TRANSFORMAÇÂO DE ALGODÃO (Gossypium hirsutum L.) ATRAVÉS DO USO DE POLICÁTION (*)

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1 TRANSFORMAÇÂO DE ALGODÃO (Gossypium hirsutum L.) ATRAVÉS DO USO DE POLICÁTION (*) Roseane Cavalcanti dos Santos (Embrapa Algodão / roseane@cnpa.embrapa.br), Lucilia H. Marcelino (Embrapa Cenargen), Glaucia Barbosa Cabral (Embrapa Cenargen), Eugen Silvano Gander (Embrapa Cenargen). RESUMO - O algodoeiro é amplamente estudado na área de engenharia genética objetivando melhoramento molecular via transformação. Embora vários trabalhos tenham sido descritos com esta cultura, a eficiência de transformação é variável e depende da espécie e ainda da cultivar utilizada. Neste trabalho descreve-se um protocolo de transformação desenvolvido por Sawahel (2001) e ajustado para G. hirsutum com poucas modificações baseadas, basicamente, na adição de hormônio (2-ip, 1 mg/ml) ao meio de indução e aumento nas concentrações de sacarose (3%) e do DNA plasmidial (50 µg/ml). Os testes de transformação foram analisados através da expressão de gus e de seleção com htpii. Vários calos transformados foram obtidos e confirmados através da expressão transiente de gus e de testes de PCR com htpii. O protocolo ajustado neste trabalho mostrou-se simples e eficiente, podendo ser perfeitamente utilizado pelos melhoristas em rotinas de transformação de algodão. Palavras-chave: algodão, cultura de tecido, indução de calos TRANSFORMATION OF Gossypium hirsutum L. BY USE OF POLYCATION ABSTRACT - Cotton is largely studied in genetic engineering area aiming molecular breeding by plant transformation. Despite of several papers have been described, transformation rate on cotton is variable and depends on the specie or even, the variety used. In this paper we reported a transformation protocol developed by Sawahel (2001) and adjusted to G. hirsutum with few modifications, basically based on addition of hormone (2-ip, 1 mg/ml) in the induction medium, and increasing of sucrose (3%) and DNA plasmidial (50 µg/ml) concentrations. Transformation tests was analyzed by gus expression and htpii selection assays. Several transformed callus were obtained and confirmed by transient gus expression and htpii-pcr analysis. The protocol adjusted in this work is simple and efficient and could be perfectly adopted do the breeders for cotton transformation routine. Key words: cotton, crop tissue, callus induction INTRODUÇÃO As técnicas de transferência de genes para plantas através das ferramentas da engenharia genética têm sido estabelecidas há mais de 20 anos. No algodão, as principais demandas em termos de melhoria agronômica via transgenia centram-se nas características das fibras, resistência a herbicidas e a fitopatógenos, em particular insetos e fungos; todavia, apesar das tecnologias atualmente disponíveis para transformação, a obtenção de plantas transgênicas de algodão ainda é dependente do tipo do método de transformação e da cultivar uma vez que nem todas elas são embriogênicas e essa característica é necessária para que se possa regenerá-las após a transformação (CARVALHO et al., 1998).

