A transmissão colinérgica no nervo frénico-diafragma do rato: modulação pré-sináptica.

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1 A transmissão colinérgica no nervo frénico-diafragma do rato: modulação pré-sináptica. Alves, R., Moreira, R., Rocha, C. Departamento de Farmacologia, Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, Portugal, 2002 O objectivo do nosso trabalho foi o estudo da transmissão colinérgica no nervo frénico-diafragma. Para tal, foram utilizados diferentes fármacos (tubocurarina, decametónio, eserina, atropina, pilocarpina, acetilcolina) sobre uma preparação sujeita a uma estimulação eléctrica de frequência contínua (0,13 Hz). Foi-nos permitido concluir que na junção neuromuscular existem, a nível pós-sináptico, receptores nicotínicos (NM), enquanto que a nível pré-sináptico se verifica a existência de ambos os receptores colinérgicos (nicotínicos e muscarínicos). Os nossos resultados levam-nos a crer que os receptores présinápticos são responsáveis por uma modulação da resposta, que pode ser do tipo inibitório (M2) ou facilitatório (M1 e NN). Introdução Na extremidade terminal do axónio motor, responsável pela enervação do músculo, encontramos vesículas sinápticas que contêm Acetilcolina (Ach). Quando é aplicado um impulso eléctrico no axónio motor dá-se uma despolarização da membrana nervosa e um consequente aumento da permeabilidade, da mesma, ao cálcio extracelular. Esta entrada de cálcio vai despoletar a fusão das vesículas de Ach com a membrana nervosa e consequente libertação de mediador na fenda sináptica. A Ach vai-se, então, ligar aos receptores existentes na membrana da célula motora, aumentando a permeabilidade desta aos iões sódio e potássio e desencadeando um potencial de acção, o que leva a uma contracção. (#31) A Tubocurarina (Tb) é um bloqueador selectivo para os receptores nicotínicos, que compete com a Ach para os mesmos. Este composto é, também, referido como sendo um bloqueador não despolarizante, o que significa que, ao ligar-se aos receptores nicotínicos, não ocorre qualquer estimulação dos mesmos (não há abertura dos canais iónicos) e, consequentemente, não há o risco de despolarização da fibra muscular. A Eserina (Ese) é um inibidor reversível das acetilcolinesterases (AchE), e a sua acção vai, portanto, permitir que haja um aumento de concentração de Ach na fenda, uma vez que esta não vai ser degradada. O Decametónio (Dec) é um bloqueador despolarizante selectivo para os receptores nicotínicos, tendo um efeito semelhante àquele que é produzido por um excesso de Ach; logo vamos ter os canais de sódio e potássio permanentemente abertos e, como resultado, uma interminável despolarização. A atropina (Atr) é um antagonista muscarínico que tem diferente afinidade para os subtipos de receptores existentes, consoante a concentração em que é utilizada A Pilocarpina (Pil) é um agonista parcial muscarínico, tendo, supostamente, uma maior afinidade para os receptores M2. (#2) Material Preparação: Frénico-diafragma de rato num banho de órgãos isolados, mergulhado em 50 ml de líquido nutritivo de Krebs, arejado com carbogénio (95% O2, 5% CO2). Sistema de registo: Quimógrafo/Alavanca de mola com inscrição lateral. Estimulador de ondas quadradas: condições de estimulação (frequência) reguladas em função da sensibilidade do fragmento. Micropipeta Fármacos

2 Tubocurarina Eserina Decametónio Atropina Pilocarpina Acetilcolina Protocolo experimental Trabalho 1 Período de estabilização da preparação (até o registo das contracções tenha uma amplitude uniforme). Adicionar 100 µl de tubocurarina. Depois de atingido o efeito máximo, adicionar 100 µl de eserina. Observar o efeito. Lavar a preparação e aguardar até que o registo retome a amplitude inicial. Adicionar 100 µl de decametónio. Adicionar 100 µl de eserina. Observar o efeito. Trabalho 2 Período de estabilização da preparação (até o registo das contracções ter uma amplitude uniforme) Adicionar volumes cumulativos (10 µl) de atropina (C=1 mg/ml). Observar o efeito. Lavar a preparação. Partindo de uma solução inicial de pilocarpina (C=367 µg/ml) preparar duas soluções diluídas, sendo uma 1:10 e outra 1: Adicionar volumes cumulativos (10 µl) partindo da solução mais diluída até à mais concentrada. Observar o efeito. Lavar a preparação. Período de estabilização da preparação (até o registo das contracções ter uma amplitude uniforme) Adicionar 100 µl de pilocarpina (C=367 µg/ml) Adicionar volumes cumulativos (100 µl) de atropina (1 mg/ml) Observar o efeito. Trabalho 3 Período de estabilização da preparação (até o registo das contracções ter uma amplitude uniforme) Partindo de uma solução inicial de acetilcolina (2mg/ml) preparar uma solução diluída de 1:100 Adicionar volumes cumulativos de 10 µl da acetilcolina preparada anteriormente. Observar o efeito. Lavar a preparação. Adicionar 300 µl de atropina 1mg/ml (em volumes de 100 µl e 200µl sucessivamente) Juntar doses cumulativas de acetilcolina 2 mg/ml nos seguintes volumes: 10, 10, 10, 100, 100, 200, 200, 200 µl. Adicionar 100µl de eserina. Juntar novamente 100µl de Atropina. Observar o efeito. Discussão Trabalho 1 A primeira parte do nosso trabalho consiste no estudo dos receptores pós-sinápticos colinérgicos, a nível da placa motora, na junção neuromuscular. Salientamos que neste primeiro estudo foram desprezados quaisquer contributos provenientes de uma possível modulação pré-sináptica.

