem na mesma durante a capacitação espermática, a congelação e a descongelação (PARKS e GRAHAM, 1992). Segundo ZÚCCARI (1998), as membranas biológicas constituem uma barreira de permeabilidade altamente seletiva sendo a composição molecular e iônica do meio intracelular regulada por sistemas de transportes especializados, na forma de bombas e passagens moleculares. O espermatozóide de mamíferos é um exemplo de célula altamente especializada, que possui uma membrana plasmática compartimentada, que pode ser subdividida em cinco regiões conhecidas como acrossoma, segmento equatorial, lâmina pós-acrossomal, peça intermediária e peça principal/terminal (CHRISTOVAN et al., 2004). A membrana plasmática do espermatozóide é composta por uma dupla camada lipídica estruturada em um modelo chamado de mosaico fluído (Fig. 2.2), assim denominado por causa do mosaico de proteínas entre os lipídios e por que a camada lipídica é fluida, isto é: as moléculas lipídicas difundem-se rapidamente no plano da dupla camada, assim como as proteínas, a menos que sejam ancoradas por interações específicas. Esta dupla camada possui os fosfolipídios (moléculas compostas por uma cadeia de ácidos graxos hidrofóbicos e por uma cabeça polar contendo um grupo de fosfato hidrofílico) como seu componente predominante (STRYER, 1996a; HEIDEMANN, 1999). Embora, muitos componentes da membrana plasmática estejam distribuídos uniformemente ao longo da superfície do espermatozóide, cada região também contém uma população específica de antígenos, responsáveis pela sua função especializada, por exemplo, o reconhecimento da zona pelúcida (CHRISTOVAN et al., 2004).

20 7 Figura 2.2 Representação diagramática da membrana plasmática e sua estrutura de mosaico fluido. (Fonte: ZAFIAN, 1984) A membrana plasmática do espermatozóide sofre extensa remodelação devido a mudanças nas quantidades relativas de fosfolipídios, a processamento e reposicionamento de antígenos, durante a maturação epididimária e capacitação espermática, além da troca de proteínas com o líquido seminal (CHRISTOVAN et al., 2004). Por isso, a membrana plasmática é extremamente importante para a manutenção do balanço iônico celular. Lesões nessa estrutura podem resultar em morte espermática (SQUIRES et al., 1999). As técnicas de preservação de sêmen podem promover graves alterações na membrana plasmática do espermatozóide. Condições adversas como o resfriamento, por exemplo, que alteram a orientação dos lipídios, podem afetar a estabilidade da membrana ou induzir a um rearranjo das moléculas denominado de fase hexagonal II, formando pontos de fragilidade que promoverão uma permeabilidade excessiva ou mesmo, a ruptura da membrana. Esta fase hexagonal II pode ser transitória ou persistir irreversivelmente mesmo após o aquecimento (PARKS e GRAHAM, 1992). Esse resfriamento leva também a uma produção ineficiente de ATP pela célula, promovendo diversas alterações na fisiologia espermática, principalmente a abertura dos canais de cálcio promovendo posteriormente a hidrólise dos fosfolipídios danificando e aumentando a permeabilidade da membrana plasmática do espermatozóide (AMANN e PICKETT, 1987). Contrastando com outras células, o espermatozóide não tem capacidade de restaurar a membrana plasmática quando lesionada, pois a fluidez da membrana é baixa e o

