FUNGOS ESTRUTURAS E MORFOLOGIA MEIOS DE CULTURA COLETA E PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS. Profa. Dra. Simone Aquino UNINOVE

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1 FUNGOS ESTRUTURAS E MORFOLOGIA MEIOS DE CULTURA COLETA E PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS Profa. Dra. Simone Aquino UNINOVE Os fungos são ubíquos, encontrando-se no solo, na água, nos vegetais, em animais, no homem e em detritos, em geral. O vento age como importante veiculo de dispersão de seus propágulos e fragmentos de hifa. 1

2 Reino: Fungi Filo: Eumycota Classes: Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota e fungos imperfeitos (Deuteromicetos) REINO EUMYCOTA (De Hoog et al 2000) Divisões Zygomycota Chytridiomycota Ascomycota Basidiomycota Os fungos apresentam características próprias que permitem sua diferenciação: Não sintetizam clorofila Não tem celulose na parede celular (exceto fungos aquáticos) Não armazenam amido como substância de reserva (glicogênio) Uni ou pluricelulares sem a capacidade de formar tecido Imóveis na sua maioria. Os fungos são seres vivos eucarióticos, com um só núcleo (leveduras), ou multinucleados (fungos filamentosos ou bolores). Possuem organelas citoplasmáticas e inclusões como: mitocôndrias, vacúolos, vesículas, retículo endoplasmático, microtúbulos, ribossomos e cristais de glicogênio. Possuem aparelhos de Golgi. 2

3 A parede (sem celulose) é formada de polissacarídeos, ligados ou não a proteínas ou lipídeos, polifosfatos e íons inorgânicos. Proteínas (manoproteínas) Polissacarídeos (Glucanas, Galactomananas) Quitina Proteínas (Glicoproteínas) Lipídeos (fosfolipídeos) Possuem ergosterol como o principal componente da membrana fúngica. Os fungos são heterotróficos (nutrição de absorção) e parasitam seres vivos (patógenos), atacam matéria morta (sapróbios) ou simbiontes. Matéria orgânica morta (fungos saprofíticos) Organismos vivos (fungos patógenos) Exploram o solo em busca de nutrientes e os transportam para as plantas (simbiontes) 3

4 Aa - Os fungos necessitam de água (menos exigentes que bactérias). Atividade de água varia de 0,70 a 0,98. Sal- Alguns são halofílicos, crecem com elevada concentração de sal. Temperatura de crescimento - Ampla faixa: espécies psicrófilas, mesófilas e termófilas. ph favorável entre 5 a 7. Os fungos filamentosos crescem entre 1,5 e 11, mas as leveduras não toleram ph alcalino. Oxigênio - Filamentosos aeróbios obrigatórios. Leveduras se desenvolvem com pouco ou nenhum oxigênio (fermentadoras). O crescimento dos fungos é mais lento que o das bactérias e suas culturas precisam, em média, de 7 a 15 dias, ou mais de incubação. Muitas espécies fúngicas exigem luz para seu desenvolvimento; outras inibidas e outras ainda mostram-se indiferentes a luz. A luz solar direta, devido à radiação ultravioleta, é elemento fungicida. Os fungos sintetizam vários metabólitos, como antibióticos (penicilina) e micotoxinas (aflatoxinas, que são carcinogênicas). 4

5 Os fungos se diferenciam pela macromorfologia e podem se desenvolver em meios de cultivo especiais formando colônias de dois tipos: Leveduriformes Filamentosas ou bolores TERMOS EMPREGADOS EM MICOLOGIA Bolor = fungo filamentoso, multicelular, constituído de hifas. Hifa = estrutura multicelular tubular ou filamentosa que formam os micélios. Micélio = conjunto de hifas (emaranhado de filamentos ou hifas) Hifa Micélio 5

6 TERMOS EMPREGADOS EM MICOLOGIA O micélio é dividido em duas partes: Micélio aéreo: Função = Reprodução, se projeta na superfície (cresce acima) do substrato. Contém os corpos de frutificação ou propágulos. O micélio vegetativo: Se desenvolve no interior do substrato: Função = sustentação e absorção de nutrientes. MICÉLIO AÉREO MICÉLIO VEGETATIVO TERMOS EMPREGADOS EM MICOLOGIA Hifa septada = com septos ou divisões Hifa cenocítica ou asseptada = hifa sem septos ou hifa contínua. 6