2 Sawahel (2001) desenvolveu um protocolo simples para transformação de calos de algodão G. barbadense L., utilizando-se como fonte de policátion o brometo de hexadimetrina (polibrene). Esse protocolo foi utilizado por pesquisadores da Embrapa Algodão e Cenargen para transformar G. hirsutum L., contudo, a eficiência de transformantes foi baixa. O objetivo deste trabalho é descrever os ajustes procedidos na técnica descrita por Sawahel (2001) que possibilitaram resultados mais expressivos para a transformação do algodão. MATERIAL E MÉTODOS Indução de calos - Sementes deslintadas de G. hirsutum cv. Coker 312 foram esterilizadas como descrito por Sawahel (2001) e cultivadas em meio basal MSB sólido, composto de meio MS, mais sais e vitaminas, 3% de sacarose e suplementado com 10 mg/l de 2,4-D (ácido 2,4- dicloro fenoxiacético) e 0.5 mg/l de 2-ip (isopenteniladenina). O meio foi solidificado com 0,16% de Phytagel. O hipocótilo de cada plântula foi cortado (5mm 2 ), inoculados no meio MSB sólido e incubados a 27± 2 C sob condições de 16h de luz e 8h de escuro. DNA plasmidial - Utilizou-se o vetor binário pcambia 1301 que contém o gene marcador gus e o de seleção hpiit, ambos sob o controle do promotor 35S do Cauliflower Mosaic virus. Protocolo de transformação - Pré-plasmolizou-se os calos (200 mg) por 4 horas em microtubos contendo 1 ml de tampão fosfato, ph 7. A seguir, centrifugou-se os calos (2.000 rpm/2 min), ressuspendendo-os em 300 µl de MSB líquido µl de espermidina 0.5 M + polybrene (0,3 mg/µl em MSB líquido). Depois, 400 µl do DNA plasmidial foi adicionado a esta solução (50 µg/µl em MSB líquido) que foi incubada a 28 C/6h e, posteriormente, cada amostra foi transferida para placas de petri contendo 4 ml de MSB líquido e incubadas por dois dias a 28 C. Expressão transiente do gene gus e seleção em higromicina Após incubação dos calos, coletouse 100 mg de calos, transferindo-os para placa de ELISA para incubação em X-gluc (5-bromo-4-cloro- 3-indolil-β-D-glucoronídeo) a 37 C por 19 hs para análise histoquímica do gus (BRASILEIRO E CARNEIRO, 1998). Dez calos foram testadas para cada tratamento. As amostras foram analisadas com auxílio de microscópio estereoscópico. Os calos remanescentes (100 mg) foram transferidos para meio MSB sólido contendo 50 mg/l de higromicina. Em cada magenta foram distribuídos dez calos que foram cultivados por 60 dias em câmara de crescimento, no escuro. Cada tratamento teve seis repetições. Análise de PCR e Southern blot - Extraiu-se os calos crescidos em meio contendo higromicina e analisou-se via PCR. Primers específicos do gene hptii foram utilizados. Os fragmentos obtidos foram visualizados em gel de agarose (0.8 %) contendo brometo de etídio. Os produtos de PCR dos calos transformados com pcambia foram analisados em Southern blot. Um fragmento do gene hptii contendo 480 pb foi usado como sonda e marcado com α P 32 dctp. A análise da membrana exposta foi feita com filme de raio X por 18 h a - 70 C.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Meio de indução de calos - O meio de cultivo ajustado para algodão nesse trabalho possibilitou a proliferação de calos friáveis de maneira uniforme e em quantidade suficiente para as etapas necessárias nos ensaios de transformação. Com o ajuste do protocolo, a elevação da concentração de sacarose (3%) e, em especial, a adição ao meio de uma citocinina (2ip) possibilitaram expressivo crescimento dos calos de algodão tanto em quantidade quanto em precocidade (Fig. 1). Expressão do gene gus e seleção em higromicina - A análise histoquímica do gus demonstrou grande quantidade de calos transformados revelada pela reação enzimática com X-Gluc para detecção do gus (Fig. 2). Dos dez calos testados, a reação foi positiva em sete. Com relação à seleção para higromicina, a taxa de crescimento dos calos em 50 mg/ml foi baixa provavelmente devido a alta concentração desse antibiótico, fazendo com que se elevasse a pressão de seleção dos transformantes. Ainda assim, em cada repetição constatou-se entre 50% e 60% de crescimento desses calos, enquanto que os calos dos tratamentos controle (sem plasmídio) que foram inoculados em meio com higromicina não cresceram no meio seletivo. Figura 1. Detalhe de calos crescidos em MS acrescido de sais, vitaminas, sacarose (3%), auxina (2,4-D) e citocinina (2-ip)

4 Figura 2. Expressão de gus em calos transformados com pcambia. Esquerda: Calos crescidos em MSB/espermidina/polybrene (controle). Direita: Calos transformados mostrando reação positiva para o gus. Análise de PCR - Verificou-se produtos de PCR amplificados para detecção do gene hptii. O fragmento interno de aproximadamente 500 pb confirmou a presença do respectivo gene do pcambia nos calos transformados (Fig. 3A). A presença do vetor foi constatada através da sonda de hptii em análise de Southern blot (Figura 3B). Os resultados apresentados nesse estudo demonstram a aplicabilidade e facilidade do uso da técnica de policátions para transformação em algodão G. hirsutum L. A M B 1 2 Figura 3. Produto de PCR em gel de agarose (0.8%). M: 1Kb DNA ladder Plus. 1- DNA de calos não transformados (controle); 2- DNA de calos transformados com pcambia; 3- sonda do gene hptii (500pg/µL). Seta indica o fragmento de 500 pb de hptii. B- Autoradiografia de Southern blot. 1- DNA de calos transformados com pcambia; 2- sonda do gene hptii.

5 CONCLUSÃO A técnica de transformação de algodão através do uso de policátion é de grande simplicidade, rápida e com custos equivalentes aos dependidos com a de Agrobacterium. Apresenta ainda a vantagem de ser menos tóxica que outros policátions, a exemplo do PEG e é perfeitamente adaptável para qualquer outra cultura desde que se estabeleça as condições para obtenção de calos viáveis. (*) Fontes Financiadoras: FUNDEAGRO, FIALGO, BNB. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CARVALHO, J. M. F.; GONZALEZ-BRITO, E.; PEREZ, C.; SANTOS, J. W. Resposta de duas cultivares de algodão à embiogênese somática em diferentes meios de cultivo. Revista de Oleaginosas e Fibrosas, v. 2, n. 1, p.13-20, CHOI, S., BEGUN, D.; KOSHINSKY, H.; OW, D.W.; WING, R.A. A new approach for identification and clone of genes: the pbacwich system using Cre/Iox site- specific recombination. Nucleic Acid Research, v. 28, n. 7, p.19-25, SAWAHEL, W. A. Stable Genetic Transformation of Cotton Plants Using Polybrene-Spermidine Treatment. Plant Molecular Biology Reporter, v. 19, p. 377a 377f, 2001.