3 % resp Controlo Tb Ese Lavagem Após a adição de Tb à preparação previamente estabilizada foi possível verificar um decréscimo de resposta contráctil até total ausência desta, efeito este que foi ligeiramente revertido pela adição de Ese à preparação. A que se deve isto? A Tb vai competir com a Ach para os receptores nicotínicos da placa motora (NM).Essa competição justifica-se com a diminuição gradual da contracção. Este composto, ao ligar-se aos receptores nicotínicos, não provoca qualquer estimulação dos mesmos e, consequentemente, não ocorre despolarização da fibra muscular. O facto da Tb estar a ocupar os receptores vai aumentar a probabilidade de degradação da Ach pelas colinesterases, diminuindo a possibilidade de haver competição, atingindo-se, então, um estado de ausência de contracção. O facto de a Tb ser selectiva para os receptores nicotínicos e conseguir inibir totalmente a contracção prova-nos que esta se deve, à partida, aos receptores nicotínicos; caso existissem receptores muscarínicos na placa motora, a resposta não desapareceria totalmente, podendo a Ach endógena, presente na fenda, mediar a contracção. A Ese actua sobre as colinesterases, inibindo-as, e vai, portanto, permitir que haja um aumento de concentração de Ach na fenda, uma vez que esta não vai ser degradada e está a ser continuamente libertada, por acção de estímulo eléctrico. Isto cria uma situação em que existem concentrações de Ach suficientemente elevadas para competir com a Tb para os receptores e, portanto, verificamos um ressurgimento da contracção, o que ajuda a provar o efeito não despolarizante da Tb. No entanto, essa contracção fica longe de atingir o máximo, já que estamos na presença de um antagonismo competitivo e de grande parte dos receptores estarem ainda ocupados por Tb. Desta vez, foi usado o Dec para bloquear os receptores nicotínicos da placa motora. Tal como com a Tb, também se verificou o desaparecimento total da contracção apesar da contínua estimulação. No entanto, a adição de Ese mostra-se incapaz de levar ao reaparecimento da contracção, ao contrário do caso analisado anteriormente. O Dec vai provocar uma interminável despolarização, o que não permite que um impulso seja gerado ao longo da fibra muscular e, portanto, não permite a contracção da mesma. A Ese, neste caso, não vai levar à obtenção de qualquer contracção, porque, apesar de provocar um aumento da concentração de Ach na fenda, esta é incapaz de activar os receptores no sentido de haver uma contracção, porque ocorreu uma dessensibilização dos mesmos. Deste estudo podemos inferir que os receptores nicotínicos envolvidos no processo de contracção são passíveis de serem dessensibilizados. Isto mostra-nos a necessidade do organismo possuir um mecanismo de regulação da resposta contráctil, possivelmente uma modulação pré-sináptica, que nos serve como base para os próximos estudos. Trabalho2 The results showed that atropine had a dual action at the neuromuscular junction; at low concentrations (0,001-1,0 microm) enhanced, whereas at high concentrations (greater than 1,0 microm) decreased the twitch, tetanic and post-tetanic twitch responses in the rat diaphragm preparation. (#22)