7 TERMOS EMPREGADOS EM MICOLOGIA Hialino = que não tem cor, claro, translúcido, assumindo a cor do corante utilizado. Demácio, demaciáceo ou feo = fungos negros que têm pigmento melanóide (acastanhado), na parede celular. TERMOS EMPREGADOS EM MICOLOGIA Hifas septadas ou tabicadas: Ascomycota, Basidiomycota e Chytridiomycota Hifas asseptadas ou cenocíticas: Zygomycota 7

8 MULTIPLICAÇÃO FÚNGICA I. Sexuada ou teleomorfa (zigoto) REPRODUÇÃO II. Assexuada - anamorfa (mitose) Conidiogênese Ambos FUNGOS ANAMÓRFICOS A reprodução assexuada (anamorfa) abrange quatro modalidades: 1) Fragmentação de artroconídios 2) Fissão de células somáticas 3) Brotamento ou gemulação do blastoconídios-mãe 4) Produção de conídios 8

9 CONIDIOGÊNESE Fungos filamentosos anamórficos (assexuados) são caracterizados por possuírem as estruturas: Conidióforos: hifas que sustentam células conidiogênicas e conídios Células conidiogênicas dão origem aos conídios (fiálides e células aneladas) Conídios (estruturas assexuadas de reprodução) têm como função a dispersão e a perpetuação das espécies sendo de grande importância ecológica e taxonômica. As células conidiogênicas recebem diferentes nomes: Fiálides (garrafa) Células aneladas (forma de colar ou anéis). FIÁLIDE 9

10 Conídios podem apresentar tamanhos, formação, cores e septos diferentes (macroconídios, microconídios, etc.). IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS Observação macroscópica I) A velocidade de crescimento: Rápida (< 7 dias), Intermediária (8 a 14 dias) Lenta (> 15 dias) II) A análise da colônia: Cor Textura Superfície Pigmento As colônias filamentosas podem ser algodonosas, aveludadas ou pulverulentas. 10

11 IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS Observação microscópica Observar estruturas microscópicas como: HIFA Hialina ou demácia Septada ou cenocítica Forma CONÍDIOS (ESPOROS) Disposição Forma FUNGOS ANEMÓFILOS DE HIFAS HIALINAS E SEPTADAS 11

12 FUNGO ANEMÓFILO (do ar) DE HIFAS SEPTADAS E DEMÁCIO: Cladosporium spp. FUNGO ANEMÓFILO (do ar) DE HIFAS HIALINAS E CENOCÍTICAS (ZIGOMICETOS) LEVEDURAS 12

13 LEVEDURAS São unicelulares e se reproduzem por gemulação ou bipartição. O aspecto macroscópico das colônias de leveduras são: Brilhantes/opacas; Pastosas/ cremosas; Aparência de leite condensado ou nata de leite ; Coloração branca, bege até laranja. TERMOS EMPREGADOS EM MICOLOGIA Levedura = fungo unicelular que se reproduz geralmente por brotamento. Brotamento ou gemulação = reprodução com divisão de citoplasma através de estrangulamento. Blastosporo, blastoconídio ou gêmula = esporos formados por brotamento ou gemulação. Clamidósporo = estruturas de resistência e reserva nutritiva com membrana espessa, permitindo resistir aos fatores externos. 13

14 Pseudo-hifa: aglomerados de blastoconídios prolongados e ligados entre si, lembrando o aspecto de hifa. Pseudo-hifas formam pseudo-micélios. Artrósporo ou artroconídio = esporo formado pela desarticulação da hifa de fungos filamentosos ou leveduras. DIMORFISMO Fungo dimórfico = um mesmo fungo que apresenta duas formas (reversíveis): leveduriforme e filamentosa. O mesmo fungo se apresenta como micélio (22 e 28 C) e como levedura (35 C e 37 C). M L A fase micelial (M) ou saprofítica é a forma infectante e está presente no solo, nas plantas etc. A fase leveduriforme (L ou Y) ou parasitária é encontrada nos tecidos. 14

