Biorremediação de ambientes contaminados por petróleo e derivados

Transcrição

1 13 de setembro de UERJ Biorremediação de ambientes contaminados por petróleo e derivados Alexandre Soares Rosado Unidade de Ecologia microbiana e biotecnologia do Petróleo do polo de Biotecnologia BIOINOVAR - UFRJ

2 Origem do Petróleo O petróleo é originado de grandes deposições fósseis, é uma mistura bastante complexa de compostos orgânicos e com um alto conteúdo de energia. Rocha geradora

3 Tipos de hidrocarbonetos encontrados no Petróleo) Fração saturada Parafinas ( n-alcanos, alcanos ramificados) e Naftenos ( cicloalcanos) Fração insaturada (aromáticos, oleofinas, diolefinas e acetilênicos) Compostos não hidrocarbônicos, como os ácidos naftênicos e sulfurados

4 Toxicidade Os efeitos tóxicos imediatos Moléculas de baixa massa molecular Os efeitos crônicos da poluição com petróleo são pouco conhecidos. Moléculas de alta massa molecular

5 Diminuição da diversidade de espécies Efeitos carcinogênicos e citogenéticos de longo prazo

6 Petróleo A principal fonte de energia do planeta, de distribuíção não homogênea entre os países e um recurso não-renovável A sociedade atual é extremamente dependente da utilização de petróleo para o seu desenvolvimento.

7 Petróleo O Petróleo se tornou provavelmente a mais importante substância negociada entre países e corporações levando a guerras, massacres e extermínios. Crise do petróleo na década de 1970 A Primeira Guerra do Golfo Diferentes guerras entre os países árabes, inclusive a Guerra Irã-Iraque A luta pela independência da Chechênia Guerra Iraque-Estados Unidos (Invasão do Iraque)

8 FONTES DE POLUIÇÃO DE HIDROCARBONETOS NO MAR Esgoto Industrial e Urbano 62% Navios não Petroleiros 15% Fonte Natural 10% Operação de Petroleiros 7% Acidentes com Petroleiros 3% Exploração & Produção 2% Terminais / Refinarias 1%

9 Biodegradação Utilização de hidrocarbonetos por microrganismos: ZoBell, 1946, observou a capacidade degradativa de bactérias pertencentes a 30 gêneros Ampla distribuição na natureza. Utilização dependente da natureza química e das condições ambientais.

10 HIDROCARBONETOS O 2 O 2 Ataque inicial por oxigenases Degradação por vias periféricas PO 4 3- SO 4 2- Ciclo TCA Fe 3+ NH 4 = O 2 CO 2 H 2 O Biomassa celular Multiplicação

11 DIVERSIDADE E BIOTECNOLOGIA MICROBIANA PROMOVENDO SUSTENTABILIDADE

12 O que procuramos? Estudos sobre a diversidade e Bioprospecção microbiana Uso de Tecnologias Limpas Aplicação de ações que levem ao desenvolvimento sustentável

13 Estratégias de Remediação Quantidade do contaminante Características do ambiente Seleção Tecnologias mais Melhor relação custo-benefício Tempo de tratamento adequadas

14 Processo Promissor Biorremediação Aceitação Agências Reguladoras Opinião pública FORMA NATURAL DE TRATAMENTO

15 Custos de técnicas de remediação Países (11) da CEE Técnica de remediação Euro/m 3 Incineração Ex-situ 785 Aterro Ex-situ 231 Lavagem/Trat. térm Fitorremediação 122 (22-222) Imobilização In/Ex-Situ Air Sparging/Bomb. Trat Biorremediação-Landfarming Muros reativos/de contenção Atenuação natural monitorada 20 Fonte: (junho, 2006)

16 TÉCNICAS DE TRATAMENTO BIOLÓGICO Bioestimulação Correção de fatores e/ou adição de nutrientes específicos para garantir a quantidade e a qualidade da microbiota nativa Bioaumento Adição de linhagens microbianas compatíveis com o local contaminado

17 EMM

18 Também conhecidos como florestas de mangue ou simplesmente mangues, estes ecossistemas costeiros, situam-se na faixa tropical e subtropical do mundo. No Brasil, estes ambientes distribuem-se ao longo da costa desde o Estado do Amapá até Santa Catarina, perfazendo uma área total de Km2 (Vergara-Filho, 1993). Manguezais no Brasil:

19 Avaliação de diferentes estratégias para biorremediação de manguezais I. Avaliação Pré-tratamento II. Experimento de microcosmo III. Experimento Piloto

20 Amostra de manguezal Análise físico-química Análise da profundidade de penetração do óleo e potencial Redox Análise textural Análise microbiológica Etapa I Técnicas convencionais Isolamento e Contagem de Rizosfera e sedimentos Técnicas Moleculares Rizosfera e sedimentos Caracterização dos isolados e Potencial de biodegradação Perfil genético da comunidade microbiana (PCR/DGGE) Biblioteca de clones Seleção dos isolados degradadores

21 Etapa II Planejamento fatorial Microcosmos Sem a planta Com a planta

22 Etapa III Experimento Piloto Químico (TPH, óleo residual) Monitoramento Físico químico Toxicológico Ecológico

23 Diagnóstico do ambiente Portão 3m 3m 3m Efluente Amostra composta controle 1 Amostra composta controle 2 Amostra composta controle 3

24 Gama proteobacteria alpha proteobacteria delta proteobacteria beta proteobacteria Gama proteobacteria alpha proteobacteria delta proteobacteria beta proteobacteria

25 c a d b Bacteria (a); Pseudomonas (b); Actinobacteria (c); Betaproteobacteria (d) and; Alphaproteobacteria (e). O manguezal é representado por nove pontos (1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C) e o manguezal de referência é representado pela sigla cab. S e R indicam amostras de sedimento ou rizosfera, respectivamente. e

26 log CFU/ml log CFU/ml

27 Isolamento e caracterização de microrganismos degradadores de óleo Amostras Contagem (NMP de mo. Deg.de óleo/ 100mL) R ctr 23 X 10 2 R3A 43 X 10 2 R3B 24 X 10 3 R3C 21 X 10 3 R2A 23 X 10 2 R2B 23 X 10 2 R2C 93 X 10 2 R1A 23 X 10 2 R1B < 3 X 10 2 R1C 15 X 10 2 S ctr < 3 X 10 2 S1 comp. 4 X 10 2 S2 comp. 9 X 10 2 S3 comp. 2,3 X A B C D E F

28 Produção de Biossurfactantes

29 Inoculação das estirpes degradadoras em meio BH líquido acrescido de óleo a 0,1% para acompanhamento do perfil de degradação.

30 Compostos alvo (µg/l, Controle Estirpe R1C -2A % de degradação n C10 ppb) 825,02 21,09 97,44 n C ,84 5,6 99,52 n C ,15 3,25 99,77 n C ,97 40,58 97,92 n C ,94 47,21 97,86 n C ,63 3,1 99,88 n C ,62 1,68 99,93 n C ,89 28,75 99,1 n C ,78 50,58 97,42 n C ,63 1,1 99,93 n C ,83 1,6 99,99 n C ,57 5,61 99,59 n C ,70 8,05 99,32 n C ,38 10,74 99,04 n C ,75 18,62 98,22 n C ,54 2,42 99,77 n C26 849,03 31,54 96,28 n C27 783,62 2,45 99,7 n C28 550,06 16,09 97,07 n C29 480,66 15,37 96,8 n C30 376,32 18,83 95 n C31 526,44 31,52 94 n C32 383,55 27,80 92,75 n C33 288,29 22,84 92,07 n C34 185,65 12,67 93,17 n C35 144,77 9,72 93,28 n C36 114,29 14,40 87,4 Total , ,56 99,61

31 Montagem do Consórcio Utilização de bomba peristáltica para formação de células em grânulos

32 Microcosmos

33 Montagem do Experimento de campo Produção e plantio das mudas

34 Montagem do Experimento de campo

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37 Experimento de biorremediação Campo e Viveiro Crescimento Vegetal

38 Fisiologia Vegetal Taxa de atividade fotossintética das mudas no viveiro e no manguezal

39 Produção de pigmentos pelas mudas no viveiro e no campo

40 Taxa de atividade fotossintética das mudas do campo e no viveiro submetidas aos diferentes tratamentos de biorremediação