21 8 espermatozóide tem uma quantidade mínima de citoplasma, tornando falha esta capacidade de síntese regenerativa (CARDULLO e WOLF, 1990). Antes do estudo de JEYENDRAN et al. (1984) ser publicado, nenhum teste, relativamente simples, com o propósito de verificar a integridade funcional da membrana plasmática do espermatozóide estava disponível. Afinal, estudos histológicos só demonstravam a integridade física da membrana plasmática, assim como a técnica de coloração supravital, que só demonstra a habilidade que o corante tem em atravessar membranas, sinalizando injúria ou morte celular. Baseando-se nesse fato, JEYENDRAN et al. (1984) conseguiram desenvolver uma técnica de fácil aplicação (teste hiposmótico), que avalia a integridade funcional da membrana espermática, podendo ser utilizada rotineiramente na clínica andrológica humana. 2.3 Teste hiposmótico (HOST) Segundo LAGARES et al. (1998), a membrana plasmática está envolvida com trocas metabólicas com o meio extracelular e, por isso a grande importância do estudo da funcionalidade da mesma, somado aos parâmetros tradicionais de avaliação da qualidade do sêmen, com a finalidade de aumentar os índices de fertilidade. Durante décadas, a integridade da membrana plasmática celular tem sido avaliada por meio da utilização de corantes. Colorações tais como a eosina/nigrosina ou o trypan-blue, também chamadas de colorações vitais, comumente são usadas para verificar a integridade física da membrana plasmática do espermatozóide (BRITO et al., 2003). Mas recentemente, colorações fluorescentes foram desenvolvidas com a mesma finalidade, principalmente para o espermatozóide criopreservado. O Iodeto de propídio (IP) que é um corante DNA-específico, cora de vermelho fluorescente somente os espermatozóides com lesões na membrana plasmática. Já o diacetato de carboxifluoresceína (CDFA), que pode ser combinado ao IP na avaliação da integridade da membrana espermática, irradia uma coloração verde fluorescente ao sofrer hidrólise quando penetra em um espermatozóide com membrana plasmática intacta (HARRISON e VICKERS, 1990). Entretanto, a necessidade de

22 9 um microscópio de fluorescência inviabiliza a utilização dessas colorações em espermiogramas feito a campo. Contudo, a avaliação da integridade física da membrana plasmática do espermatozóide, por si só, não é suficiente para predizer a possível capacidade fertilizante da célula espermática (JAGER et al., 1991), pois, a funcionalidade bioquímica da membrana plasmática, é um dos fatores que possibilita ao espermatozóide reconhecer o oócito e desencadear assim, todo o processo de penetração/fertilização. Trabalhando com sêmen humano, JEYENDRAN et al. (1984), propuseram a utilização do teste hiposmótico ou HOST (Hypoosmotic Swelling Test) na avaliação da integridade funcional da membrana plasmática do espermatozóide, baseando-se em um fenômeno denominado swelling, observado inicialmente por DREVIUS e ERIKSSON no ano de Uma das características da membrana plasmática da célula espermática é a sua capacidade de transporte seletivo de moléculas. Quando exposta a uma condição de baixa osmolaridade, a água penetra no interior dos espermatozóides para atingir o equilíbrio osmótico (INAMASSU et al., 1999). Este influxo de água aumenta o volume das células e a membrana plasmática se expande (swelling); o espermatozóide então, por apresentar morfologia singular, ao ser submetido ao choque hiposmótico tende a promover um dobramento de cauda (Fig. 2.3), dando um indicativo que estava com a membrana plasmática integralmente funcional (DELL AQUA JÚNIOR et al. 2002). Figura 2.3 Representação gráfica dos possíveis dobramentos observados na cauda de espermatozóides submetidos ao teste hiposmótico. (DELL AQUA JÚNIOR et al., 2002).