15 Esporotricose...Sporothrix schenckii FUNGOS DIMÓRFICOS Paracoccidioidomicose...Paracoccidioides brasiliensis Histoplasmose...Histoplasma capsulatum Sporothrix schenckii MEIOS DE CULTURA INCUBAÇÃO DE FUNGOS 15

16 MEIOS DE CULTURA Os meios de cultura utilizados para o isolamento primário de fungos, de amostras biológicas, podem ser adquiridos no comércio, sob a forma desidratada. Após a hidratação, conforme instruções do fabricante, o meio deve ser distribuído em tubos e esterilizados por autoclavação (121 ºC por 15 minutos a 1 atm.). MEIOS NÃO SELETIVOS Isolamento primários de todos os fungos em amostras clínicas: Meio não seletivo (crescimento de todas as espécies de fungos): Ágar infusão cérebro-coração (BHI). Ágar Batata dextrose (ABD ou PDA) Ágar Sabouraud-dextrose (ASD) com BHI (ASBHI). 16

17 MEIOS NÃO SELETIVOS Ágar Czapeck pode ser utilizado para cultura de Aspergillus spp. (morfologia da colônia na identificação do isolado). Para evitar mofos ambientais (de crescimento rápido) contaminantes, colocar no meio a ciclo-heximida em concentração de 0,5 µg/ml. OBS- Aspergillus fumigatus e Cryptococcus neoformans podem ser inibidos pela ciclo-heximida, por isso é importante usar simultaneamente um meio não seletivo. MEIOS NÃO SELETIVOS O meio básico (ASD) é associado a um antibiótico para impedir o crescimento de bactérias que poderiam prejudicar o isolamento de fungos. Em meios mais seletivos (inibição de bactérias contaminantes) incorporar antibióticos: Penicilina (20 U/mL); Estreptomicina (40U/mL); Gentamicina (5 µg/ml) Cloranfenicol (16 µg/ml). O cloranfenicol é o mais indicado, pois resiste à autoclavação. Pode ser colocado tanto no ASD como em outros meios de cultura para fungos. 17

18 MEIOS SELETIVOS Meios ditos seletivos como Mycosel, para fungos patogênicos, contém cicloheximida que inibe parcialmente, ou totalmente, fungos anemófilos (do ar). Estes meios são indicados para cultivo com suspeita de dermatofitose, para aumentar a sensibilidade no isolamento de dermatófitos. A cicloheximida poderá inibir fungos oportunistas (Aspergillus spp., e certas leveduras como Candida e Cryptococcus). ágar Niger MEIOS SELETIVOS Fungos dimórficos necessitam de meios exigentes para isolamento primário (H. capsulatum) como SABHI ou BHI com ciclo-heximida e cloranfenicol. Às vezes recomenda-se a adição de sangue de carneiro (5 a 10%) para H. capsulatum. Depois de isolado, repicar em tubos com ABD ou ASD, para caracterizar a esporulação e característica da colônia. 18

19 MEIOS SELETIVOS PRESUNTIVOS Existem meios presuntivos (indicam presença de certos grupos ou gêneros). Ágar niger: contém compostos fenólicos para isolamento de Cryptococcus spp. ágar Niger Ágar especial para dermatófitos (Dermatophyte Test Medium ou DTM). DTM MEIOS SELETIVOS PRESUNTIVOS Existem ainda, meios presuntivos, por reação enzimática e colorimétrica, de espécies de Candida spp. São meios mais caros com maior aplicação no isolamento primário de leveduras, a partir de amostras biológicas muito contaminadas (secreção vaginal, fezes e urina). A identificação, no entanto, é feita somente, após análise morfológica e fisiológica das leveduras. 19

20 Chromagar C. albicans C.glabrata C. tropicalis C. krusei PROCEDIMENTOS PARA CULTURA Os materiais devem ser semeados na superfície dos meios de cultura (alça de níquel-cromo ou pipeta Pasteur) com movimentos em estrias em zig-zag, para permitir separação de eventuais contaminantes da amostra. O material não deve ser colocado em profundidade no ágar, mas apenas aderido à superfície do meio. 20