4 Adicionando concentrações crescentes de atropina verifica-se uma ligeira diminuição da resposta, o que seria de esperar tendo em conta a gama de concentrações usadas (superiores a 1,0 microm). Tendo em conta que anteriormente verificamos que não existiam receptores muscarínicos a nível póssináptico, somos levados a concluir que qualquer alteração que seja mediada por receptores muscarínicos se deve essencialmente a uma modulação pré-sináptica. Deste modo, sendo a atropina um antagonista muscarínico e como nas concentrações referidas se verifica uma diminuição da contracção, estaremos provavelmente a bloquear receptores do tipo facilitatório (M1). Considerando que a Pil é partial and putatively M2-selective agonist e que este subtipo de receptores muscarínicos medeia, neste caso concreto, uma modulação inibitória, esperaríamos, à partida, uma diminuição da resposta contráctil. Todavia, pela adição de doses crescentes de pilocarpina observa-se um aumento na amplitude da contracção, o que contradiz o referido anteriormente e nos permite deduzir que, afinal, a pilocarpina actuou nos receptores facilitatórios (M1). Outra explicação possível é a possibilidade de a Pil, em presença de altas quantidades de mediador endógeno, deixar de se comportar como um agonista parcial e passar a apresentar características de um antagonista. Desta forma, já poderá estar a actuar em receptores do tipo M2 bloqueando-os, o que justifica o aumento de contracção verificado. Trabalho 3 Quando colocamos Ach em concentrações não suficientes para causar dessensibilização dos receptores, verifica-se um ligeiro aumento da contracção, o qual pode ser explicado por uma maior acção por parte deste composto na placa motora, visto a concentração ser agora mais elevada do que a concentração controlo do mediador endógeno. No entanto, após a adição de mais Ach, até se atingir a concentração de 88 nm no banho, verificou-se uma ligeira diminuição na intensidade contráctil. Isto poderá resultar de uma modulação pré-sináptica do tipo inibitório devida a uma concentração de Ach suficiente para activar os receptores responsáveis por este efeito (M2) ou então poderá dever-se a um início de dessensibilização, já que as doses de Ach foram aumentando gradualmente. Na presença de Atr, verificou-se um aumento da intensidade de contracção após a adição de Ach, o que ocorre mais intensamente e com concentrações mais baixas do que o verificado para a adição de Ach sozinha. Visto a Atr bloquear os receptores muscarínicos (pré-sinápticos), a Ach vê-se incapacitada de actuar neles e, como tal, não há inibição na quantidade de Ach libertada pela estimulação eléctrica, ao contrário do que acontecia no caso anterior. No entanto, este aumento da contracção verificado com Ach na presença de Atr, é o mais significativo de todos; isto levar-nos-ia a pensar que, além do mecanismo inibitório estar comprometido, poderíamos estar na presença de outros receptores moduladores da libertação de Ach que não fossem bloqueados pela Atr, mas nos quais a Ach conseguisse actuar facilitando a libertação da Ach vesicular. Estes receptores teriam de ser, logicamente, do tipo nicotínico. Por este processo facilitatório e pela adição de Ach, esta passa a estar em concentração suficiente para competir com a Atr, deslocando-a dos receptores muscarínicos. Deste modo, os receptores pré-sinápticos anteriormente ocupados vão poder novamente modular a resposta, provocando uma ligeira diminuição da contracção que se deverá em princípio à maior afinidade que, possivelmente, a Ach poderá ter para se ligar aos receptores M2. É importante notar, que todos estes resultados poderão estar influenciados por uma certa dessensibilização dos receptores, tendo em conta as condições do trabalho. Ao trabalharmos com contracções de controlo já próximas da máxima, todas as variações verificadas serão pouco significativas e esclarecedoras, dando respostas pouco fiáveis, que poderão ser consideradas como artefactos. Para além disso, também há que considerar a existência de co-transmissão, em que há a libertação de outros mediadores endógenos das vesículas colinérgicas, tais como, ATP e VIP, que poderão influenciar estas

5 respostas obtidas. Também há indícios de uma possível acção por parte da 5-HT, em determinadas condições e que poderão influenciar a transmissão nervosa na placa motora. (#24) Diversos estudos referem a existência de variados tipos de receptores pré-sinápticos, tanto facilitatórios (nicotinícos, muscarínicos, α1, β1, A2a, etc.), com o intuito de promover um aumento de Ach libertada de forma a haver uma rápida e máxima activação dos músculos esqueléticos, como inibitórios (muscarínicos, α2, β, receptores para o NO, P1), que têm como objectivo limitar a quantidade de Ach libertada de forma a prevenir uma estimulação exarcebada das células efectoras. (#14) Conclusão Com a realização deste trabalho, verificámos que, no nervo frénico-diafragma, existem receptores nicotínicos (NM), que se situam a nível pós-sináptico e são responsáveis pela contracção. Estes receptores são susceptíveis de sofrerem uma dessensibilização. Durante o processo contráctil, a Ach libertada pode automodular-se, quer por mecanismos inibitórios (M2), quer por mecanismos facilitatórios (M1 e NN); estes receptores estão presentes a nível pré-sináptico. Referências Bibliográficas VIZI, E. S., SOMOGYI, G. T. (1989). Prejunctional modulation of acetylcholine release from the skeletal neuromuscular junction: link between positive (nicotinic)- and negative (muscarinic)- feedback modulation. Br. J. Pharmacol., 97, TEN BERGE, R. E., WEENING, E. C., ROFFEL, A. F., ZAAGSMA, J. (1996). Differences in the prejunctional effects of methacoline and pilocarpine on the release of endogenous acetylcholine from guinea-pig trachea. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol, 354, URAZAEV, A., NAUMENKO, N., MALOMOUGH, A., NIKOLSKY, E., VYSKOCIL, F. (2000). Carbachol and acetylcholine delay the early postdenervation depolarization of muscle fibers through M1-cholinergic receptors. Neuroscie. Res., 37, HAGGBLAD, J., HEILBRONN, E. (1983). 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