23 10 Entretanto, devido à existência de alterações morfológicas na região da cauda do espermatozóide, decorrentes de processos pré-ejaculatórios e/ou inabilidade técnica que causa, por exemplo, o choque térmico, fez-se necessário o emprego de fórmulas nas quais se diferenciassem essas alterações das ocasionadas pelo HOST. Para tal, JEYENDREN et al. (1984) propuseram uma fórmula matemática direta, na qual se multiplica o número de espermatozóides alterados após o HOST por cem e divide-se pelo total de espermatozóides contados na mesma área. CORREA e ZAVOS (1994) e VAZQUEZ et al. (1997) utilizaram uma fórmula semelhante, mas subtraíram do valor final a proporção de espermatozóides com cauda semelhante à reativa em uma amostra controle. Visando melhorar essa metodologia de cálculo, MELO (1999), após observar que a incubação espermática em soluções isosmóticas, reproduzindo o ensaio de VAZQUEZ et al. (1997), não induzia mudanças significativas na morfologia da cauda, concluiu que a própria avaliação do sêmen para a morfologia espermática, poderia ser utilizada como grupo controle. Sendo assim, propôs uma fórmula matemática, na qual a porcentagem de reação hiposmótica é expressa por: HO(%) = (% de alterações na região da cauda após o HOST) (% de alterações na região da cauda antes do HOST), sendo que possíveis resultados negativos são considerados iguais a zero. Com esta fórmula, MELO (1999) acredita ter diminuído o erro de leitura e interpretação dos resultados, simplificando ainda mais o HOST, aproximando-se do valor real de formas reativas, principalmente em ejaculados com elevada porcentagem de alterações na região da cauda antes do HOST. Embora a cabeça do espermatozóide também seja recoberta pela membrana plasmática, o volume desta não aumenta tanto em condições hiposmótica como o volume da cauda, que no espermatozóide bovino, pode aumentar de 3,5 a 4 vezes (DREVIUS e ERIKSSON, 1966). Este fato, segundo MELO (1999), indica a não necessidade da inclusão das anormalidades de acrossoma e cabeça na fórmula de cálculo de formas reativas ao HOST. A microscopia por contraste de fase é a mais indicada para a avaliação da reação espermática ao HOST. O aumento tem variado de 200 a vezes (JEYENDRAN et al., 1984; DELL AQUA JÚNIOR et al., 2002; FONSECA et al., 2001; FERREIRA et al., 2001), entretanto MELO (1999) aconselha o uso de aumentos maiores, quando possível, como 1.250

24 11 vezes, pois com isso, minimizam-se possíveis erros na leitura, principalmente nas alterações da morfologia da peça terminal, mais difíceis de serem avaliadas em pequenos aumentos. O número de células espermáticas a serem contadas visando determinar percentualmente a reação hiposmótica da amostra de sêmen, varia conforme os pesquisadores. JEYENDRAN et al. (1984), não observou diferença significativa entre as avaliações que contaram 100 ou 200 espermatozóides por amostra. NIE e WENZEL (2001), também não observaram essa diferença entre as contagens de 100 e 200 e entre 100 e 500 espermatozóides, com porcentagens de 87,0±1,4 x 87,1±1,4 (P=0,61) e 84,3±1,0 x 83,8±0,9 (P=0,24), respectivamente. Com base no protocolo proposto por JEYENDRAN et al. (1984) para o sêmen humano, vários pesquisadores vêm utilizando o HOST no sêmen de diversas espécies domésticas, tais como nos bovinos (CORREA e ZAVOS, 1994), suínos (VAZQUEZ et al., 1997), eqüinos (MELO e HENRY, 1999), cães (INAMASSU et al., 1999) e ovinos (OBERST et al., 2003). A capacidade de reação do espermatozóide caprino frente a condições hiposmóticas foi demonstrada por FERREIRA et al. (2001) e por FONSECA et al. (2001). Sendo que, esses pesquisadores utilizam diferentes soluções hiposmóticas, em diversas osmolaridades na aplicação do HOST Soluções hiposmóticas e osmolaridade O teste hiposmótico foi primeiramente aplicado utilizando-se soluções de açúcares (frutose, melitose e sacarose) e eletrólitos (citrato de sódio e cloreto de sódio), onde a solução composta por 50% de frutose e 50% de citrato de sódio, ambos a 150mOsmol/Kg H 2 O, mostrou-se superior às demais em espermatozóides humanos (JEYENDRAN et al., 1984). Ainda de acordo com JEYENDRAN et al. (1984), o citrato de sódio e o cloreto de sódio são eletrólitos que atuam na manutenção da integridade funcional dos espermatozóides, sendo o citrato de sódio empregado em estudos de padronização do HOST. A frutose e a sacarose são açúcares comumente utilizados em meios diluidores de sêmen, embora a membrana plasmática não permita o transporte da sacarose, devido ao seu peso molecular, o que pode gerar reações diferentes das obtidas com a frutose, açúcar que tem fluxo através da membrana

