TUBERCULOSE BOVINA: DIAGNÓSTICO ANATOMO-HISTOPATOLÓGICO, BACTERIOLÓGICO E MOLECULAR EM ANIMAIS ABATIDOS NA REGIÃO METROPOLITANA DE SALVADOR, BAHIA

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1 Universidade Federal da Bahia Escola de Medicina Veterinária Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos TUBERCULOSE BOVINA: DIAGNÓSTICO ANATOMO-HISTOPATOLÓGICO, BACTERIOLÓGICO E MOLECULAR EM ANIMAIS ABATIDOS NA REGIÃO METROPOLITANA DE SALVADOR, BAHIA ANA CAROLINA FARIAS COSTA Salvador Bahia 2008

2 ii ANA CAROLINA FARIAS COSTA TUBERCULOSE BOVINA: DIAGNÓSTICO ANATOMO-HISTOPATOLÓGICO, BACTERIOLÓGICO E MOLECULAR EM ANIMAIS ABATIDOS NA REGIÃO METROPOLITANA DE SALVADOR, BAHIA Dissertação apresentada à Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos, na área de Saúde Animal. Orientadora: Profª. Dr a. Eugênia Márcia de Deus Oliveira Salvador 2008

3 iii TUBERCULOSE BOVINA: DIAGNÓSTICO ANATOMO-HISTOPATOLÓGICO, BACTERIOLÓGICO E MOLECULAR EM ANIMAIS ABATIDOS NA REGIÃO METROPOLITANA DE SALVADOR, BAHIA ANA CAROLINA FARIAS COSTA Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos. Salvador, 27 de março de 2008 Comissão Examinadora: Prof. Dr. Mauricio Costa Alves da Silva UFBA Prof. Dr. Eduardo Luiz Trindade Moreira UFBA Prof. Dr. José Soares Ferreira Neto FMVZ/USP

4 iv Dedico este trabalho a Prof a Dr a. Eugênia Márcia de Deus, por ter aceitado ser minha orientadora, e acreditado que seríamos capazes, apesar de todas as adversidades. Acredite! Nós conseguimos! Saudades!

5 v AGRADECIMENTOS ESPECIAIS A Professora Alessandra Estrela, amiga incansável que permaneceu ao meu lado nos momentos mais difíceis da execução deste trabalho. A Nairléia, que com o seu jeito comprometido, sincero e carinhoso foi peça chave para o andamento deste trabalho. Ao Professor Sérgio Arruda, pela ajuda e incentivo fundamentais em diversos momentos durante a execução deste trabalho. Ao Professor Cláudio Madruga, um presente enviado por Deus pra nos ajudar na finalização deste trabalho. Muito obrigada!

6 vi AGRADECIMENTOS A Deus por ter me concedido a vida e me lembrar todos os dias do meu propósito na Terra. Aos meus pais Lívia e Xavier pelo apoio, amor incondicional e confiança que sempre depositaram em mim. A Marcos Simões por todos os momentos em que pude contar com o seu apoio, compreensão, incentivo e amor sincero. A minhas sobrinhas Marcele, Ana Júlia e Ana Clara, simplesmente por existirem e fazerem a diferença na minha vida. Aos meus irmãos Laurene, Antônio José e Eliane que compartilham comigo uma família cheia de adversidades, mas de muito amor e solidariedade. Ao Prof. Eduardo, que iniciou comigo este trabalho e continua a me apoiar e orientar sempre que preciso. A amiga irmã Ana Flávia, pelo apoio, colaboração e presteza com que trata a todos ao seu redor. A Alessandra Melo que apesar de tão longe está tão perto com o seu amor e amizade. A Maria Tereza que dividiu comigo os momentos finais deste trabalho e me presenteou com seu carinho e ajuda. Ao amigo Altemar, que me ajudou com seus conselhos e seu incentivo. A D. Lourdes, por ter preparado as minhas lâminas e ter sempre uma palavra amiga e um sorriso no rosto. A Karine, Lorena, Gabriela, Maria Carolina e Karen por compartilharem comigo os instantes finais de conclusão deste trabalho e estarem dispostas a ajudar. Aos funcionários dos matadouros-frigoríficos Municipal de Pojuca, do frigorífico UNIFRIGO Participações Ltda e FRIMASA- Frigoríficos Matadouros Salvador, pelo respeito e carinho que recebi durante as coletas das amostras desta pesquisa. Aos Professores e Doutores da Fundação Osvaldo Cruz Salvador, pela colaboração com as análises histopatológias e fotografia das mesmas. A professora Angela Ornelas que sempre me apoiou durante toda a minha estada nesta universidade. A Angélica, Kátia, Prof. Roberto Franke e Prof. Ronaldo pela ajuda e compreensão durante meu caminho de mestranda. Ao Professor Mauricio Costa por assumir a continuidade deste trabalho e pelo apoio carinhoso. Aos amigos de Eugênia da USP, em especial a Viviane Cambuí, pela realização das provas moleculares que tanto engrandeceram o meu trabalho.

7 vii É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a vida passar; é melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-se fazendo nada até o final. Eu prefiro na chuva caminhar, que em dias tristes em casa me esconder. Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade viver... (Martin Luther King)

8 viii ÍNDICE LISTA DE TABELAS...ix LISTA DE QUADROS...x LISTA DE ABREVIATURAS...xi RESUMO...xii SUMMARY...xiii 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Etiologia Aspectos epidemiológicos Imunopatogenia Sinais clínicos Achados de inspeção Diagnóstico Diagnóstico alérgico cutâneo Diagnóstico histopatológico Isolamento e identificação molecular Tuberculose zoonótica Controle ARTIGO CIENTÍFICO CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS...31

9 ix LISTA DE TABELAS Tabela 1. Lesões anatomo-histopatológicas e resultados bacteriológicos do espoligotipagem e reação da polimerase em cadeia de bovinos com amostras de pulmão e linfonodos com isolamento de Mycobacterium spp, Salvador, Bahia...21

10 x LISTA DE QUADROS Quadro 1. Padrão da espoligotipagem de Mycobacterium bovis isolados de pulmões e linfonodos de bovinos abatidos no município de Salvador, Bahia...22

11 xi LISTA DE ABREVIATURAS % = por cento DNA = ácido desoxirribonucléico PCR = Polymerase Chain Reaction et al., = e colaboradores pb = pares de bases RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism HPC = Hexadecyl pyridinum chloride DR = Direct Repeat ST = Stonebrink - Leslie LJ = Lowenstein Jensen HE = Hematoxilina- eosina ZN = Ziehl Neelsen RIISPOA = Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal PNCEBT = Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose BAAR = Bacilo alcoo-ácido- resistente

