RESSALVA. Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 02/11/2017.

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1 RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 02/11/2017.

2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA CAMPUS DE ARAÇATUBA DETECÇÃO MOLECULAR DE Ehrlichia canis EM CÃES E EM ÓRGÃOS DE SEUS RESPECTIVOS CARRAPATOS Bruno César Miranda Oliveira Médico Veterinário Araçatuba - SP 2016

3 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA CAMPUS DE ARAÇATUBA DETECÇÃO MOLECULAR DE Ehrlichia canis EM CÃES E EM ÓRGÃOS DE SEUS RESPECTIVOS CARRAPATOS Bruno César Miranda Oliveira Orientadora: Profª. Adj. Katia Denise Saraiva Bresciani Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária Unesp, Campus de Araçatuba, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal (Medicina Veterinária Preventiva e Produção Animal). Araçatuba - SP 2016

4 Catalogação na Publicação(CIP) Serviço de Biblioteca e Documentação FMVA/UNESP Oliveira, Bruno César Miranda Ol41d Detecção molecular de Ehrlichia canis em cães e em órgãos de seus respectivos carrapatos / Bruno César Miranda Oliveira. Araçatuba: [s.n], f. il.; CD-ROM Dissertação (Mestrado) Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária, 2016 Orientadora: Profa. Adj. Katia Denise Saraiva Bresciani 1.Parasitologia. 2. Erliquiose monocítica canina - diagnóstico. 3. Rhipicephalus sanguineus. I. T. CDD:

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7 BRUNO CÉSAR MIRANDA OLIVEIRA Formiga - MG, 07 de março de Graduação em Medicina Veterinária pelo Centro Universitário de Formiga, UNIFOR-MG, no ano de Ingressou no curso de Pósgraduação em Ciência Animal, área de concentração em Medicina Veterinária Preventiva e Produção Animal, na Faculdade de Medicina Veterinária, Unesp, Campus de Araçatuba SP, em março de 2014, sob orientação da Professora Adjunto Katia Denise Saraiva Bresciani. Bolsista FAPESP desde maio de 2015 (Processo: 2014/ ).

8 Diz-se que o homem vale pelo que se sabe, mas vale mais aquele que sabe como dizer aquilo que se sabe. Edmundo de Amicis.

9 Aos meus pais, Maria da Luz e Mauricio, e à minha querida irmã Marina, que muito me incentivaram na busca deste título.

10 AGRADECIMENTOS À Deus, por estar sempre presente em minha vida, me fortalecendo para conquistar meus objetivos e orientando o meu caminho. Obrigado, meu Deus! Aos meus pais queridos e à minha irmã que tanto me orientaram e incentivaram a seguir a carreira acadêmica, sempre dispostos a ouvir e aconselhar em todos os momentos difíceis. Às tias Neli e Vaninha, muito presentes, demonstrando preocupação e estando sempre dispostas a me ajudar sempre que precisei. Aos meus avôs, Mario Miranda (in memorian) e Almerindo Faria, pela torcida para que tudo finalizasse da melhor maneira possível. À Profª. Dr. Katia Bresciani, pela orientação, grandes ensinamentos, amizade, incentivo, apoio prestado sempre que solicitado, voto de confiança e acima de tudo, por me ensinar que a humildade, gentileza e respeito ao próximo são peças essenciais para o sucesso profissional. Ao Prof. Dr. Marcos Rogério André, pela orientação pontual, apoio, ensinamentos, incentivo, paciência, e pela confiança em mim depositada. Aos meus amigos que me acompanharam durante este trajeto, apoiando, ouvindo, chorando e rindo comigo. A todos os meus colaboradores, seja pela ajuda intelectual, como também pelo auxílio na colheita e processamento dos materiais. À Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, campus de Araçatuba, pelo acolhimento e suporte. 7). À FAPESP, pela confiança e bolsa concedida (Processo:2014/ A todos os cães envolvidos no estudo, por servirem para o aprimoramento e evolução da ciência.

11 E por fim, a todos aqueles que, direta ou indiretamente, participaram e auxiliaram-me no desenvolvimento desse trabalho.