25 12 plasmática do espermatozóide. NEILD et al. (1999) realizaram estudos nos quais, além desses dois açúcares, foi utilizada também a lactose como componente da solução hiposmótica. PINTO e LOBO (1997) utilizaram como solução hiposmótica o meio proposto por Kenney et al. (1975), regulando sua osmolaridade para 150mOsmol/Kg H 2 O. Nesta solução foi incubado sêmen eqüino in natura e o resfriado, tendo estes demonstrado uma reação positiva ao HOST. A água destilada (AD) foi usada por DELL AQUA JÚNIOR et al. (2002) e MELO et al. (2003), como solução HO na incubação de sêmen eqüino congelado, sendo observado, pelos últimos, uma superioridade (P<0,05) desta solução em comparação à solução de sacarose a 100mOsmol/Kg H 2 O. A associação de frutose com citrato de sódio, na preparação de soluções hiposmóticas para o sêmen caprino, é mais freqüente que a utilização de soluções compostas exclusivamente por citrato de sódio (FONSECA et al., 2001; SANTOS et al., 2001; BITTENCOURT et al., 2005; FONSECA et al., 2005); possivelmente, o uso dessa associação para o sêmen caprino baseiese na conclusão de JEYENDRAN et al. (1984). Os meios/diluentes utilizados na conservação da célula espermática, possuem uma osmolaridade em torno de 300mOsmol/Kg H 2 O (MIYAMOTO e CHANG, 1973; citado por JEYENDRAN et al., 1984); essa mesma osmolaridade, foi classificada por RODRÍGUEZ- GIL et al. (1994), VAZQUEZ et al. (1997) e MELO (1999) como isosmótica em relação ao espermatozóide, canino, suíno e eqüino, respectivamente. LAGARES et al. (1988) mensuraram a osmolaridade do plasma seminal eqüino e obtiveram média de 284,8mOsmol/Kg H 2 O. Essa média pode ser estendida ao sêmen dos demais mamíferos domésticos, pois segundo GARNER e HAFEZ (2003), a composição química, inorgânica e bioquímica dos espermatozóides é basicamente a mesma, diferindo quantitativamente em relação aos constituintes do plasma seminal de cada espécie. Soluções com osmolaridade acima de 250mOsmol/ Kg H 2 O, tendem a promover menores percentuais de reação hiposmótica nos espermatozóide, pois aproximam-se da osmolaridade do plasma seminal. Esse comportamento foi observado por MELO e HENRY (1999), onde os espermatozóides submetidos ao HOST em soluções de 250 e 300mOsmol/Kg H 2 O,

26 13 apresentaram média de reação abaixo de 7% e 5%, respectivamente. Comportamento este, também observado, embora com médias um pouco mais altas, por NIE e WENZEL (2001) e por FONSECA et al. (2005), no sêmen eqüino e caprino, respectivamente. Assim sendo, espera-se um maior percentual de reação hiposmótica dos espermatozóides, quando incubados em soluções cuja osmolaridade varie de 0 a 200mOsmol/Kg H 2 O. Experimentos conduzidos por diversos pesquisadores, vem demonstrando que o intervalo de 100 a 150mOsmol/Kg H 2 O tem permitido, aos espermatozóide, um percentual maior de reatividade hiposmótica. CORREA e ZAVOS (1994) relataram que os espermatozóides bovinos apresentaram 48% de reação hiposmótica (P<0,05) quando submetidos à osmolaridade de 100mOsmol/Kg H 2 O. FONSECA et al. (2005) não observaram diferença significativa entre as osmolaridade de 100, 125 e 150mOsmol/Kg H 2 O, sendo que a segunda, demonstrou um leve aumento numérico na porcentagem de reação. OBERST et al. (2003), também não encontraram diferença significativa entre 100 e 150mOsmol/Kg H 2 O trabalhando com o sêmen ovino. LIN et al. (1998) relacionaram a fertilidade e sub-fertilidade de homens com a integridade funcional da membrana plasmática do espermatozóide, através do HOST, obtendo correlação positiva (P<0,05), tanto do sêmen in natura como congelado, usando como meio hiposmótico a água destilada (0mOsmol/Kg). A água destilada tem demonstrado uma variação na resposta hiposmótica dos espermatozóides, quando nela incubados. MELO et al. (2003) observaram a semelhança entre os percentuais de reação hiposmótica do espermatozóide eqüino, quando incubados em AD ou em solução de cloreto de sódio a 100mOsmol/Kg H 2 O, e a superioridade da AD quando comparada à solução de sacarose na mesma osmolaridade. Comparando soluções de citrato de sódio e de frutose, ambas a 100mOsmol/Kg H 2 O, com a AD, et al. (2005b) não obsevaram diferenças entre a AD e as duas soluções, quando fixadas com formol-salina tamponada, entretanto, no ensaio que não ocorreu essa fixação a AD mostrou-se superior (P<0,05), demonstrando que o HOST utilizando AD, sofre uma possível interferência quando fixado. Contudo, a confirmação desta interferência necessita de mais estudos.

