Departamento de Ciência doa Alimentos, Universidade Federal de Lavras

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1 COMPORTAMENTO DINÂMICO DA SACCHAROMYCES CEREVISIAE, PICHIA KLUYVERI AND HANSENIASPORA UVARUM DURANTE A FERMENTAÇÃO ESPONTÂNEA E INOCULADA E SEUS EFEITOS NAS CARACTERÍSTICAS SENSORIAIS DO CHOCOLATE NÁDIA NARA BATISTA 1, CÍNTIA LACERDA RAMOS 2, DISNEY DIAS RIBEIRO 3, ANA CARLA MARQUES PINHEIRO 4, ROSANE FREITAS SCHWAN 5 2,5 Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras 1,3,4 Departamento de Ciência doa Alimentos, Universidade Federal de Lavras RESUMO: O chocolate é elaborado a partir do cacau fermentado e seco. O objetivo foi avaliar o impacto da inoculação de Saccharomyces cerevisiae, Pichia kluyveri e Hanseniaspora uvarum nos parâmetros químicos e no perfil sensorial do chocolate. S. cerevisiae foi dominante em ambas as fermentações. H. uvarum parece ter sido inibida pelas demais leveduras inoculada. Na fermentação inoculada os carboidratos foram consumidos rapidamente e a concentração de etanol foi mais alta. A dinâmica das leveduras foi avaliada por qpcr sendo que a inoculação acelerou o processo fermentativo. Não houve diferença significativa de aceitação entre os chocolates (p<0,5), porém, diferenças em relação aos atributos sensoriais foram perceptíveis. A inoculação de S. cerevisiae e P. kluyveri contribuiu com o sabor café, ácido e amargo do chocolate. Palavra-chave: fermentação do cacau, cultura iniciadora, qpcr, análise sensorial INTRODUÇÃO Os grãos de cacau (Theobroma cacao L.) é a principal matéria prima na elaboração do chocolate. O processo fermentativo é essencial para o desenvolvimento dos precursores do sabor/aroma de chocolate (FOWLER, 2009; THOMPSON et al., 2013), consistindo em uma sucessão de microrganismos que é inicialmente dominada pelas leveduras e, posteriormente, pelas bactérias do ácido lático (BAL), bactérias do ácido acético e bacilos (ARDHANA; FLEET, 2003; GARCIA-ARMISEN et al., 2010; LIMA et al., 2011; SCHWAN; WHEALS, 2004). Segundo Ho, Zhao e Fleet (2014), o crescimento e a atividade metabólica das leveduras são essenciais para a fermentação do cacau e no desenvolvimento das sabor/aroma de chocolate. Saccharomyces, Hanseniaspora (anamorph Kloeckera) e Pichia têm sido reportadas como gêneros dominantes durante a fermentação do cacau (DANIEL; MEYER, 2009; JESPERSEN et al., 2005; MOREIRA et al., 2013; NIELSEN et al., 2005; NIELSEN et al., 2007; PEREIRA et al., 2012). O uso de culturas iniciadoras para controlar o processo fermentativo com intuito de melhorar a qualidade do cacau fermentado tem sido proposto por alguns pesquisadores (CRAFACK et al. 2013; LEAL et al., 2008; LEFEBER et al., 2012; SCHWAN, 1998). O objetivo deste trabalho foi inocular três leveduras (S. cerevisiae, H. uvarum and P. kluyveri) durante a fermentação do cacau e avaliar o comportamento dinâmico através da técnica qpcr. Além disso, o efeito desta inoculação na qualidade sensorial do chocolate, bem como, os parâmetros químicos (carboidrato, etanol e ácidos orgânicos) durante a fermentação. MATERIAL E MÉTODOS Fermentação e amostragem

2 O experimento foi conduzido na Fazenda Vale do Juliana, Igrapiúna, Bahia, Brasil. Os frutos maduros do híbrido PS1319 foram colhidos em novembro de 2013, sendo abertos manualmente e conduzidos à casa de fermentação. A fermentação foi realizada em caixas de madeira de 0.06 m 3 contendo, aproximadamente, 100 kg de cacau. As fermentações foram conduzidas espontâneamente (controle) e com a adição de cultura iniciadoras contendo Hanseniaspora uvarium (CCMA 0236) e Pichia kluyveri (CCMA 0237) na concentração de 10 5 e Saccharomyces cerevisiae CCMA 0200, armazenada na forma liofilizada (LNF- CA11, LNF Latino America, Bento Gonçalves, Rio Grande do Sul, Brasil) na concentração de 10 7, inoculadas no início do processo fermentativo. A biomassa de cada levedura foi ressuspendida em 1L de água peptonada (0,1%) estéril, sendo inoculado no cacau até atingir uma concentração de 10 5 cel/g de cacau. As fermentações foram avaliadas durante 168 horas, sendo coletados 100 g de amostra a cada 24 