12 SUMÁRIO CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS OBJETIVO REFERÊNCIAS CAPÍTULO 2 - ARTIGO CIENTÍFICO Introdução Material e Métodos Resultados Discussão Conclusão REFERÊNCIAS... 40

13 DETECÇÃO MOLECULAR DE Ehrlichia canis EM CÃES E EM ÓRGÃOS DE SEUS RESPECTIVOS CARRAPATOS RESUMO - A erliquiose canina apresenta elevada ocorrência na rotina da clínica médica de pequenos animais. Esta bactéria multiplica-se nas células epiteliais do intestino, nos hemócitos e nas células das glândulas salivares do carrapato Riphicephalus sanguineus, onde ocorre a transmissão transestadial e provavelmente não ocorre transmissão transovariana. O objetivo do presente estudo foi detectar molecularmente Ehrlichia canis em amostras de linfonodos e medulas ósseas de cães e nos intestinos, ovários e glândulas salivares de seus respectivos carrapatos R. sanguineus. Assim, 720 artrópodes fêmeas (dez de cada animal) foram removidos dos 72 cães examinados. Em seguida, foram efetuadas punções aspirativas de linfonodos e medulas ósseas. Após a dissecação dos carrapatos, seus órgãos (intestinos, ovários e glândulas salivares), bem como as amostras puncionadas de linfonodos e medulas ósseas dos cães foram testadas por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (nested-pcr) para amplificação de um fragmento do gene 16S do ácido ribonucleico ribossomal (rrna) de E. canis e testados também por meio da PCR em Tempo Real Quantitativa (qpcr) para E. canis, baseada em um fragmento do gene dsb. A detecção por meio da nested-pcr foi de 80,5% nos linfonodos e 44,4% nas medulas ósseas, havendo diferença significativa (p<0,05). Já em relação às nested- PCRs dos órgãos dos carrapatos, observamos positividade de 22% nos intestinos, 11% nos ovários e 7% nas glândulas salivares. Na qpcr a detecção foi de 70,8% e 44,4% nos linfonodos e medulas ósseas, respectivamente (p<0,05) e de 31,9% nos intestinos, 10,0% nos ovários e 15, 2% nas glândulas salivares dos carrapatos estudados. As cargas parasitárias médias nos linfonodos foram de 1473,79 Cópias de um fragmento do gene dsb de E. canis/µl, nas medulas ósseas de 2080,09 Cópias/µL e nos intestinos, ovários e glândulas salivares as quantificações foram de 1211,53 Cópias/µL, 2602,01 Cópias/µL e de 49,23 Cópias/µL respectivamente. Nós concluímos que houve maior detecção molecular em linfonodos tanto na nested-pcr

14 quanto na qpcr e que a bactéria estava presente e a níveis quantificáveis pela primeira vez em ovários de R. sanguineus sensu lato. Palavras-chave: Erliquiose monocítica canina diagnóstico, parasitologia, Rhipicephalus sanguineus

15 MOLECULAR DETECTION OF Ehrlichia canis IN DOGS AND ORGANS OF THEIR RESPECTIVE TICKS ABSTRACT - The canine erlichiosis presents a high level of occurrence in the routine of the medical clinic of small animals. This bacteria multiplies in the epithelial cells of the intestine, in the hemocytes and in the salivary glands of the tick Riphicephalus sanguineus, where there is a transestadial transmission and probably does not occur a transovarial transmission. The objective of our study was to molecularly detect Ehrlichia canis in samples of lymph nodes and bone marrow of dogs and in the intestines, ovaries and salivary glands of their respective ticks R. sanguineus. Therefore, 720 female arthropods (ten of each animal) were removed from the 72 evaluated dogs. Next, aspirative punches were made of lymph nodes e bone marrow. After the dissection of the ticks, their organs (intestines, ovaries and salivary glands), like the punches samples of lymph nodes and bone marrow of the dogs were tested by Polymerase Chain Reaction (nested-pcr) for amplification of the gene 16S rrna of E. canis and also tested by the Quantitative Real Time PCR (qpcr) to E. canis, based on a fragment of the gene dsb. The detection of the refer pathogen by the nested-pcr was 80,5% in lymph nodes and 44,4% in bone marrows, showing a significant difference (p<0,05). ). In relation to the nested-pcrs of the tick s organs, we observed positivity of 22% on the intestines, 11% on the ovaries and 7% on the salivary glands. In the qpcr the detection was of 70,8% and 44,4% on the lymph nodes e bone marrows, respectively (p<0,05) and of 31,9% on the intestines, 10,0% on the ovaries and 15, 2% on the salivary glands of the studied ticks. The absolute quantification on the lymph nodes and bone marrow of the dogs was of 1473,79 Copies of a fragment of the gene dsb of E. canis/µl, in bone marrows of 2080,09 copies/µl and in the intestines, ovaries and salivary glands the quantification were of 1211,53 copies/µl, 2602,01 copies/µl and of 49,23 copies/µl respectively. We concluded that there was a major molecular detection on lymph nodes on the nested-pcr as much as the qpcr and that the bacteria was present and in quantifiable levels for the first time in ovaries of R. sanguineus sensu lato.