21 PROCEDIMENTOS PARA CULTURA Exames macroscópicos diários da superfície da fase sólida são indicados para verificar aparecimento de colônias de: Leveduras dos gêneros Candida spp., Cryptococcus spp. e outros (24 h-7 dias); Fungos filamentosos e Sporothrix schenckii (2 a 15 d); Fungos dimórficos, como: Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatum (15 a 30d). Qualquer colônia de fungo deve ser repicada em ASD, para posterior identificação. O crescimento de fungos, ao contrário de bactérias, não resulta em turvação imediata em meio líquido. SUB-CULTIVO OU REPIQUES Para isolamento ou subcultivo de dermatófitos recomenda-se o ágar batata (ABD ou PDA), para aumentar a esporulação e facilitar a identificação do gênero e espécie do fungo. Para fungos dimórficos, de crescimento lento (> 15 dias), recomendase o uso de meios enriquecidos como o ágar infusão de cérebrocoração (BHI). Pode ser acrescido de 5 a 10% de sangue de carneiro e de antibióticos. 21

22 INCUBAÇÃO DAS CULTURAS De modo geral, as culturas de fungos devem ser incubadas a 30 C (alguns filamentosos 25 C) Fungos dimórficos são incubados em duas temperaturas para a prova da reversão: 25 C = bolores e a 37 C = leveduras. Existem fungos de crescimento rápido (3 a 5 dias), mas em micologia médica, os fungos devem ser incubados por 30 dias. O H. capsulatum, por exemplo, podem ser observados crescendo na superfície de colônias de C. albicans ou em cima de mofos contaminantes. Após a inoculação do meio, se o tubo é fechado com tampa tipo rosca, não fechar muito fortemente, pois o fungo respira. IDENTIFICAÇÃO PRESUNTIVA DE FUNGOS A observação em placa revela várias características da colônia e informa qual gênero o fungo pertence. Observar o aspecto do micélio aéreo. Bolores que crescem em 3-5 dias apresentam margens distintas com superfície clara (branca ou pastel) pertencem ao grupo hialino (claros), oriundo de raspados de pele, fragmentos de unha ou pêlos (dermatófitos). Bolores dematiáceos (demáceos) surgem como colônias ou micélios cinza escuro a pretos. 22

23 No sangue, leveduras do gênero Candida não formam pseudohifas e a identificação de gênero e espécie é possível somente, após isolamento em meio de cultura. Fungos saprófitas que podem se tornar oportunistas (Aspergillus, Fusarium, Acremonium) a identificação só é possível pela cultura. Fusarium spp. Acremonium spp. Aspergillus flavus Aspergillus niger 23

24 Fungos de crescimento lento (7 a 14 dias) com micélio cinza ou cinza-escuro pode ser pertencente aos dimórficos (25ºC). Se o aspecto for de superfície lisa, cremosa, viscosa ou pastosa (leite condensado) considera-se leveduras (37ºC). A identificação final do gênero/espécie ocorre na observação microscópica (após a análise macroscoscópica). Ao preparar uma lâmina, observar : Presença de hifas Septadas ou cenocíticas Ramificadas ou não Pigmentadas ou não Largura igual ou desigual Artroconídios ou pseudo-hifas Determinar a estrutura e derivação dos corpos de frutificação Tipo de conídios Tamanho e formato dos esporos ou conídios Formato e a disposição dos esporos/conídios 24

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26 COLETA E TRANSPORTE DE AMOSTRAS O tipo e a qualidade da amostra biológica são fatores importantes no sucesso do isolamento e identificação do verdadeiro agente etiológico de infecções fúngicas. A amostra deve ser submetida ao exame microscópico direto e cultura em meios para isolamento e identificação acurada do agente etiológico. Por isso, a assepsia na coleta e o volume da amostra são fatores básicos para o sucesso do diagnóstico da infecção. 26