12 xii COSTA, A.C.F. Tuberculose bovina: diagnóstico anatomo-histopatológico, bacteriológico e molecular em animais abatidos na Região Metropolitana de Salvador, Bahia. Salvador, Bahia, 2008 (46) p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, RESUMO A utilização de informações oriundas de abatedouros como uma das estratégias de combate à tuberculose motivou o presente trabalho de isolamento e tipificação de micobactérias presentes em linfonodos e nas diversas lesões pulmonares, sugestivas ou não de tuberculose, comuns durante a rotina de inspeção. Foram analisadas 43 amostras de lesões pulmonares e linfonodos de bovinos abatidos em três matadouros na Região Metropolitana de Salvador. Destas amostras cinco apresentaram lesões macroscópicas sugestivas de tuberculose, confirmadas mediante análises histopatológicas, microbiológicas e moleculares. No spolygotyping sete amostras foram identificadas como M.bovis e discriminadas em três espoligotipos (SB1055, SB0120 e SB 0268), descritos no Brasil e diversas áreas do mundo. Os cinco isolados BAAR que não apresentaram hibridização na membrana do spoligotyping foram submetidos ao PCR-PRA, dos quais três foram classificados como pertencentes ao Complexo M. tuberculosis e dois considerados micobactérias atípicas (M. gordonae e M. kansasi). Os resultados indicam que o sistema diagnóstico utilizado pode contribuir para a criação de uma base de dados para o estudo epidemiológico da tuberculose bovina no estado da Bahia. Palavras - chave: Bovino; Mycobacterium bovis; spoligotyping; PCR- PRA.

13 xiii COSTA, A.C.F. Bovine tuberculosis: hystopathologic, microbiologic and molecular analysis in animals from slaughterhouses in the Metropolitan Region of Salvador, Bahia, Brazil, 2008 (46) p. Dissertation (Master of Science in Tropical Veterinary School of Veterinary Medicine, Federal University of Bahia, SUMMARY The use of information collected from slaughterhouses as one of the strategies of combat of tuberculosis motivated the present assay of isolation and typification of mycobacterium present in lymph nodes and in pulmonary lesions, suggestive or not of tuberculosis, common during inspection routine. 43 samples of pulmonary lesions and lymph nodes of slaughtered bovines in 3 slaughterhouses in the Metropolitan Region of Salvador, Bahia were analyzed. From these samples, 5 presented macroscopic lesions suggestive of tuberculosis, confirmed through hystopathologic, microbiologic and molecular analysis. In the spolygotyping 7 samples were identified as M. Bovis and discriminated in 3 spolygotype (SB1055, SB0120, SB0268), described in Brazil and in several areas worldwide. The 5 isolated BAAR that did not present hybridization of the membrane of spolygotyping were subjected to PCR-PRA, of which 3 were classified as pertaining to the M. Tuberculosis complex and 2 were considered atypical mycobacterium (M. Gordonae and M. Kansasi. The results showed that this diagnosis system may contribute to bovine tuberculosis epidemiological databases in Bahia, Brazil. Key words: Bovine; Mycobacterium bovis; spoligotyping; PCR- PRA.

14 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA EMV UFBA COSTA, Ana Carolina Farias Tuberculose bovina: Diagnóstico Anatomopatológico, Bacteriológico e Molecular em bovinos abatidos na Região Metropolitana de Salvador, Bahia. / Ana Carolina Farias Costa Salvador: A.C.F.C., 2008 N de pág.46 Orientador: Prof a. Dr a. Eugênia Márcia de Deus Oliveira Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) Universidade Federal da Bahia 1. Bovino 2. Micobacterium bovis 3. Spoligotyping 4. PCR-PRA

15 1. INTRODUÇÃO Inicia-se um novo milênio e no Brasil, a tuberculose é um problema de saúde tão grave quanto no início do século passado (SOUZA et al., 2005). Os avanços no seu conhecimento e a tecnologia disponível para seu controle, não têm sido suficientes para impactar significativamente a sua morbidade e mortalidade, principalmente nos países em desenvolvimento (BRASIL, 2002). A tuberculose é uma doença infecciosa crônica antiga, de distribuição mundial, que afeta seres humanos e animais, sendo considerada a doença infecciosa que mais mata em todo o mundo, com aproximadamente três milhões de mortes a cada ano; fato que se agravou com o aparecimento do vírus da imunodeficiência humana (HIV) que modificou a epidemiologia da tuberculose, dificultando assim o seu controle, constituindo, nos dias atuais, um sério problema de saúde pública (ROXO, 1996; SCHWARZ et al., 2002). Segundo O Reilly e Daborn (1995), a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) aumentou o risco de manifestação da doença em humanos, tanto por M. tuberculosis como possivelmente por M. bovis. A estimativa para este século, entre os anos de 2000 a 2020, é de que aproximadamente um bilhão de pessoas estarão infectadas; destas, 200 milhões de pessoas ficarão doentes e 35 milhões irão morrer de tuberculose, caso o controle não seja eficiente e rígido (PAULA, 1988; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1994; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2004). A tuberculose bovina, cujo agente etiológico é o Mycobacterium bovis, é uma zoonose de caráter crônico e de importância para a pecuária nacional, responsável por significativas taxas de condenação de carcaças em matadouros e mortalidade animal, resultando numa perda econômica estimada em 10% da produção leiteira e em 20% da produção de carne bovina brasileira (GRANGE; YATES, 1994; FERREIRA NETO; BERNARDI, 1997). Na América Latina e Caribe existem aproximadamente 300 milhões de bovinos, dos quais 73,7% estão em áreas com prevalência de tuberculose maior que 1%. Brasil e Argentina juntos 1