16 Key-words: Canine monocytic ehrlichiosis diagnosis, parasitology, Rhipicephalus sanguineus

17 13 CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS O gênero Ehrlichia, compreende cinco espécies: Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Ehrlichia muris e Ehrlichia ruminantium. Porém, destas espécies a primeira delas é a mais comum, considerada agente etiológico da Erliquiose Monocítica Canina (DUMLER et al., 2001). A E. canis é uma bactéria Gram negativa, parasito intracelular obrigatório que infecta leucócitos mononucleares. Por ser transmitida pela linhagem tropical de Rhipicephalus sanguineus, essa enfermidade apresenta maior prevalência em regiões tropicais e subtropicais devido à ampla distribuição geográfica dos vetores, sendo considerada uma das doenças infecciosas caninas mais importantes (ANDEREG; PASSOS, 1999; MORAES-FILHO et al., 2015; VIEIRA et al., 2011). Muitos casos de erliquiose em humanos foram relacionados à infecção por E. chaffeensis. Porém, já foi sugerido na Venezuela que cães podem ser considerados reservatórios da infecção humana por E. canis e que R. sanguineus podem atuar como vetores (UNVER et al., 2001). Neste mesmo país, foram descritos pelo menos seis casos clínicos de erliquiose humana causada por E. canis (PEREZ et al., 2005). Embora existam relatos de parasitismo por R. sanguineus em diversas espécies de animais, incluindo animais silvestres e em diferentes regiões geográficas, o cão doméstico é o seu principal hospedeiro natural em todos as suas formas parasitárias. Esses carrapatos também possuem um papel fundamental para a manutenção da população da espécie no ambiente, principalmente pelo fato do hospedeiro não desenvolver resposta imune contra os mesmos, refletindo numa forte interação parasito-hospedeiro (LABRUNA, 2004; SZABÓ et al., 1995). Esta bactéria foi descrita pela primeira vez na Argélia em 1935, por DONATIEN e LESTOQUARD, nas células mononucleares de cães infestados por carrapatos. Naquele tempo, foi atribuída a denominação de Rickettsia canis (HUXSOLL, 1976). Em 1945, Moshkovski renomeou o organismo como E. canis em homenagem a Paul Ehrlich (MCDADE, 1990).

18 14 Posteriormente, casos de erliquiose canina foram descritos em Uganda e na Nigeria (RIKIHISA, 1991). Já nas Américas, o relato pioneiro foi descrito somente em 1957, na região das Antilhas Holandesas e nesse caso a E. canis estava associada com a Babesia canis (EWING et al., 1966). Em 1969, foi observada em Singapura e na Tunísia a ocorrência de doença hemorragica em cães militares nativos (HUXSOLL, 1969). O papel patogênico da E. canis foi melhor elucidado na década de 60, quando ficou estabelecido que ela era o agente etiologico da Pancitopenia Tropical Canina. Este achado causou uma grande dúvida pelo fato desta doença ter sido descrita como causadora de sintomatologia branda, exceto em filhotes, em que ocorria de forma grave e letal. Essa nova descoberta deu inicio a uma série de estudos sobre esta infecção que acometia tantos cães na época (HUXSOLL, 1969). No Brasil, a Erliquiose foi observada pela primeira vez em Belo Horizonte, Minas Gerais (COSTA, 1973). No Rio de Janeiro, foi diagnosticada em cães da Polícia Militar (CARRILLO et al., 1976). Em 1985, foi encontrada em Santa Maria, Rio Grande do Sul, e em 1988 foi verificado um caso clínico em Curitiba, Paraná (KAVINSKI et al., 1988). Por sua vez, E. ewingii foi detectada pela primeira vez em cães no Município de Viçosa, localizado no Estado de Minas Gerais (OLIVEIRA et al., 2009). A E. canis infecta leucócitos mononucleares, formando inclusões citoplasmáticas, chamadas mórulas. Estas são visualizadas apresentando um aspecto compacto, são formadas por agrupados de pequenas estruturas de forma cocóide a elipsoidal (RISTIC; HUXSOLL, 1984). O desenvolvimento das mórulas inicia-se em um único corpúsculo elementar dentro do monócito, que após sua multiplicação formam inclusões citoplasmáticas imaturas, denominadas corpúsculos iniciais. Após sete a 12 dias de incubação estes se desenvolvem dando origem às mórulas. Neste estágio, muitos monócitos estão três a quatro vezes maiores que o seu tamanho original (NYINDO et al., 1971). O ciclo da Ehrlichia spp. nas células hospedeiras inicia-se com a adesão de pequenos organismos densamente corados (CD), os quais acabam por penetrar na célula. Dentro de um vacúolo na célula hospedeira, os CD rapidamente se transformam em células reticuladas (CR), as quais se