27 RECOMENDAÇÕES GERAIS DE COLETA E TRANSPORTE DE AMOSTRAS O paciente deve suspender o uso de qualquer medicamento antifúngico oral por 20 (vinte) dias ou tópico por pelo menos 10 (dez) dias precedentes a coleta. Coletar a amostra biológica com assepsia e colocá-la em recipiente estéril e vedado, sempre em quantidade suficiente (>2 ml ou 0,5 cm 3 ) para todos os procedimentos laboratoriais. Os swabs usados para coleta de material devem ser colocados em tubos contendo salina estéril para o transporte (evitar a dessecação da amostra). A amostra deve ser identificada (nome do paciente, número de registro hospitalar, tipo de amostra e data da coleta). A requisição médica deve conter as hipóteses diagnósticas que auxiliarão o micologista na escolha da coloração e do meio de cultura mais adequado para o isolamento do agente etiológico. RECOMENDAÇÕES GERAIS DE COLETA E TRANSPORTE DE AMOSTRAS Coletar amostras antes do início da terapia e em casos de lesões cutâneas de pele e unhas, orientar o paciente para evitar uso de medicação tópica por 4 a 5 dias antes da coleta de escamas. 27

28 Em pacientes imunodeprimidos ou muito debilitados coletar o mesmo tipo de amostra biológica em 2 ou 3 dias consecutivos. Fungos saprófitas, ou seja, contaminantes do meio ambiente ou mesmo da microbiota normal do paciente, podem se tornar oportunistas e comportarem-se como patógenos. Os materiais contaminados (urina, fezes, secreções de feridas ou trato respiratório), devem ser enviados, sob gelo, ao laboratório, o mais rápido possível (<2 h). Líquor e líquidos cavitários devem ser mantidos à temperatura ambiente e encaminhados com urgência ao laboratório para processamento imediato. Sangue e material de punção de medula óssea são os únicos materiais biológicos que devem ser semeados diretamente, em frascos contendo meio de cultura líquido ou bifásico (líquido sobre sólido), de modo a evitar coagulação e consequente diminuição da sensibilidade do exame. Meio bifásico deve ser incubado em agitação (para aeração). 28

29 PROCEDIMENTOS PARA COLETA DE AMOSTRAS Escarro: Recolher, de preferência, a primeira expectoração da manhã, após gargarejo com água limpa ou fervida, em frasco de boca larga, esterilizado. Não deve conter saliva. Aspirado gástrico: Aspirar cerca de 5 a 10 ml de suco gástrico, através de sonda nasogástrica, pela manhã, em jejum. Aspirado traqueal, lavado bronoco alveolar (BAL) e secreção obtida por broncoscopia: Procedimento realizado por médico treinado: BAL 50 a 200 ml. O material colhido deve ser colocado em recipiente estéril. Sangue e aspirado de medula óssea: Fazer assepsia e coletar cerca de 5 a 6 ml, que deverá ser injetado em frasco contendo meio de cultura. Uma gota deve ser distendida em uma lâmina de microscopia, para coloração de Giemsa. Urina: Mais apropriado obter por sondagem. Limpeza prévia, desprezar o primeiro jato de urina da manhã, e colher 3 a 5 ml em frasco estéril. Coleções de 24 horas, não têm valor para diagnóstico micológico. Líquor: Coletar 2 ml ou mais, para exame microscópico e cultura para fungos. Melhor coletar em tubos específicos em caso de diferentes exames. Tecido obtido por biópsia, necrópsia e peças operatórias: Colher assepticamente e colocar o material em recipiente estéril, com salina. Não adicionar nenhum líquido fixador. 29

30 Fezes: Limpeza prévia da região anal, coletar porções de fezes em recipiente estéril com tampa. A mesma pode ser dissolvida em solução fisiológica estéril. Solicitar 3 amostras de fezes em dias diferentes. As amostras de fezes têm validade de até 2 horas após a coleta a temperatura ambiente, para serem processadas o mais rápido possível. Swab anal em salina estéril e enviar o tubo ao laboratório. Secreção ou pele de conduto auditivo externo: Colher material por curetagem da lesão ou com swab estéril. Mergulhar o swab em salina estéril e enviar o tubo ao laboratório. As infecções fúngicas de ouvido são geralmente secas Material de micose ocular: Requer raspado de córnea, aspiração de líquido intra-ocular ou biópsia. A coleta com auxílio de swab não é indicada em local de drenagem. Lesão de nariz e seios paranasais: Coletar secreção, material necrótico ou tecido obtido por biópsia em recipiente estéril. 30