16 possuem 3,5 milhões de bovinos infectados pelo bacilo tuberculoso espalhados por todo o território, o que representa quase 2% da população bovina existente (KANTOR; RITACCO, 1994; ROXO, 2000). A tuberculose bovina é diagnosticada in vivo pelo exame clínico e o teste tuberculínico; após a morte, pelos exames post mortem, histopatológico e bacteriológico, incluindo sondas de DNA e técnicas de PCR (HAAGSMA, 1995). O combate à tuberculose bovina inicia-se com estratégias de controle, que têm como objetivo a diminuição constante do número de focos, o que é feito através da certificação de propriedades livres, que envolve a realização de testes indiretos em massa e operações de saneamento quando animais positivos são detectados (KANTOR; RITACCO, 1994). O passo seguinte é a fase de erradicação, onde o objetivo é a eliminação de todos os focos. Uma boa alternativa é utilizar as informações de abatedouros como base desse sistema (BROWN; HERNANDEZ DE ANDA, 1998). Portanto, as lesões são coletadas em abatedouros, enviadas ao laboratório e, após a confirmação bacteriológica do foco, rastreia-se a propriedade de origem, que é saneada através de uma rotina de testes tuberculínicos e sacrifício dos animais reagentes. Assim sendo, o diagnóstico direto, isto é, o isolamento, a identificação da espécie da micobactéria envolvida e a discriminação molecular dos isolados de M. bovis são elementos de grande importância para o sistema (AMBRÓSIO, 2005). Neste contexto, o presente trabalho teve por objetivos: realizar análise histopatológica de lesões pulmonares e linfonodais, sugestivas ou não de tuberculose, à macroscopia; isolar microrganismos do gênero Mycobacterium; e identificá-los molecularmente a partir das técnicas de spoligotyping e reação da polimerase com enzimas de restrição. Cabe ressaltar, que os resultados obtidos caracterizaram o primeiro levantamento molecular de tuberculose em bovinos abatidos em matadouros-frigoríficos da região metropolitana de Salvador, além de enfatizarem a importância da associação dos diagnósticos anatomopatológico, bacteriológico e molecular. 2

17 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Etiologia As bactérias causadoras da tuberculose pertencem à ordem Actinomycetales, família Mycobacteriacea e ao gênero Mycobacterium. Compreendendo atualmente 127 espécies e 11 subespécies diferentes com características muito diversas com relação à morfologia das colônias e às características bioquímicas, mas com algumas características taxonômicas comuns como: álcool-ácido-resistência, a presença dos ácidos micólicos (ácidos graxos de cadeia longa) e um ácido desoxirribonucléico (ADN) com alto teor de guanina e citosina. São bacilos curtos aeróbicos, imóveis, não capsulados, não flagelados, apresentando aspecto granular quando corados, medindo de 0,5 a 7,0 µm de comprimento por 0,3 µm de largura, sendo a álcool-ácidoresistência, a sua propriedade mais característica (KRIEG; HOLT, 1994; BRASIL, 2004, 2008; EUZÉBY, 2007). Os ácido micólicos são provavelmente o suporte molecular da álcool-ácidoresistência visto que quando ligados ao peptideoglicano, eles formam uma barreira periférica hidrofóbica, capaz de se ligar e reter fucsina, durante a coloração de Ziehl-Neelsen (KRITSKI et al., 2005). O Mycobacterium bovis está agrupado no Complexo Mycobacterium tuberculosis representado pelas micobactérias responsáveis pela tuberculose em humanos e animais domésticos e silvestres, por compartilharem similaridades genéticas, sendo composto pelo: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis subsp. bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti e Mycobacterium canetti (BIER, 1978; CORNER, 1994; GRANGE, 1996; ABRAHÃO, 1998; BROSCH et al., 2002; ZINK, NERLICH, 2004). Tem sido proposta a inclusão de novas espécies neste complexo, como M. caprae, agente etiológico da tuberculose em caprinos, e M. pinnipedii, que causa tuberculose em leões marinhos, mas que também pode infectar o homem (COUSINS et al.; 2003). 3

18 As micobactérias crescem em meios especiais constituídos por gema de ovo e amido, enriquecidos com asparagina e contendo verde malaquita para inibir organismos contaminantes (CORRÊA, 1992) denominado de meio de Löwenstein-Jensen. Para isolamento do M. bovis utiliza-se um meio de cultura que contém piruvato ao invés de glicerol, chamado de Stonebrink - Leslie. Outros meios usados são Ogawa, Sauton, Kirschner, Middlebrook e Tween (O REILLY; DABORN, 1995;). São bacilos muito resistentes frente às condições ambientais, permanecendo viáveis até 13 dias nas fezes bovinas nos pastos e até 100 a 150 dias no esterco dessecado nos estábulos sob proteção solar (MATHIAS, 1988). São destruídos pela pasteurização do leite e apresentam maior resistência aos ácidos, aos álcalis e aos desinfetantes químicos (amônia quaternária e Clohexidine). Agentes desinfetantes como fenólicos, formólicos, álcool e em especial pelo hipoclorito de sódio são bastante eficientes no combate ao bacilo, contudo sua ação pode ser afetada pela concentração do produto, o tempo de exposição, a temperatura e a presença de matéria orgânica (KANTOR, 1988). 2.2 Aspectos epidemiológicos A introdução e a manutenção da tuberculose em um rebanho são fortemente influenciadas por características da unidade de criação, dentre as quais se destacam os tipos de exploração, o tamanho do rebanho, a densidade populacional e as práticas zootécnicas e sanitárias. Observa-se que a doença é mais freqüente em rebanhos leiteiros do que em rebanhos de corte. Contudo, quando bovinos de corte e bubalinos são mantidos em confinamento ou submetidos a condições naturais de aglomeração, ficam sujeitos às mesmas condições de risco (BRASIL, 2008). Os animais contaminados são a principal fonte de infecção, sendo a via respiratória a porta de entrada mais comum. Alimentos contaminados e pastos possuem menor importância na transmissão da doença (KLEEBERG, 1984; CORNER, 1994; MORRIS et al., 1994). O agente pode ser eliminado pela respiração, pelo corrimento nasal, leite, fezes, urina, secreções vaginais e 4

19 uterinas e pelo sêmen. A ingestão de leite contaminado é a principal via de transmissão para animais jovens e também para o homem. A transmissão transplacentária é considerada muito rara ou inexistente nos bovinos. As vias de transmissão menos comuns são a intra-uterina e o coito, através de sêmen contaminado (NEIL et al, 1994). Uma vaca positiva à tuberculinização com mínima lesão pode estender a infecção para todo o rebanho (COLLINS; GRANGE, 1983). A tuberculose bovina causada pelo M. bovis possui distribuição mundial, concentrando-se principalmente em países em desenvolvimento e em criações intensivas na América do Sul, onde detém a maior população bovina (KLEEBERG, 1984). No Brasil, a situação da tuberculose bovina não se encontra bem delineada, pois os estudos disponíveis são escassos e não sistematizados (FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION, 1993). Dados epidemiológicos oficiais fornecem índices de prevalência da doença de 3,3% e 1,2% para os períodos de 1967 a 1976 e de 1988 a 1992, respectivamente, e de 1,3% de animais infectados no período de 1989 a 1998 (BRASIL, 2008). Os dados sobre incidência da tuberculose em bovinos são pouco conhecidos no Brasil. Existe uma estimativa de ocorrência em torno de 5,7% do rebanho nacional. Destes, 0,14% corresponde ao achado de lesões em matadouros (PUSTIGLIONE NETO, 1997; ROXO, 2000). Em trabalho realizado por Lilenbaum et al. (1998) sobre prevalência e estudo epidemiológico da tuberculose em treze propriedades de diferentes sistemas de produção na Região dos Lagos no Estado do Rio de Janeiro, foi encontrada uma taxa de positividade ao teste tuberculínico de 12,7% dos animais testados, o que é considerado extremamente alto. Níveis estimados de 10% de reatividade representariam cerca de 13 milhões de cabeças infectadas com M. bovis em todo Brasil, o suficiente pra colocar em alerta as autoridades sanitárias para os riscos à saúde da população. No entanto, trabalhos sobre fatores de risco na prevalência de enfermidades dos animais são raros; sinalizando sobremaneira que os fatores mais influentes na prevalência da tuberculose bovina, devem ser identificados e investigados a depender das condições de cada região. 5