horas. As coletas foram realizadas, aproximadamente, a 40 cm da superfície em direção ao centro do fermentador, sendo estocadas a -20 C até a realização dos testes. Extração de DNA e reação de qpcr O DNA total da polpa de cacau foi extraído utilizando o QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) de acordo com as instruções do fabricante. Os primers específicos para S. cerevisiae, P. kluyveri e H. uvarum foram previamente descrito por Díaz, et al. (2013). A especificidade do par de primer foi confirmado no GenBank usando BLAST ( /BLAST/). qpcr foi conduzido utilizando Rotor-Gene Q System (Quiagen, Hombrechtikon, ZH, Switzerland). A curva padrão foi realizada cultivando as espécies em YEPG a 30 C por 24h. As células foram contadas usando a câmara de Neubauerg. O DNA foi extraído utilizando QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) e submetidos a diluição seriada (1:10) de para 10 cel/ml. Cada ponto da curva de calibração foi mensurado em triplicata. Análise de carboidrato, álcool e ácidos orgânicos Os carboidratos (glicose e frutose), ácidos orgânicos (acético, lático e ácido cítrico) e álcool (etanol) da polpa e da amêndoa foram extraídos e analisados em cromatografia liquida de alta eficiência (Shimadzu, model LC-10Ai, Shimadzu Corp., Japan) equipado com dois sistemas de detecção consistindo do detector de UV-VIS (SPD 10Ai) e do detector de índice de refração(rid-10ai). A coluna de exclusão iônica Shimadzu (Shim-pack SCR-101H, 7.9 mm 30 cm) foi operada a 30 C para carboidratos e álcool e a 50 C para ácido. O ácido perclórico foi utilizado como eluente a 0,6 ml/min. As amostras foram analisadas em triplicata e os componentes foram identificados com base no tempo de retenção dos padrões injetados nas mesmas condições. Análise sensorial do chocolate O teste de aceitação seguido do teste a check-all-that-apply (CATA) foi realizado nos dois tipos de chocolate (controle e na fermentação inoculada). O teste foi conduzido com 51 adultos acima de 18 anos. No teste de aceitação os consumidores avaliaram as amostras de acordo com a escala hedônica estruturada com 9 pontos. No teste CATA os provadores avaliaram sete atributos sensoriais e selecionaram aqueles que consideraram mais apropriados para descrever as amostras de chocolate. Os atributos avaliados foram ácido, frutado, amargo, adstringente, café, cacau e doce. A análise sensorial foi conduzida no laboratório de Ánalise Sensorial, do departamento de Ciência dos Alimentos, na Universidade Federal de Lavras. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3 A dinâmica das três leveduras (S. cerevisiae, H. uvarum and P. kluyeri) e suas influências durante o processo fermentativo e nas características sensoriais dos chocolates foi investigada neste trabalho. S. cerevisiae, P. kluyveri e H. uvarum foram detectadas e quantificadas durante a fermentação controle e inoculada por qpcr. S. cerevisiae foi dominante em ambas as fermentações, no entanto, na fermentação controle a população foi menor (4,4 a 5,9 log cel/g) quando comparado à fermentação inoculada (6,7 a 7,9 log cel/g). A população de H. uvarum e P. kluyveri na fermentação controle foi de 3,4 a 4,5 log cel/g e 2,8 a 3,7 log cel/g, respectivamente. Em relação à fermentação inoculada, P. kluyveri apresentou população mais alta do que na fermentação controle (3,6 a 5,0 log cel/g) e H. uvarum apresentou concentrações similares (3,6 to 4.5 log cel/g) em ambas as fermentações. H. uvarum foi descrita como uma importante espécie de levedura associada com S. cerevisiae durante a fermentação de cacau no Brasil (MOREIRA et al., 2013; RAMOS et al., 2014). A dominância da P. kluyveri não tem sido relatada, no entanto, segundo Crafack et al. (2013) a inoculação de P. kluyveri durante o processo fermentativo do cacau influenciou positivamente no sabor/aroma de chocolate. Espécies pertencentes ao gênero Pichia, como Pichia kluyveri bem como S. cerevisiae tem sido relatada como produtoras de toxinas (BRANCO et al., 2014; MIDDELBEEK; STUMM; VOGELS, 1980; SANGORRÍN et al., 2008; SANTOS et al., 2000) que atuam contra outra leveduras como