27 Tempo de incubação e fixação com formol-salina tamponada Embora CORTÉS et al. (1993) indiquem que a maior proporção de reação hiposmótica ocorre nos primeiros vinte minutos do HOST, ainda não está definido qual o tempo de incubação mínimo que o espermatozóide necessita para reagir adequadamente ao HOST. Em seu experimento, CORREA e ZAVOS (1994) incubaram o sêmen bovino por 60 minutos em banho-maria a 37 C; PINTO e LOBO (1997) reduziram este tempo para 10 minutos; LAGARES et al. (1998) utilizaram cinco minutos à temperatura ambiente; MELO e HENRY (1999) e BITTENCOURT et al. (2005) retornaram para os 30 minutos a 37 C, FERREIRA et al. (2001) compararam os percentuais de reação hiposmóticas encontrados, com o sêmen caprino, após os cinco e 25 minutos de incubação e DELL AQUA JÚNIOR et al. (2002) fizeram a leitura imediatamente após o sêmen eqüino ser misturado à solução hiposmótica. Ressaltando que diversas soluções foram utilizadas nessas experimentações. NIE e WENZEL (2001) utilizando sêmen eqüino in natura, não observaram diferença significativa entre tempos de incubação variando de 15 a 180 minutos, embora houvesse uma tendência numérica a favor dos 60 minutos. Corroborando com esse resultado, trabalhos semelhantes, com sêmen congelado eqüino, indicaram que 15 minutos de incubação a 37 C, são suficientes, pois ao final deste tempo, a maior parte dos espermatozóides com membrana funcionalmente íntegra já reagiu à condição hiposmótica (MELO et al., 2003; ALVES et al., 2005b). Através da revisão de literatura, pôde-se observar que alguns autores, após o término do tempo de incubação, não realizam a fixação da amostra, seja com formol-salina tamponada (FST) ou com glutaraldeído, para a posterior leitura da mistura sêmen/solução hiposmótica. Entretanto, essa fixação, com FST, foi utilizada por MELO e HENRY (1999) para o sêmen eqüino resfriado e por COTTORELLO (2002) e SNOECK (2003) para o sêmen eqüino congelado, não sendo relatado por esses autores qualquer interferência desse protocolo sobre os resultados de espermatozóides reativos ao teste. Embora o mecanismo de ação do formaldeido frente à unidade celular não esteja totalmente esclarecido, MASON e O LEARY (1991) observaram que, o formaldeido, presente na solução de FST, atua junto aos microtubúlos ligando-se a α e β tubulina, despolimerizando a estrutura tubular, e desnaturando as proteínas presentes na membrana plasmática. Essa

28 15 desnaturação protéica, segundo análises de ZHU et al. (2002), promove alterações na permeabilidade da membrana dificultando ou impedindo o transporte de água para dentro da célula. Talvez, seja essa alteração na permeabilidade da membrana plasmática do espermatozóide, que justifique a não ocorrência de diferença (P>0,05) nas médias entre as soluções, observadas por ALVES et al. (2005b), dos espermatozóides reativos ao teste HO com ou sem fixação em FST pós-incubação. Pois, com base nesta hipótese, a reação hiposmótica seria cessada quando fixada em formol salina. Assim, após avaliar sua metodologia e sua interação com a membrana plasmática celular, o HOST pode ser considerado mais do que uma prova do estado metabólico do espermatozóide, representando também uma prova da habilidade do espermatozóide em se capacitar durante seu percurso dentro do trato reprodutivo feminino (JEYENDRAN et al., 1992).