41 Análise de teores de nutrientes em amostras foliares

42 Análises microbiológicas Sedimento Campo -9 meses após inoculação

43 Análises microbiológicas Rizosfera Campo Antes da inoculação e 3 meses após inoculação L. racemosa

44 Análises microbiológicas Rizosfera Viveiro 3 meses após inoculação L. racemosa

45 Análises microbiológicas Rizosfera Campo 6 meses após inoculação R. mangle

46 Conclusões, Considerações finais e Recomendações O projeto intitulado Avaliação de diferentes estratégias para biorremediação de manguezais contribuiu de maneira bastante abrangente para guiar futuros estudos de biorremediação de manguezais. Além de ter contribuído com um extenso levantamento acerca da diversidade microbiana de um manguezal brasileiro, esse trabalho pioneiro, utilizou pela primeira vez diferentes estratégias de biorremediação in situ em manguezal brasileiro e técnicas moleculares de monitoramento microbiano.

47 Esse é o primeiro estudo a realizar esse tipo de mapeamento e correlação entre a diversidade microbiana (utilizando-se métodos convencionais e moleculares) e a estrutura heterogênea química de manguezais, demonstrando que essa diversidade corresponde às variações químicas de diferentes nichos dentro de um mesmo ambiente. DNA Barcoding Indicadores de qualidade

48 Montagem do consórcio bacteriano de degradação de óleo a ser aplicado nos experimentos de biorremediação Nesse ponto, a equipe se deparou com um dos desafios desse projeto; Montar uma estratégia que permitisse a manutenção do consórcio microbiano e do fertilizante (Bioestímulo) em campo ao longo do tempo, sem que houvesse uma lavagem desses inóculos devido à ação da maré. Solução encontrada-fertilizantes: Fertilizantes de liberação lenta, enterrados no sedimento contido

49 Solução desenvolvida Consórcio: As bactérias do consórcio foram encapsuladas em uma matriz que além de permitir a manutenção física das bactérias no campo, permitiu ainda a liberação desses organismos gradativamente.

50 Dessa forma, desenvolvemos e utilizamos uma estratégia utilizando os microrganismos e fertilizantes associados às mudas do replantio, garantindo não apenas a manutenção dos inóculos em campo como ainda o estabelecimento desses nas rizosferas das mudas. Assim, além da aplicação na degradação do óleo no sedimento, as próprias mudas puderam utilizar esses inóculos, que por sua vez permitiram um melhor e mais rápido desenvolvimento das plantas.

51 Segundo obstáculo A grande heterogeneidade da distribuição do óleo em manguezais (não permite uma avaliação clara dos resultados das análises de HTP e HPA) Nossa recomendação é que em estudos de biorremediação de manguezais outros parâmetros sejam levados em conta para avaliar a recuperação do ambiente, entre eles, o uso de indicadores biológicos de recuperação como a diversidade microbiana e as respostas vegetais.

52 Microrganismos já são propostos na literatura como excelentes indicadores de alterações e recuperação ambiental; Quanto aos vegetais, eles são uma das bases do ecossistema manguezal. Dessa forma, havendo recuperação das espécies vegetais em manguezais, outros organismos tendem a retornar a esse ambiente e todo o ecossistema tende a se reestruturar e recuperar.

53 O monitoramento microbiológico e do desenvolvimento de plantas revelou o eficiente estabelecimento dos inóculos através da observação das alterações dos perfis microbianos de áreas sob diferentes tratamentos (microrganismos indicadores de alterações, no caso, dos tipos de tratamento estabelecidos); O tratamento de Bioestímulo + Bioaumento proporcionou melhor desenvolvimento das espécies vegetais (tanto L. racemosa quanto R. mangle).

54 EMM Resultado... Estimulo no crescimento das plantas, degradação de hidrocarbonetos, manutenção da microbiota nativa = Recuperação do ambiente sem causar impactos secundários

55 Exploring our microbial collection potential

56 Agradecimentos: Raquel Peixoto, Norma Rumjanek, Andrew Macrae, Heitor Coutinho Flavia Freitas, Gina Vasques, Staffan Kjellberg Fábio Mota & Lucy Seldin Petrobras Embrapa CNPq