20 A partir dos dados relativos às doenças diagnosticadas em exames post-mortem, Baptista et al. (2004), avaliaram a prevalência da tuberculose em bovinos, abatidos em Minas Gerais, de 1993 a 1997, em matadouros sob o Serviço de Inspeção Federal e encontraram uma prevalência global de 0,7%, ressaltando, porém neste mesmo trabalho que o percentual encontrado subestima a prevalência real, visto que além de considerar a afirmação de Corner (1994) que a inspeção de rotina só identifica cerca de 47% das lesões tuberculosas macroscopicamente detectáveis; alerta para os casos de tuberculose sem lesões macroscópicas detectáveis em exame post-mortem, reservando-se ao matadouro o papel de sentinela epidemiológica e de rastreabilidade, no âmbito dos programas de combate às doenças. Só o levantamento da doença nas fazendas, em amostras representativas ou abrangendo a totalidade dos animais, pode proporcionar boas estimativas da freqüência da doença. Ribeiro et al realizaram um estudo no município de Ilhéus-Bahia, para avaliar através do teste intradérmico cervical comparado a prevalência da tuberculose na região, constatando a presença de animais positivos em 10,6% das 85 propriedades estudadas e uma prevalência de 2,8% dos 916 animais testados. Na bacia leiteira de Alagoinhas-Bahia foi observada uma taxa de 5,5% de animais positivos ao teste cervical comparado, e condições favoráveis para disseminação da tuberculose na população humana pelo hábito do consumo de leite in natura (COSTA et al. 1995/1996). Em trabalho desenvolvido por técnicos do Centro de Desenvolvimento da Pecuária (CDP), da Escola de Medicina Veterinária da UFBA, no período de 1988 a 2001, foram avaliados os resultados obtidos pela tuberculinização realizada em 2488 animais oriundos de 115 propriedades de produção leiteira, dos seguintes municípios: Alagoinhas, Conceição do Jacuípe, Feira de Santana, Itororó, Pedrão, Santo Amaro, São Gonçalo, São Sebastião do Passé e Terra Nova. Como resultado obteve-se 255 animais com reações positivas (10%), 171 com reações inconclusivas (7%) e 2062 com reações negativas (83%) (FERREIRA et al., 2001). 6

21 O Brasil possui alguns fatores que dificultam uma política de ação, tais como o tamanho do rebanho brasileiro, a grande extensão territorial, a existência de fronteiras com outros dez países, as grandes diferenças regionais quanto à infra-estrutura e condições sócio econômicas, a grande heterogeneidade quanto ao modo de produção e situação sanitária, a insuficiência de recursos financeiros destinados aos órgãos oficiais que se ocupam da saúde animal. Outra limitação é a não indenização dos proprietários (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE BUIATRIA, 2006 ). Estima-se que um animal tuberculoso perde de 10 a 25% de sua capacidade produtiva, o que traz prejuízos à atividade pecuária e ainda passa a ser um foco da doença para outros animais e o homem (COSIVI et al., 1998). 2.3 Imunopatogenia A tuberculose bovina é uma enfermidade de evolução crônica, caracterizada pela formação de lesões do tipo granulomatosa, de aspecto nodular, denominado tubérculo. O alvéolo pulmonar é a principal porta de entrada do bacilo da tuberculose em bovinos, favorecendo o aparecimento de lesões, principalmente nos gânglios brônquicos e/ou mediastínicos. Uma vez instalado no alvéolo, o bacilo é capturado por macrófagos alveolares, ativados por linfócitos do tipo T, e o seu destino será determinado por fatores como virulência do microrganismo, carga infectante e resistência do hospedeiro (SOUZA et al., 1999). Quando a infecção é pela via digestiva, a lesão se dá no sítio de entrada, principalmente nos linfonodos faríngeos e mesentéricos. No entanto, podem atingir outros órgãos quando da generalização do processo (ROXO, 1996). O foco inicial da infecção na porta de entrada com o envolvimento de um linfonodo regional é denominado complexo primário. Nesta fase, os macrófagos se acumulam no complexo e usualmente se observa a formação de células epitelióides e de células gigantes de Langhans. Assim, o centro do tubérculo é usualmente formado pela associação células gigantes e células 7

22 epitelióides, circundadas por uma zona de linfócitos, células plasmáticas e de monócitos. Na medida em que a lesão evolui, o tubérculo desenvolve fibroplasia periférica e necrose central caseosa, sendo esta última intimamente ligada à hipersensibilidade retardada, podendo-se observar mineralizações por precipitação de sais de cálcio (NEILL et al., 1994). Apesar da tuberculose bovina, ser definida como uma doença crônica debilitante, também pode assumir caráter agudo e progressivo. Qualquer tecido pode ser afetado, mas as lesões de aspecto caseoso são mais comumente observadas nos linfonodos da cabeça, pescoço, mediastínicos e mesentéricos, pulmões, intestinos, fígado, baço, pleura e peritônio (ROXO 1996). 2.4 Sinais clínicos A tuberculose e as micobacterioses nos rebanhos de animais de produção são doenças de evolução lenta, e os sinais clínicos muitas vezes não são exteriorizados (principalmente entre os animais de criação de ciclo mais rápido) ou observam-se apenas sinais inespecíficos como dispnéia, tosse, mastite, infertilidade, caquexia e depauperação; freqüentemente a sua presença só é percebida no momento do abate, onde é praticamente impossível à caracterização do tipo de organismo envolvido (FERREIRA NETO et al.; 1989; BALIAN et al.; 1997; ABRAHÃO, 1998; BRASIL, 2008) A tuberculose intestinal é manifestada por sintomas inespecíficos, como cólicas ocasionais, com diarréia e constipação alternantes, causadas pela compressão de linfonodos aumentados sobre os órgãos vizinhos. Fígado e baço aumentados de volume, gânglios linfáticos da pele e tecido conjuntivos subcutâneo com elevações de tamanho, geralmente indolores, podem ser observados (BERR, 1988). O estabelecimento da doença pode ser favorecido por fatores como: má nutrição, doenças intercorrentes, aumento da produção leiteira e gestação. No período inicial da infecção podem não haver sintomas, os sinais clínicos ocorrem em casos mais avançados e correspondem a emaciação gradual, aumento dos linfonodos e tosse. As lesões tuberculosas são mais 8