29 16 3. EXPERIMENTO I O teste hiposmótico na avaliação do sêmen in natura de caprinos da raça Böer: Efeito da solução, osmolaridade e tempo de incubação (The hypoosmotic swelling test in fresh goat semen of the Boer breed: Effect of solution, osmolarity and incubation time) ALVES, S.G.G.; CHALHOUB, M. Escola de Medicina Veterinária UFBA, Salvador-BA, , Brasil. Resumo O objetivo deste experimento foi avaliar a influência da solução, da osmolaridade e do tempo de incubação sobre o percentual de reação hiposmótica do espermatozóide caprino, especificamente de machos da raça Böer, e sua repetibilidade intra-ensaio. Para tal utilizaram-se 24 ejaculados, divididos em três etapas, provenientes de cinco reprodutores. Para o teste hiposmótico (HOST) foram utilizadas uma solução de água destilada (0mOsmol/Kg), duas soluções de açúcar (frutose e sacarose), duas de eletrólitos (citrato de sódio e cloreto de sódio) e uma associação de açúcar-eletrólito (frutose-citrato de sódio), estas cinco últimas, em quatro diferentes osmolaridades: 50, 100, 150 e 200mOsmol/Kg H 2 O. A incubação do sêmen in natura nas soluções com 50mOsmol/Kg H 2 O, permitiu maiores médias (P>0,05) de resposta positiva ao HOST. Nessas soluções, o percentual de espermatozóides reativos ao HOST aos 15 minutos de incubação, variou entre 74,90 a 82,30%, independente do soluto utilizado. Observaram-se melhores resultados ao HOST com o uso de eletrólitos, sendo sugerida a solução de citrato de sódio a 50mOsmol/Kg H 2 O, incubada por 15 minutos, com uma repetibilidade de leitura média de 4,26%±1,68, para a realização do HOST no sêmen de caprinos da raça Böer. Palavras-chave: Teste hiposmótico; sêmen; caprino; Böer. Abstract Twenty-four ejaculated were used, of five male goats, with the objective of evaluate the influence of solution, osmolarity and incubation time on the percentile of hypoosmotic reaction of goat spermatozoid, specifically of the Boer breed, and to verify the intra-assay variability of the hypoosmotic swelling test (HOST). Were used solutions of distilled water, two solutions of sugar (fructose and sucrose), two electrolytes (sodium citrate and sodium chloride) and an association of sugar-electrolyte (sodium citrate-fructose). The omolarity of the solutions varied from 50 to 200, at 50mOsmol/Kg H 2 O increments. The distilled water (0mOsmol/Kg) was used also as solution. The fresh semen incubation in solutions of 100mOsmol/Kg H 2 O, independently of the solute, increased (P>0.05) sperm HOST response, varying from to 82.30%, incubated by 15 minutes. It was observed of better results using electrolytes. The sodium citrate solution 100mOsmol/Kg H 2 O, incubated by 15 minutes,

30 17 with low intra-assay variability of 4.26%±1.68, was the suggested solution for Boer goat HOST. Key-words: Hypoosmotic swelling test; semen; goat; Boer. 3.1 Introdução Dentre os aspectos morfológicos estruturais dos espermatozóides, a integridade da membrana plasmática é crucial para o funcionamento da célula espermática, por isso, a grande importância do estudo da funcionalidade da mesma, que, segundo LAGARES et al. (1998), se somado aos parâmetros tradicionais de avaliação da qualidade do sêmen, podem ajudar a aumentar os índices de fertilidade ou no diagnóstico de possíveis causas de infertilidade. O teste hiposmótico