19 15 multiplicam por divisão binária por aproximadamente 48 horas e, então, após 72 horas de infecção, maturam e se transformam em CD novamente. Estas, por sua vez, são liberadas da célula hospedeira e recomeçam um novo ciclo de infecção (ZHANG et al., 2006). Ehrlichia spp. multiplica-se nas células epiteliais do intestino, nos hemócitos e nas células das glândulas salivares do carrapato, onde ocorre a transmissão transestadial, tornando o cão o seu principal reservatório da doença. Entretanto, provavelmente não ocorre transmissão transovariana (NAKAGHI et al., 2008). Estudos anteriores mostraram que teleóginas infectadas não transmitiram a E. canis para sua progênie, assim como não foi possivel detectar o microorganismo no ovário de carrapatos infectados experimentalmente (HOSKINS, 1991; WOODY, 1982; WOODY, 1991). O R. sanguineus está presente em todo o território nacional, especialmente em áreas urbanas onde há uma grande concentração de cães errantes e domésticos. Porém, a ocorrência do carrapato depende das características epidemiológicas particulares de cada região (LABRUNA, 2004; LABRUNA; PEREIRA, 2001). A taxa de infecção por E. canis em R. sanguineus nas regiões norte e sudeste do Brasil apresentou variação de 2,5% a 6% (AGUIAR et al., 2007). A transmissão ao hospedeiro ocorre por meio da saliva do carrapato que se infecta ao ingerir leucócitos circulantes contendo o agente etiológico durante o repasto sanguíneo, fato que ocorre, geralmente, na segunda ou terceira semana após a infecção (DUMLER et al., 2001; MURPHY et al., 1998). A enfermidade está descrita em aproximadamente 20% dos cães atendidos em hospitais e clínicas veterinárias de Estados das regiões Nordeste, Sudeste, Sul e Centro Oeste (LABARTHE et al., 2003; MOREIRA et al., 2003), sendo hoje, considerada principalmente nas áreas urbanas, uma doença endêmica (NAKAGHI et al., 2008). Na Tabela 1, podem ser observados dados em relação à ocorrência da infecção canina por Ehrlichia spp. em municipios dos estados de São Paulo e Mato Grosso do Sul, locais onde o trabalho foi realizado.