23 freqüentemente encontradas nos pulmões, linfonodos retrofaríngeos, brônquicos, mediastínicos, mesentéricos, no fígado, baço e em outros órgãos (KLEEBERG, 1984; NEILL et al., 1994; HAAGSMA, 1995; RUGGIERO, 2004). 2.5 Achados de inspeção A inspeção dos linfonodos deve ser feita com especial atenção, pois os linfonodos regionais exercem vital importância na defesa dos órgãos. O exame cuidadoso de pelo menos seis pares de linfonodos entre os da cabeça (mandibulares, parotídeos e retrofaringeos), torácicos (mediastínicos e bronquiais), mesentéricos e da carcaça (pré-escapulares, ilíacos, isquiáticos, sacral e inguinal superficial), bem como dos pulmões, fígado, baço, rins, úbere e órgãos genitais, pode identificar até 95% dos animais com lesões macroscópicas (CORNER, 1994). Os granulomas tuberculosos podem ser encontrados em qualquer linfonodo, mas particularmente em linfonodos bronquiais, mediastínicos e no pulmão; abscessos miliares podem se estender causando uma broncopneumonia supurativa (RADOSTITS et al., 1995). Aos pulmões é dedicada uma atenção especial nos exames de rotina, sendo inspecionados individualmente e vinculando-se qualquer alteração as possíveis ocorrências em outros órgãos e mesmo eventuais reflexos na carcaça (MIRANDA et al., 1997). Macroscopicamente, a superfície de corte do granuloma apresenta-se com área central necrótica, na maioria das vezes, rangendo-se ao contato com a faca, indicando a presença de calcificação (OLIVEIRA et al., 1986). Na inspeção realizada em frigoríficos, diversas doenças (actinobacilose, piogranuloma estafilocócico, mucormicose, coccidioidomicose, pentastomíase, hidatidose policística e alguns tumores) apresentam lesões macroscópicas similares à tuberculose. Para diferenciar essas lesões da tuberculose é necessário o exame histopatológico e microbiológico (RIET - CORREA; GARCIA, 2001). 9

24 2.6 Diagnóstico A grande variabilidade de sintomas e lesões, bem como o caráter crônico da tuberculose, faz com que o diagnóstico clínico tenha um valor relativo, proporcionando apenas um diagnóstico presuntivo (SOUZA et al., 1999). Exames complementares incluem os testes tuberculínicos e os exames anatomopatológicos, bacteriológicos e moleculares, bem como a interação dos achados epidemiológicos (MELO et al., 1999) Diagnóstico alérgico cutâneo O principal método de diagnóstico da tuberculose em bovinos é o teste imunoalérgico (CENTRO PANAMERICANO DE ZOONOSIS, 1988). A reação alérgica à tuberculina é uma reação de hipersensibilidade retardada tipo IV mediada por resposta celular e com baixa produção de anticorpos. Após a inoculação em animal previamente sensibilizado, a tuberculina é fagocitada e seus peptídeos apresentados na superfície celular dos macrófagos. A resposta específica tem início quando os linfócitos T sensibilizados reconhecem os antígenos tuberculínicos e secretam citocinas, que ativam células endoteliais venulares e que por sua vez recrutam monócitos e leucócitos do sangue, enquanto outras citocinas convertem os monócitos em macrófagos ativados capazes de eliminar o antígeno. Macroscopicamente a resposta se manifesta na forma de edema e endurecimento progressivo no local da aplicação que atinge seu máximo por volta das horas pós-inoculação, diminuindo em seguida (CORRÊA; CORRÊA, 1992; BRASIL, 2008). Dentre as técnicas de tuberculinização mais difundidas no Brasil e preconizada pela OMS (Organização Mundial da Saúde), CEPANZO (Centro Panamericano de Zoonose) e PNCEBT (Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose), destacam-se a reação intradérmica simples (caudal ou cervical), com o uso exclusivo do PPD (derivado de proteína purificado) bovino, para fins de triagem do rebanho, e a intradérmica comparativa, com o emprego dos PPDs bovino e aviário, empregada nas detecções de reações inespecíficas, que ocorrem devido a infecção por micobactérias atípicas, como M. avium, M. intracellulare e M. scrofulaceum (MELO et al., 1999). 10

25 2.6.2 Diagnóstico histopatológico Os métodos histopatológicos empregados para identificar os bacilos, a exemplo daqueles obtidos por meio de cortes de lesões coradas, são rápidos e baratos, mas outros agentes que não o M. bovis podem produzir lesões semelhantes à da tuberculose bovina, dificultando o diagnóstico (HAAGSMA, 1995; WARDS et al., 1995; ZANINI et al., 2001). O método de visualização de micobactérias através da coloração de Ziehl-Neelsen, a despeito de ser rápido e barato, só consegue revelar a presença de bacilos álcool-ácido resistentes em concentrações superiores a 10³ bactérias por ml, sendo que esta técnica não permite distinguir os membros da família Mycobacteriaceae (BARKSDALE; KIM, 1977) e outros microrganismos tais como Corynebacterium, Nocardia e Rhodococcus que tem as mesmas características tintoriais (PRITCHARD, 1988). As lesões histopatológicas da tuberculose caracterizam-se por uma área central de necrose caseosa, às vezes mineralizada, circundada por células gigantes tipo Langhans, células epitelióides, histiócitos e na periferia a presença de mononucleares, linfócitos e raros plasmócitos, circundados por tecido conjuntivo fibroso, configurando o folículo tuberculoso (OLIVEIRA et al., 1986). O exame histopatológico pode ser aplicado principalmente em regiões de alta prevalência da doença, por ser de conclusão mais rápida para o diagnóstico presuntivo, que deve ser confirmado em definitivo pelo cultivo de amostra (CORNER, 1994) Isolamento e identificação molecular Para a realização do diagnóstico definitivo da tuberculose é necessário o cultivo e identificação. As técnicas bacteriológicas empregadas apresentam baixa sensibilidade, devido aos métodos drásticos de descontaminação do material, que além de destruir os contaminantes, ao mesmo tempo matam alguns bacilos, dificultando o seu isolamento, além da necessidade de uma 11