31 Mucosa oral e orofaringe: Coletar com swab (*) estéril o material de lesão de mucosa jugal, papilas linguais ou região tonsilar. Secreção vaginal: Coletar material da lesão ou do fundo da mucosa vaginal com swab (*) estéril. (*) Mergulhar o swab umedecido em salina estéril e enviar o tubo ao laboratório. Liquídos corporais (pleural, ascítico, pericárdico, sinovial): Coletar cerca de 5 a 10mL de líquido em tubo de ensaio estéril. Abscessos fechados = aspiração com seringa e agulha estéril. Abertos, limpar com gaze úmida esterilizada. Colher o material com swab. Pele e pêlos: Descontaminar com álcool 70% antes da coleta. Raspar com lâmina de bisturi as escamas cutâneas da borda das lesões. Os pêlos devem ser retirados com pinça estéril. Colocar o material entre duas lâminas limpas (esterilizadas), vedando-se as bordas com fita adesiva para evitar perda do material. 31

32 Unhas: Fazer limpeza prévia das unhas, escovando com água e sabão. Para exame de escamas ungueais, deve-se retirar totalmente o esmalte pelo menos 2 (dois) dias antes da coleta. Cortar com tesoura e desprezar a parte descolada da unha e, com lâmina de bisturi, raspar as áreas mais profundas e pulverulentas. Colocar este material entre lâminas e vedá-las com fita adesiva. EXAME MICROSCÓPICO DE AMOSTRAS CLÍNICAS A observação de um fungo na amostra biológica tem grande valor diagnóstico (padrão ouro) pois demonstra a invasão do fungo no tecido e permite uma informação imediata ao médico (terapia apropriada ao paciente). Se a quantidade da amostra for insuficiente para o exame microscópico e cultura do material, a cultura tem prioridade sobre o exame microscópico (específico e mais sensível). 32

33 EXAME MICROSCÓPICO DIRETO COM HIDRÓXIDO DE POTÁSSIO KOH 10 ou 20% É usado para exame de pelos, pele, unha, tecido obtido por biópsia, exsudatos espessos e outros materiais densos. Em uma lâmina colocar uma gota de KOH (aquoso a 10 ou 20%) com uma porção da amostra a ser examinada. Cobrir com uma lamínula e aquecer ligeiramente (clarificar) sobre a chama de um bico de Bunsen, sem deixar ferver a mistura. Examinar a preparação após 20 minutos, em microscópio óptico comum (objetiva de 10x e 40x). PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS Pelos, cabelos, escamas de unha e pele devem ser aliquotadas (dividir em duas porções) para exame microscópico e cultura, respectivamente. Para exame são clarificadas com solução aquosa de KOH e, para cultura, não podem sofrer nenhum tratamento prévio, sendo por isso, inoculadas diretamente na superfície do meio de cultura. KOH 20% Meio de cultura 33

34 EXAME MICROSCÓPICO DIRETO COM TINTA NANQUIM (TINTA DA CHINA) Utilizada em amostras de líquor, urina, secreções ou exsudatos, para visualização de leveduras capsuladas do gênero Cryptococcus (mais evidentes contra o fundo negro). Colocar uma gota de tinta nanquim e uma gota do sedimento da amostra centrifugada, sobre uma lâmina. Cobrir a preparação com lamínula e observar ao microscópio óptico (objetivas de 10x e 40 x). Cryptococcus spp.: leveduras rodeadas de halo transparente (cápsula polissacarídica), sobre fundo negro formado pela tinta nanquim Microscopia com coloração panótica (Giemsa, leishman ou Wright) Estas colorações são usadas para pesquisa de Histoplasma capsulatum em diversas amostras biológicas: Medula óssea, Sangue, Aspirados Secreção cutânea. Faz-se um esfregaço (semelhante ao Gram). Fixa-se com metanol e cora-se segundo o método escolhido. Podem ser usadas ainda, para corar imprints de tecidos obtidos por biópsia. 34