20 16 Tabela 1: Ocorrência de Ehrlichia spp. em cães, notificada por diversos autores, em municípios dos estados de São Paulo e Mato Grosso do Sul Autor (Ano) Oliveira et al. (2000) Bulla et al. (2004) Diniz et al. (2007) Oriá et al. (2008) Nakaghi et al. (2008) Dagnone et al. (2009) Ueno et al. (2009) Municípios Técnica Número de cães examinados Número de cães reagentes Positividade (%) Jaboticabal/SP ELISA ,3 Botucatu/SP *PCR Botucatu/SP *PCR ,7 Jaboticabal/SP RIFI ,6 Jaboticabal/SP *PCR ,3 Jaboticabal/SP *PCR Botucatu/SP **PCR Santos et al. (2009) Ribeirão Preto/SP *PCR ,9 Faria et al. (2010) Labarthe et al. (2003) Sousa et al. (2013) Jaboticabal/SP *PCR ,5 Mato Grosso do Sul/MS Campo Grande/MS ELISA ,7 RIFI RIFI= Reação de Imunofluorescência Indireta; ELISA= Ensaio Imunoenzimático Indireto; *PCR= Reação em cadeia de polimerase baseada em um fragmento do gene 16S rrna; **PCR= Reação em cadeia de polimerase baseada em um fragmento do gene dsb O período de incubação dura de oito a 20 dias, podendo a doença assumir caráter multissistêmico de acordo com as suas fases: aguda, assintomática (subclínica) e crônica (HARRUS et al., 1997). As manifestações clínicas na fase aguda persistem por duas a quatro semanas. Nesse período, as bactérias se replicam nos leucócitos, disseminando-se por meio da circulação para órgãos como o baço, fígado, linfonodos e medula óssea (ANDEREG; PASSOS, 1999). Nesta etapa, podem ser observados sinais como febre, anorexia, depressão, linfadenopatia e trombocitopenia. Esses podem passar despercebidos, e no

21 17 final da quarta semana desaparecem, mas o parasito permanece no animal (NAKAGHI et al., 2008). A fase subclínica ocorre geralmente da sexta à nona semana e é caracterizada pela persistência da E. canis no animal (MENDONÇA et al., 2005). Porém, em alguns casos, os cães podem conviver com o parasito nesse estágio da doença por anos e os imunocompetentes podem eliminá-lo e se recuperar sem a realização de nenhum tratamento (ANDEREG; PASSOS, 1999). Nessa fase o animal aparenta estar saudável, pois a sintomatologia é mais branda, podendo ocorrer em alguns casos leve perda de peso. É nesse período que se observa alta concentração de anticorpos para E. canis no sangue dos cães infectados (MENDONÇA et al., 2005). E no fim da fase subclínica, instala-se a fase crônica, quando o sistema imune do animal não foi capaz de eliminar a infecção por completo (ANDEREG; PASSOS, 1999). Esse período tem características de uma doença auto-imune, com instalação de hipoplasia de medula óssea, ocasionando anemia aplásica (MENDONÇA et al., 2005). O comprometimento imunológico aumenta a susceptibilidade às infecções secundárias (COUTO, 1998). Lesões oftalmológicas como hemorragias conjuntivais, opacificação corneana, uveíte e hipotonia entre outras moléstias oculares são observadas em até 50% dos casos, nas fases aguda e crônica da doença (MENDONÇA et al., 2005). O diagnóstico da erliquiose canina é feito baseado na associação dos achados clínicos, provas laboratoriais, sorológicas e moleculares. Desta forma, quanto mais precoce for o diagnóstico, haverá mais condições de se realizar um tratamento adequado da doença (MUNHOZ et al., 2012). Principalmente na fase aguda, esta infecção pode ser detectada por meio de esfregaços de amostras de sangue periférico coradas pelo método de Giemsa ou Wright, onde são evidenciadas inclusões citoplasmáticas denominadas mórulas. No entanto, devido à baixa sensibilidade e especificidade desta técnica, este exame deve ser complementado com o auxílio de métodos sorológicos e moleculares, como o Ensaio