H. uvarum, que pode ter contribuído com a inibição do seu crescimento durante a fermentação do cacau. A concentração de glicose, frutose e ácido cítrico na polpa foram aproximadamente 25, 30 e 90 g/kg, respectivamente. O consumo destes compostos foi observado no tempo inicial da fermentação (70 h) e os carboidratos foram consumidos rapidamente na fermentação inoculada do que no controle. O ácido cítrico presente na polpa foi consumido, porém na amostra inoculada esses ácidos mostraram concentrações menores do que 1 g/kg somente com 72 h, enquanto que o controle essa concentração foi alcançada com 48h. Os carboidratos foram consumidos rapidamente provavelmente devido à alta população de S. cerevisiae na amostra inoculada do que no controle, acelerando o processo fermentativo como relatado por Ramos et al. (2014). A concentração de etanol na polpa foi maior na fermentação inoculada com leveduras alcançando picos de 8 g/kg de etanol com 48 a 72 h, comparado ao controle que mostrou concentração máxima de 4,6 g/kg com 96 h. A dominância da S. cerevisiae durante a fermentação inoculada, pode ter contribuído com a alta concentração de etanol. A concentração máxima de ácido acético foi similar em ambas às fermentações, sendo detectada com 144h na concentração de 2,5 g/kg para controle e 2,9/kg para inoculada. O etanol presente no meio é metabolizado a ácido acético, porém a alta temperatura do meio de fermentação, em torno de C, favorece a evaporação do etanol e não afeta na concentração do ácido acético no final do processo, resultados similares foram encontrados por Ramos et al. (2014). O ácido lático foi produzido no meio do processo fermentativo entre 48 e 72 horas com concentrações de 1,2 g/kg (controle) e 0.8 g/kg (inoculado) com 48 h. Nos grãos, a concentração de carboidratos (<2.7 g/kg) e ácido lático (< 0.2 g/kg) foi similar em ambos os experimentos. Dois picos de etanol foram observados. O primeiro pico ocorreu com 48h apresentando concentração de 7,6 e 6,9 g/kg para a fermentação controle e inoculada, respectivamente. O segundo pico foi observado com 120h (4,3 g/kg) na fermentação controle e com 96h (12.6 g/kg) para o inoculado. O ácido acético foi detectado no final da fermentação com 144h na concentração de 3,1 e 4.9 g/kg para controle e inoculada, respectivamente. Não houve diferença significativa (p<0,05) no teste de aceitação entre as amostras de chocolate. No teste CATA poucas diferenças foram notadas pelos provadores. Os chocolates produzidos espontaneamente apresentaram maior doçura, enquanto que os produzidos pela fermentação inoculada foram atribuídos ao sabor/aroma de café e ácido. A

4 quantidade, natureza e distribuição dos microrganismos presente na polpa de cacau determinarão a velocidade e intensidade da fermentação bem como a qualidade dos grãos fermentados e do chocolate (CAMU et al., 2008). CONCLUSÃO A inoculação de culturas iniciadoras acelerou o consumo de carboidratos e altas concentrações de etanol foram obtidas, além disso, produziu chocolate com sabor/aroma de café e ácido dominantes. Entretanto, estudos sobre os compostos voláteis produzidos pela fermentação e a diversidade microbiana são importantes para melhor entendimento do papel desses microrganismos durante a fermentação e dos chocolates elaborados a partir dessas amêndoas. REFERÊNCIAS ARDHANA, M.; FLEET, G. (2003). The microbial ecology of cocoa bean fermentations in Indonesia. International Journal of Food Microbiology v. 86, p , BRANCO, P. et al. Identification of novel GAPDH-derived antimicrobial peptides secreted by Saccharomyces cerevisiae and involved in wine microbial interactions. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 98, p , CAMU, N., et al. Fermentation of cocoa beans: influence of microbial activities and polyphenol concentrations on the flavor of chocolate. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 88, p , CRAFACK, M., et al. Influencing cocoa flavor using Pichia kluyveri and Kluyveromyces marxianus in a defined mixed starter culture for cocoa fermentation. International Journal of Food Microbiology,v. 167, p , CRAFACK, M. et al. (2013). Influencing cocoa flavor using Pichia kluyveri and Kluyveromyces marxianus in a defined mixed starter culture for cocoa fermentation. International Journal of Food Microbiology,v. 167, , DANIEL, H. -M.; MEYER, W. Evaluation of ribosomal and actin gene sequences for the identification of ascomycetous yeasts. International Journal of Food Microbiology, v.86, p , FOWLER, M. S. Cocoa beans: From the tree to factory. In S. T. Beckett (Ed.), Industrial Chocolate Manufacture and Use. Chichester: Blackwell Publishing Ltd, 2009, p GARCIA-ARMISEN, T., et al. Diversity of the total bacterial community associated with Ghanaian and Brazilian cocoa bean fermentation samples as revealed by a 16 S rrna gene clone library. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 87, p , HO, V. T. T.; ZHAO, J.; FLEET, G. Yeasts are essential for cocoa bean fermentation. International Journal of Food Microbiology, v. 174, p , JESPERSEN, L. et al. Occurrence and diversity of yeasts involved in fermentation of West African cocoa beans. FEMS Yeast Research,n. 5, p , LEAL JR, G. A. et al. Fermentation of cacao (Theobroma cacao L.) seeds with a hybrid Kluyveromyces marxianus strain improved product quality atributes. FEMS Yeast Research, n. 8, p , LEFEBER, T. et al. On-farm implementation of a starter culture for improved cocoa bean fermentation and its influence on the flavour of chocolates produced thereof. Food Microbiology, v. 30, p , LIMA, L. J. R. et al. Theobroma cacao L., The Food of the Gods : Quality Determinants of Commercial Cocoa Beans, with Particular Reference to the Impact of Fermentation. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v. 51, p , MIDDELBEEK, E. J.; STUMM, C.; VOGELS, G. D. Effects of Pichia kluyveri killer toxin on sensitive cells. Antonie van Leeuwenhoek, v. 46, p , 1980.

5 MOREIRA, I. M. V. et al. Microbial succession and the dynamics of metabolites and sugars during the fermentation of three different cocoa (Theobroma cacao L.) hybrids. Food Research International, v. 54, p. 9-17, MOREIRA, I. M. V. et al. Microbial succession and the dynamics of metabolites and sugars during the fermentation of three different cocoa (Theobroma cacao L.) hybrids. Food Research International, v. 54, p. 9-17, NIELSEN, D. S. et al. (2005). Yeast populations associated with Ghanaian cocoa fermentations analysed using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Yeast, v. 22, p , NIELSEN, D. S.(2007). The microbiology of Ghanaian cocoa fermentations analysed using culture dependent and culture independent methods. International Journal of Food Microbiology, v. 114, p , PEREIRA, G. V. M. Microbiological and physicochemical characterization of smallscale cocoa fermentations and screening of yeast and bacteria strains to develop a defined starter culture. Applied and Environmental Microbiology, v.78, p , RAMOS, C. L. Impact of different cocoa hybrids (Theobroma cacao L.) and S. cerevisiae UFLA CA11 inoculation on microbial communities and volatile compounds of cocoa fermentation. Food Research International, v. 64, p , SANGORRÍN, M. P. et al. Spoilage yeasts from Patagonian cellars: characterization and potential biocontrol based on killer interactions. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 24, p , SANTOS, A. et al. (1 6)-b-DGlucan as cell wall receptor for Pichia membranifaciens killer toxin. Applied and Environmental Microbiology, v. 66, p , SCHWAN, R. F. Cocoa fermentations conducted with a defined microbial cocktail inoculum. Applied and Environmental Microbiology, v. 64, p , SCHWAN, R. F.; WHEALS, A. E. (2004). The microbiology of cocoa fermentation and its role in chocolate quality. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v. 44, p , THOMPSON, S. S. et al. (2013). Cocoa and coffee. In. M. P. Doyle, & R. L. Buchanan (Eds.), Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. Washington: ASM Press, 2013, p. AGRADECIMENTOS Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico do Brasil (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro. Nádia Nara Batista nadia.nb@hotmail.com / ndianara.batista@gmail.com