ou hypoosmotic swelling test (HOST), desenvolvido por JEYENDREN et al. (1984), com a finalidade avaliar a integridade funcional da membrana plasmática do espermatozóide, vem sendo adaptado por diversos pesquisadores (CORREA e ZAVOS, 1994; LIN et al., 1998; MELO e HENRY, 1999; FERREIRA et al., 2001; DELL AQUA JÚNIOR. et al., 2002; ALVES et al., 2005b) no que se refere ao uso de diferentes soluções hiposmóticas, na osmolaridade dessas soluções, no tempo de incubação no qual o sêmen é submetido, dentre outras variações, visando determinar o melhor protocolo de HOST para as diversas espécies de animais domésticos. Segundo JEYENDRAN et al. (1984), os açúcares e os eletrólitos são conhecidos por manterem a integridade funcional os espermatozóides. Por isso, esses solutos são freqüentemente utilizados, sozinhos ou combinados, em ensaios de padronização do HOST. Os experimentos de HOST com o sêmen caprino disponíveis na literatura, são na maioria, realizados com soluções de citrato de sódio (FERREIRA et al., 2001) ou associação de frutose com citrato de sódio (FONSECA et al., 2001; BITTENCOURT, et al., 2005; FONSECA et al., 2005), baseados em ensaios que observaram melhores percentuais de reação hiposmótica, em outras espécies, utilizando essas soluções. As soluções hiposmóticas com osmolaridades variando de 100 a 150mOsmol/Kg H 2 O são as que permitem, nas diversas espécies de mamíferos, um maior percentual de espermatozóides reagindo positivamente ao HOST (JEYENDRAN et al., 1984; MELO e HENRY, 1999; NIE e WENZEL, 2001; FONSECA et al., 2005). Segundo Rota et al. (2000), a osmolaridade ideal é aquela que permite o maior percentual de espermatozóides reativos ao HOST sem, no entanto,

31 18 provocar a lise celular; esta osmolaridade, bem como o tempo no qual se atinge o percentual máximo de reatividade espermática, varia com as espécies a serem estudadas, por isso a necessidade de estudos para determinação destes valores. Assim, o objetivo do presente experimento foi observar os efeitos de alguns fatores sobre o percentual de reação espermática, frente ao HOST, do sêmen caprino in natura, através da: (1) osmolaridade que permite maior percentual de reação hiposmótica, (2) solução e tempo de incubação que permitem maior percentual de reação hiposmótica e (3) determinação da repetibilidade intra-ensaio do HOST. 3.2 Material e Métodos Os locais e animais experimentais Foram selecionados cinco machos adultos da raça Böer, em idade reprodutiva ( X = 3,6 anos), submetidos a exames andrológicos prévios e considerados aptos à reprodução, baseando-se nos valores sugeridos pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA; HENRY e NEVES, 1998). Os animais, de propriedade da Fazenda Santa Fé, localizada no município de Iaçu-Ba ( S e W), foram manejados de forma intensiva, com fornecimento diário de concentrado balanceado, forragem verde, sal mineral e água ad libitum. O controle sanitário era realizado periodicamente, seguindo um esquema pré-estabelecido pela propriedade. Todos os procedimentos adotados neste estudo estiveram de acordo com os princípios éticos na experimentação animal recomendados pelo COBEA (2005) Colheita e avaliação seminal Foi colhido um total de 24 ejaculados de cinco reprodutores, por vagina artificial, utilizando como manequins fêmeas em estro induzido.