22 18 Imunoenzimático (ELISA), a Imunofluorescência Indireta (IFI) e a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (RAMOS et al., 2010). Na rotina clínica, os médicos veterinários levam em consideração o valor da contagem de plaquetas, pois um dos principais sinais da erliquiose é a trombocitopenia, que ocorre geralmente entre o décimo e o vigésimo dia de infecção (CASTRO, 2004; MENDONÇA et al., 2005). Também, ocorre em algumas situações leucopenia (ANDEREG; PASSOS, 1999; COUTO, 1998). A anemia presente é do tipo normocítica normocrômica regenerativa (MENDONÇA et al., 2005). Por meio de testes bioquímicos é possível verificar uma hiperbilirrubinemia e aumento das enzimas alaninaminotransferase e fosfatase alcalina, o que é indicativo de comprometimento hepático (ANDEREG; PASSOS, 1999). Testes mais sensíveis, como a RIFI e o ELISA, dão maior eficiência no diagnóstico de animais portadores (AGUIAR et al., 2007; ANDEREG; PASSOS, 1999). A RIFI era o teste tradicional para diagnosticar tanto a erliquiose humana, quanto a canina (SAITO et al., 2008). No entanto, apesar de ser amplamente utilizada, há a ocorrência resultados falsos positivos, em consequência da reatividade cruzada com outros organismos dos Gêneros Ehrlichia, Anaplasma e Neorickettsia, que o teste pode apresentar (PADDOCK; CHILDS, 2003). A nested-pcr com a utilização de um fragmento do gene 16S rrna e a PCR em tempo real baseada em um fragmento do gene dsb para E. canis apresenta maior especificidade e sensibilidade quando comparada com os outros testes diagnósticos (ANDRÉ et al., 2010; ANDRÉ et al., 2015). O PCR é um método de diagnóstico extremamente eficaz, já que detecta o material genético da referida bactéria no sangue ou em órgãos do hospedeiro. Hoje esta técnica já é uma realidade para os médicos veterinários, principalmente nos casos de recidiva dos sinais clínicos e laboratoriais, quando então se torna importante confirmar a presença do parasito para descartar outras causas de anemia e trombocitopenia (SILVA, 2015). No tratamento, são utilizadas algumas drogas empregadas por hospitais e clínicas veterinárias no Brasil, tais como a tetraciclina, oxitetraciclina, doxiciclina e dipropionato de imidocarb. A medicação deve ser

23 19 administrada durante três, quatro ou até oito semanas, naqueles animais que se encontram na fase crônica da doença. Entre esses fármacos, a tetraciclina e seus derivados são mais amplamente empregados. A doxiciclina é o fármaco de eleição nos casos de pacientes que apresentam afecções renais (ANDEREG; PASSOS, 1999; MACHADO, 2004). A avaliação da resposta terapêutica é realizada por meio da melhora das condições do animal, tais como o retorno do apetite, melhora do comportamento e do quadro hematológico (ANDEREG; PASSOS, 1999). É necessário que se faça uma boa prevenção, para se evitar a doença, principalmente no que diz respeito ao controle dos carrapatos, uma vez que este é o vetor do agente etiológico. OBJETIVO O objetivo do nosso estudo foi detectar molecularmente E. canis em amostras de linfonodos e medulas ósseas de cães e nos intestinos, ovários e glândulas salivares de seus respectivos carrapatos por duas técnicas moleculares (nested-pcr e PCR em tempo real quantitativa), bem como realizar a quantificação da carga parasitária por meio da qpcr, em Araçatuba, São Paulo e Campo Grande, Mato Grosso do Sul.

24 20 REFERÊNCIAS AGUIAR, D. M.; CAVALCANTE, G. T.; PINTER, A.; GENNARI, S. M.; CAMARGO, L. M. A.; LABRUNA, M. B. Prevalence of Ehrlichia canis (Rickettsiales: Anaplasmataceae) in dogs and Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) ticks from Brazil. Journal of Medical Entomology, v. 44, p , ANDEREG, P. I.; PASSOS, L. M. F. Erliquiose canina: revisão. Clinica Veterinária, v. 4, n. 19, p , ANDRÉ, M. R.; ADANIA, C. H.; MACHADO, R. Z.; ALLEGRETTI, S. M.; FELIPPE, P. A.; SILVA, K. F.; NAKAGHI, A. C. Molecular and serologic detection of Ehrlichia spp. in endangered Brazilian wild captive felids. Journal Wildlife Diseases, v. 46, n. 3, p , ANDRÉ, M. R.; DUMLER, J. S.; HERRERA, H. M.; GONÇALVES, L. R.; SOUSA, K. C. M.; SCORPIO, D. G.; SANTIS, A. C. G. A.; DOMINGOS, I. H.; MACEDO, G. C.; MACHADO, R. Z. Assessment of a quantitative 5' nuclease real-time polymerase chain reaction using the nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase gamma subunit (nuog) for Bartonella species in domiciled and stray cats in Brazil. Journal of Feline Medicine and Surgery, p. 1-9, Disponível em: < Acesso em: 4 abr BULLA, C.; KIOMI, T. R.; PESSOA, A. R.; APARECIDATRINCA, L.; SOUZA L. R.; WIEDMEYER, C. E. The relationship between the degree of thrombocytopenia and infection with Ehrlichia canis in an endemic area. Veterinary Research, v. 35, n. 1, p., , 2004.

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