26 grande quantidade de bacilos viáveis e um longo tempo de crescimento em meios de cultura apropriados (CORNER, 1994; HAAGSMA, 1995; WARDS et al., 1995; ZANINI et al., 2001). Para o isolamento de Mycobacterium bovis, o meio de cultura mais recomendado é o de Stonebrink-Leslie isento de glicerina e contendo piruvato de sódio como fonte de carbono. O tempo de crescimento do bacilo varia entre três a seis semanas de incubação a uma temperatura de 37 C (HAAGSMA, 1995). Para ser isolada, a amostra, antes de ser semeada é triturada e tratada com solução descontaminante, devido à provável presença de fungos e bactérias. O objetivo da descontaminação é eliminar a microbiota presente na amostra, por se multiplicar mais rapidamente que o Mycobacterium bovis e prejudicar seu isolamento, impedindo a identificação. O efeito tóxico do descontaminante sobre as micobactérias pode variar muito, interferindo assim no resultado do diagnóstico (KANTOR, 1988; CORNER, 1994). Com o intuito de ajudar e facilitar a rotina de identificação das micobactérias, vários métodos têm sido propostos, tais como cromatografia em camada delgada que não obteve grande difusão; a radiometria, que diminui o tempo para detecção e identificação, mas depende de cultivos e do manuseio de radioisótopos (COUSINS et al., 1991) e, a reação em cadeia de polimerase PCR, Polymerase Chain Reaction, um avanço promissor no diagnóstico rápido da tuberculose, capaz de reduzir o tempo de diagnóstico de meses para poucos dias, e com vantagem de apresentar uma elevada especificidade e sensibilidade, além de detectar quantidades muito pequenas de bacilo na amostra, mesmo que estejam mortos (MULLIS, 1990; KOCAGOZ et al., 1993; BEIGE et al., 1995;ABRAHÃO, 1998). As principais barreiras para aplicação do método de PCR na rotina laboratorial são a extração de DNA e a escolha dos primers adequados. Estudos relacionados com os métodos de extração existem, mas empregam soluções ou kits comerciais inadequados à realidade do produtor brasileiro. A maior dificuldade no processo de extração está relacionada principalmente à pequena quantidade de bacilos presentes em lesões de bovinos tuberculosos, a dificuldade em concentrar o DNA no pellet e a presença de DNA do animal, além do DNA do agente (RUGGIERO, 2004). 12

27 Outra técnica molecular que vem sendo aplicada à pesquisa de tuberculose é o spoligotyping, que possibilita a detecção e tipificação das micobactérias do Complexo M. tuberculosis, sendo indicado como técnica de eleição para comparação de estirpes com poucas cópias de IS6110, além de permitir diferenciação de estirpes de M. bovis e M. tuberculosis (SAKAMOTO, 2001). Esta técnica baseia-se na amplificação enzimática do locus DR (Direct Repeat) do Complexo M. tuberculosis, ou seja, este método detecta a presença ou ausência de espassadores no locus DR, diferenciando as amostras isoladas, podendo ser empregado na investigação epidemiológica, permitindo a identificação do curso da infecção e das rotas de transmissão da doença, ou mesmo da compreensão epidemiológica da infecção que são fundamentais para um melhor controle e erradicação da doença (ROMANO et al., 1996; LIÉBANA et al., 1997; ZANINI et al., 2001, ROSALES RODRIGUEZ, 2005). Contudo, não são muitos os estudos moleculares aplicados à pesquisa direta de bacilos em amostras clínicas, principalmente de M. bovis, necessitando de maiores avaliações com a finalidade de evitar resultados falso-positivos ou falso-negativos e validar a sua performance sob as condições dos países nos quais serão usados, principalmente nos países tropicais (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1994; WARDS et al., 1995). O diagnóstico bacteriológico, mediante isolamento e tipificação da bactéria, é necessário para a vigilância epidemiológica da enfermidade. Nas campanhas de controle ou erradicação, à medida que diminui a prevalência da doença, é mais importante tipificar as bactérias isoladas de lesões de tuberculose, com o objetivo de identificar aquelas que induzem reação cruzada com a tuberculina bovina (RIET-CORREA; GARCIA,2001). 2.7 Tuberculose zoonótica Em 1898, Theobald Smith isolou pela primeira vez o M. bovis em bovino e em 1902 Ravenel obteve a prova definitiva da transmissão da tuberculose bovina ao homem, decorrente da 13

28 ingestão de alimentos, isolando em uma cultura pura os bacilos presentes em gânglios mesentéricos de uma criança falecida de meningite tuberculosa (FELDMAN, 1955). Mycobacterium bovis pode causar no homem um quadro clínico indistinguível da doença causada por M. tuberculosis e pode ser adquirido pela ingestão de leite não pasteurizado e como doença profissional (risco ocupacional). O quadro clínico pode manifestar-se décadas após a infecção primária. Não existe evidência de transmissão entre humanos. Na década de 90 foi descrita uma epidemia em hospitais na Espanha causada por uma cepa de M. bovis multiresistente a drogas, acometendo pacientes com infecção avançada pelo HIV, com alta taxa de mortalidade. Este fato mostra a importância desta bactéria na patologia humana. O Mycobacterium bovis tem distribuição ampla de hospedeiros, espécies susceptíveis incluem gado bovino, homem, outros primatas, cabra, gato, cachorro, porco, búfalo, texugo, gambá, veado e bisão. Muitas destas espécies susceptíveis são hospedeiros acidentais, nos quais, acredita-se, a infecção não se mantém isoladamente ( LEÃO, 1999). Registros sobre tuberculose humana causada pelo M. bovis são escassos, principalmente na América Latina e Caribe, visto que o método diagnóstico de eleição, representado pela baciloscopia de escarro, não permite diferenciar o bacilo humano do bovino. No entanto a Argentina, que dispõe de uma alta taxa de diagnóstico bacteriológico para a tuberculose humana com isolamento e identificação do agente, retratou que durante os anos de 1984 a 1989, de todos os casos de tuberculose diagnosticados no país, 2,4% a 6,2% eram causados pelo bacilo bovino, e cerca de 64% envolviam profissionais de matadouros e tratadores de animais, assumindo um caráter basicamente profissional, com transmissão por aerossóis. Em países desenvolvidos como os Estados Unidos, estima-se que no Estado da Califórnia, em 2001, cerca de 7% dos casos de tuberculose humana, foram causados pelo M. bovis ( KANTOR; RITACCO,1994; LATINI et al., 1990; USABIAGA, 2001; RUGGIERO, 2004). 14