32 19 Após a colheita, o volume do ejaculado foi verificado e registrado em mililitros (ml). Cada ejaculado foi avaliado quanto à motilidade total e progressiva, vigor espermático e turbilhão. A avaliação subjetiva da motilidade e do vigor espermático foi realizada, examinando-se alíquotas do ejaculado diluídas em solução comercial de ringer com lactato, em microscopia óptica (40x) e os resultados expressos em percentual para a motilidade e numa escala de zero a cinco para o vigor e turbilhão, este último avaliado sem diluição sobre um aumento de 10 vezes. Todas as avaliações seguiram as recomendações do CBRA (HENRY e NEVES, 1998). Após essas avaliações, outra alíquota de sêmen foi retirada do ejaculado e adicionada a uma solução de formol-salina tamponada (HANCOCK, 1957), numa diluição de 1:400, para posterior cálculo da concentração espermática, pela contagem dos espermatozóides em câmara de Neubauer (HENRY e NEVES, 1998). A avaliação da morfologia espermática foi realizada por esfregaços preparados com o sêmen in natura, corados com panótico rápido (Instant Prov ; NewProv; Pinhais-PR). Cada esfregaço foi avaliado, posteriormente, sob microscopia ótica de imersão (1.000x), estimandose os percentuais de espermatozóides morfologicamente normais e com anormalidades conforme HENRY e NEVES (1998) O teste hiposmótico O teste hiposmótico foi empregado para avaliar a integridade funcional da membrana plasmática dos espermatozóides caprino. Com base na metodologia aplicada por NIE e WENZEL (2001), este experimento foi dividido em três etapas. Cada etapa foi subdividida em dois tempos. O primeiro (avaliação andrológica, colheita de sêmen e teste hiposmótico) foi realizado na própria Fazenda Santa Fé; o segundo tempo (avaliação morfológica e reação hiposmótica) foi realizado no Laboratório de Embriologia do Hospital de Medicina Veterinária, da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia (EMEV-UFBA). O sêmen utilizado em todas as etapas foi colhido e processado como descrito anteriormente.

33 20 A leitura do percentual de reação dos espermatozóides ao HOST foi feita, através de microscopia de contraste de fase com um aumento de vezes, colocando-se uma gota da fração sêmen/solução entre lâmina e lamínula. Visando diminuir o erro de leitura e interpretação do percentual de reação ao HOST, foi utilizada a fórmula proposta por MELO e HENRY (1999), na qual, contando-se 100 células, se subtrai as anormalidades espermáticas das alterações resultantes da incubação espermática em meio hiposmótico. Etapa I: Comparação das osmolaridades Com o intuito de determinar a osmolaridade que proporciona o maior percentual de espermatozóides reativos ao HOST, foram colhidos, por vagina artificial, dois ejaculados provenientes de cinco reprodutores, totalizando dez ejaculados, utilizando como manequins fêmeas em estro induzido. Foram avaliadas quatro osmolaridades (50, 100, 150 e 200mOsmol/Kg H 2 O) em cinco diferentes soluções, sendo duas de açúcares (frutose e sacarose), duas de eletrólitos (citrato de sódio e cloreto de sódio) e uma associação de açúcar-eletrólito (frutose-citrato de sódio), totalizando 20 soluções. A osmolaridade dessas soluções foi medida, com base no seu ponto de congelação, em aparelho de precisão (μ OSMETTE TM, Model 5004 Automatic Osmometer Natick MA USA). As soluções, imediatamente após o preparo, foram armazenadas em tubos para centrífuga estéreis e estocadas em freezer a -18 C. Trinta minutos antes da colheita as soluções foram descongeladas e acondicionadas em tubos de micro-centrífuga, inseridos numa placa flutuante, mantidos em banho-maria a 37 C. Após a colheita e avaliação dos parâmetros espermáticos, alíquotas de sêmen foram submetidas ao HOST, sendo acrescidas, na proporção de 1:10 (10μL de sêmen em 100μL de solução), às soluções contidas nos tubos de micro-centrífuga, e submetidas à incubação em banho-maria a 37 C por 30 minutos. Após o término da incubação, cada amostra, foi fixada com 50 μl de formol-salina tamponada a 37 C e armazenada em geladeira (5 C) até o momento da leitura do percentual