35 Líquor, secreções e fluídos corporais (líquido pleural, ascítico, sinovial, pericárdico, aspirado transtraqueal, lavado gástrico e broncoalveolar [BAL]) devem ser concentrados por centrifugação (1500 a 2000 rpm por 10 minutos). Os materiais coletados com swabs devem ser centrifugados. O sedimento obtido é o material adequado para o exame microscópico e semeadura em meios de cultura. Para urina, é recomendável que uma alíquota (alça calibrada) seja semeada, por esgotamento, sobre o meio de cultura distribuído em placa de Petri, para exame quantitativo, pela contagem de unidades formadoras de colônias (UFC). A outra alíquota deve ser centrifugada (1500 a 2000 rpm por 10 minutos) e o sedimento será utilizado para exame microscópico e nova semeadura em tubo (cultura qualitativa). 35

36 Escarro: pode ser digerido com enzima (v/v) N-acetil-L-cisteina que fluidifica e facilita a manipulação da amostra e formação de sedimento após centrifugação. Não foi comprovado que esse tratamento melhore a recuperação de fungos (opcional). Pode-se utilizar, como alternativa, para digestão da amostra, solução de KOH 20%. Melhor a porção purulenta da amostra (liqüefeitas não são adequadas para isolamento do agente). A porção da amostra tratada com KOH, porém, só pode ser usada para exame microscopia. Neste caso, outra porção da amostra deve ser centrifugada e o sedimento usado para cultura. Tecidos obtidos por biópsia requerem fragmentação, com o auxílio de um bisturi estéril ou maceração (gânglio) com pistilo em almofariz; pode ser feito dentro de uma placa de Petri estéril. Esse procedimento visa aumentar a área de superfície e expor o microrganismo ligado ao tecido, ao maior contato com o meio de cultura. 36

37 Sangue e aspirado de medula óssea: exame microscópico tem baixa sensibilidade não necessitam preparação. Cultura é mais importante para a identificação. Semear após a coleta, em frascos contendo meio de cultura (5 a 6 ml). O meio pode ser bifásico (15 ml de ágar inclinado sob 50 ml de caldo) em BHI ou Sabouraud. Não devem ser coletados em seringas contendo EDTA, pois esta substância se combina com elementos da parede dos fungos. AMOSTRA BIOLÓGICA PROCESSAMENTO EXAME MICROSCÓPICO Secreção respiratória Líquor Urina** Fluídos corporais (pleural, ascítico, sinovial, pericárdico, gástrico, brônquico) Pus e secreções de abscessos swab embebido em salina (mucosa oral, nasal, vaginal, anal, olhos, conduto auditivo) - Fluidificação (recomendada) - Centrifugação - Uso do sedimento - Centrifugação - Uso de sedimento - Centrifugação - Uso de sedimento - Centrifugação - Uso de sedimento - a fresco - KOH a 20% - Giemsa - Tinta nanquim - Tinta nanquim - Gram - a fresco - Gram - KOH a 20% - Giemsa - Nenhum - KOH a 20% - Giemsa - Centrifugação - Uso de sedimento MEIO DE CULTURA* - ASD - BHI - ASD - ASD - ASD - BHI - ASD - BHI - Gram - ASD 37

38 AMOSTRA BIOLÓGICA PROCESSAMENTO EXAME MICROSCÓPICO MEIO DE CULTURA* Pele, pelos e escamas - Nenhum - KOH a 20% - ASD Tecidos e peças Sangue e medula óssea - Fragmentação ou maceração - Imprint em lâmina - Semeadura em meio de cultura - Esfregaço ou distensão em lâmina - KOH a 20% - Giemsa - Tinta naquim - ASD e BHI - Giemsa - BHI bifásico ou líquido - ASD bifásico ou líquido * Todos os meios sólidos, para isolamento de fungos devem conter cloranfenicol. ** Para contagem de colônias (UFC/ml), semear 0,1 ml de urina em ASD distribuído em placa de Petri, antes de centrifugar. 38