29 2.8 Controle Todos os programas que lograram êxito no controle da tuberculose bovina basearam-se no saneamento de rebanhos infectados, e as medidas adotadas foram: a tuberculinização periódica, sacrifício dos reagentes e confirmação do diagnóstico através de exames histopatológicos e bacteriológicos, adoção de métodos de limpeza e desinfecção, controle de trânsito de animais, quarentena, notificação, controle de reservatórios quando necessário e criação de divisões entre regiões e propriedades conforme a ocorrência da doença (FERREIRA NETO; BERNARDI, 1997). Programas de controle da doença nos rebanhos em países industrializados foram criados e implantados no início do século passado. Nos Estados unidos o programa foi estabelecido em 1917, e o evento mais importante era a inspeção de carne em matadouros para detectar o gado tuberculoso. No Canadá o programa foi criado em 1923, mas a inspeção de carcaças já era realizada desde 1907 (ESSEY; KOLLER, 1994). No Brasil, o Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal RIISPOA, que inclui a classificação e disposição legal das carcaças com lesões sugestivas de tuberculose, data de Programas de erradicação baseados em testes de tuberculinização com posterior abate dos animais reatores, têm obtido diversos resultados em vários países como na União Européia, onde a situação sanitária não é homogênea e existem: países que erradicaram a doença (Dinamarca, Holanda e Luxemburgo), países nos quais a prevalência da doença é extremamente pequena (Alemanha, Bélgica, Inglaterra, França, Grécia e Portugal) e outros onde a doença ainda não está suficientemente controlada (Itália, Irlanda e Espanha). Nestes programas, aos métodos diretos de diagnóstico é reservada uma função estratégica e de apoio às ações de vigilância, tradicionalmente desenvolvidas nas fases de erradicação ou de baixa prevalência de focos (RODRIGUEZ, 2004). O Programa Nacional de Controle da Tuberculose no homem tem como objetivo descobrir e tratar adequadamente o total da população doente (LEÃO, 1999), enquanto que o Programa 15

30 Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose animal (PNCEBT) foi instituído em 2001 e tem como objetivo diminuir a prevalência e a incidência de novos casos de tuberculose, assim como criar propriedades certificadas que ofereçam ao consumidor produtos de baixo risco sanitário (BRASIL, 2008). A estratégia do programa nacional é a certificação de propriedades livres e de propriedades monitoradas, sendo a adesão dos produtores voluntária, onde o proprietário compromete-se a sacrificar os animais reagentes à tuberculinização. Os testes são efetuados em todos os animais com idade igual ou superior a seis semanas. As propriedades certificadas ficam obrigadas a repetir os testes anualmente, em todos os animais do rebanho. O ingresso de animais fica condicionado a apresentação de dois testes com resultados negativos ou serem oriundos de propriedades monitoradas ou livres. Deve-se salientar a importância da participação do serviço de inspeção de origem animal que deverá comunicar ao serviço de defesa sanitária animal oficial os achados sugestivos de tuberculose em carcaças e vísceras (BRASIL, 2008). A inexistência de fundos para indenização dos criadores que abatem os animais reatores positivos à prova de tuberculina, o abate clandestino de animais tuberculosos, o comércio clandestino de leite e a omissão das autoridades competentes alegando falta de recursos financeiros dificultam o êxito do Programa de Controle e Erradicação da Tuberculose no Brasil (FONSECA, 1982; ANTENORE, 1998; RIET- CORREA, CORREA, 2001) 16

31 TUBERCULOSE BOVINA: DIAGNÓSTICO ANÁTOMO-HISTOPATOLÓGICO, BACTERIOLÓGICO E MOLECULAR EM BOVINOS ABATIDOS NA REGIAO METROPOLITANA DE SALVADOR, BAHIA. COSTA, Ana Carolina Farias 1* ; SILVA, Nairléia dos Santos 2 ; ROCHA, Vivianne Cambuí Mesquita 3 ; ROSALES RODRIGUEZ, Cesar Alejandro 3 ; SILVA, Alessandra Estrela 4 ; MOREIRA, Eduardo Luiz Trindade 4 ; MADRUGA, Cláudio 4 ; ARRUDA, Sérgio Marcos 5 ; FERREIRA NETO, José Soares 3 ; SILVA, Maurício Costa Alves 2 ; OLIVEIRA, Eugenia Márcia de Deus Mestranda em Ciência Animal nos Trópicos/EMV/UFBA 2. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva/EMV/UFBA 3. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal/FMVZ/USP. 4. Departamento de Patologia e Clínicas/EMV/UFBA 5. Centro de Pesquisas Gonçalo Muniz - Fundação Osvaldo Cruz *Endereço para correspondência: mcasilva@ufba.br Resumo: Foram analisadas as lesões pulmonares e de linfonodos mediastínicos de 43 carcaças de bovinos abatidos em três matadouros-frigoríficos localizados na Região Metropolitana de Salvador, Bahia. Sete amostras foram identificadas, através técnica do spolygotyping, como Mycobcterium bovis, discriminadas em três espoligotipos (SB1055, SB0120 e SB0268), descritos no Brasil e em diversas áreas do mundo. Os cinco isolados BAAR que não apresentaram hibridização na membrana do spoligotyping foram submetidos ao PCR-PRA, dos quais três foram classificados como pertencentes ao Complexo M. tuberculosis e dois considerados micobactérias atípicas (M. gordonae e M. kansasi). Os resultados indicam que o sistema diagnóstico utilizado pode contribuir para a criação de uma base de dados para o estudo epidemiológico da tuberculose bovina no estado da Bahia. Palavras-chave: Bovino; Mycobacterium bovis; spoligotyping; PCR- PRA. Abstract: Fourty-three samples of pulmonary lesions and lymph nodes of bovine carcasses from three slaughterhouses in the Metropolitan Region of Salvador city, Bahia, were analyzed. Seven samples were identified as Mycobcterium bovis by spolygotyping and discriminated in three spolygotypes (SB1055, SB0120, SB0268), all described in Brazil and in several areas worldwide. Five BAAR isolates that did not present hybridization of the membrane of spolygotyping were subjected to PCR-PRA, of which three were classified as pertaining to the M. tuberculosis complex and two of them were considered as atypical mycobacterium (M. Gordonae and M. 17

32 Kansasi). The results showed that this diagnosis system may contribute to bovine tuberculosis epidemiological databases in Bahia, Brazil. Key words: Bovine; Mycobacterium bovis; spoligotyping; PCR- PRA. INTRODUÇÃO A tuberculose é uma doença infecciosa crônica, antiga, de distribuição mundial, que afeta mamíferos e aves, constituindo um sério problema de saúde pública e animal (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE BUIATRIA, 2002). Além de revelar altos índices de mortalidade e morbidade no homem, a tuberculose é causa significativa da diminuição de produtividade nos rebanhos, resultando numa perda estimada de 10% da produção leiteira e em 20% da produção de carne bovina brasileira (GRANGE & YATES, 1994; FERREIRA & BERNARDI, 1997). O agente etiológico da tuberculose pertence ao gênero Mycobacterium que contem mais de 50 espécies, dentre as quais pelo menos 22 podem causar doença no homem. O M. bovis está agrupado no "Complexo Mycobacterium tuberculosis", representado pelas principais micobactérias com importância epidemiológica: M. tuberculosis, M. bovis subsp. bovis, M. microti e Mycobacterium canetti, M. africanum, este último ainda não isolado no Brasil (BIER, 1978; CORNER, 1994; GRANGE, 1996; ABRAHÃO, 1998; BROSCH et al., 2002; ZINK, NERLICH, 2004). Novas espécies, a exemplo da M. caprae e M. pinnipedii, que podem infectar o homem, têm sido propostas para inclusão neste complexo (COUSINS et al., 2003). A susceptibilidade do homem ao Mycobacterium bovis, que causa um quadro clínico indistinguível da doença causada pelo Mycobacterium tuberculosis, é uma das principais razões da importância desta zoonose nos bovinos. Ressaltando que a informação epidemiológica sobre a tuberculose humana causada por este bacilo no Brasil, é relativamente escassa, tendo em vista que o diagnóstico de rotina em humanos não permite diferenciar os dois bacilos, mesmo quando realizado o cultivo, no qual não é usual o emprego dos meios de cultura adequados para Mycobacterium bovis (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE BUIATRIA, 2002) Para o estabelecimento dos programas de controle deve ser considerado o índice de prevalência da doença nos rebanhos. Em países com elevada incidência da doença é fundamental a vigilância epidemiológica, principalmente, a partir da inspeção das carcaças em matadouros, sendo pouco requisitados os diagnósticos definitivos. Nos estágios avançados das campanhas, em razão da diminuição da incidência da doença, passa a ser essencial o diagnóstico definitivo baseado na cultura e no isolamento do patógeno (CORNER, 1994). 18

33 O principal método de diagnóstico da tuberculose em bovinos, in vivo, preconizado pelo Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT), é o teste imunoalérgico que se baseia na reação de hipersensibilidade tardia mediada por linfócitos sensibilizados, deflagrada em indivíduos previamente expostos às tubérculo-proteínas específicas (ROXO, 1996). Já o diagnóstico post-mortem, é realizado pelo exame dos órgãos na necropsia ou achados de abate, as lesões suspeitas são encaminhadas para o exame histopatológico para verificação da presença de granuloma ( KANTOR, 1979) O diagnóstico definitivo é realizado pelo isolamento do agente micobacteriano de lesões ou secreções de animais suspeitos. A identificação do agente é feita por meio de provas bioquímicas, técnicas de biologia molecular, como a reação de polimerase em cadeia (PCR), ou análise química de diferentes grupos funcionais de ácidos micólicos, presentes na parede das micobactérias (ARAÚJO et al., 2004) Uma combinação que tem se mostrado eficiente para o diagnóstico direto da tuberculose bovina é o isolamento através da bacteriologia clássica, seguido da identificação por métodos moleculares PRA-PCR (TELENTI et al., 1993); Spoligotyping (KAMERBEEK et al., 1997; Van SOOLINGENET et al., 1995); MIRU-VNTR (SUPLY et al., 2000). Além de identificar a espécie, as técnicas de Spoligotyping e MIRU-VNTR permitem discriminar isolados de M. bovis. O objetivo do presente trabalho foi utilizar as linhas de inspeção de matadouros-frigoríficos localizados na região metropolitana de Salvador, Bahia para diagnosticar a tuberculose bovina e identificar através da técnica de spoligotyping e do PCR-PRA, os isolados de Mycobacterium. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Amostragem No período de maio de 2006 a fevereiro de 2007, foram coletadas amostras de pulmão e linfonodos mediastínicos de 43 carcaças bovinas condenadas por tuberculose ou alterações pulmonares de diagnósticos macroscópicos diversos durante a rotina de inspeção em três abatedouros bovinos localizados na Região Metropolitana de Salvador, sendo um da rede SIF (Serviço de Inspeção Federal), outro SIE (Serviço de Inspeção Estadual) e outro SIM (Serviço de Inspeção Municipal). 19

34 As amostras foram coletadas em duplicata, um dos fragmentos foi congelado e enviado ao Laboratório de Bacterioses/EMEV/UFBA para realização do cultivo e o outro fixado em formol neutro e tamponado com fosfato a 10% e enviado ao Laboratório de Anatomia Patológica/EMEV/UFBA para realização do exame histopatológico. 2.2 Análise histopatológica As amostras foram fixadas em formol neutro e tamponadas com fosfato a 10% e processados pela técnica rotineira de inclusão em parafina (PROPHET et al., 1992). Secções histológicas de 4 µm foram coradas pelas técnicas da hematoxilina-eosina (LUNA, 1968) para avaliação morfológica e Ziehl Neelsen para visualização de bacilo álcool-ácido-resistente. Todas as alterações foram relatadas considerando não apenas as lesões tuberculosas. 2.3 Cultivo Cada amostra foi macerada em stomacher, descontaminada pelo método de HPC Cloreto de 1- Hexadecilpiridínio (CORNER & TRAJSTAMAN, 1988; AMBRÓSIO, 2005) e semeadas em meios de Lowenstein-Jensen e Stonebrink Leslie (CENTRO PANAMERICANO DE ZOONOSIS, 1973) à 37º C por até 90 dias. Os cultivos foram observados semanalmente para verificação de crescimento de colônias sugestivas de micobactéria. As colônias isoladas foram submetidas à coloração de Ziehl-Neelsen (CENTRO PANAMERICANO DE ZOONOSIS, 1988) e uma vez confirmada à característica de BAAR (Bacilo álcool-ácido resistente) foram repicadas e enviadas ao Laboratório de Zoonoses Bacterianas/FMVZ/USP para caracterização molecular Caracterização Molecular O DNA dos microrganismos BAAR positivos foi submetido a análise de polimorfismo pelo método de spoligotyping executado de acordo com a descrição de Kamerbeek et al. (1997). Os padrões obtidos na hibridização no spoligotyping foram analisados com aqueles existentes no banco de dados de M. bovis ( e publicações (RODRIGUEZ et al., 2004). Os isolados BAAR que não foram caracterizados como pertencentes ao Complexo M. tuberculosis pelo spoligotyping foram adicionalmente avaliados na PCR-PRA descrita por Telenti et al. (1993). 3. RESULTADOS 20