TESTE DA EFICIÊNCIA DE AGENTES ANTIMICROBIANOS EM PAPEL IMPREGNADO COM RESINA MELAMINA-URÉIA-FORMALDEÍDO

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1 TESTE DA EFICIÊNCIA DE AGENTES ANTIMICROBIANOS EM PAPEL IMPREGNADO COM RESINA MELAMINA-URÉIA-FORMALDEÍDO Juliano Lucas Manosso 1, Roseli Mello 2, Maria Luiza Fernandes Rodrigues 3. 1 Acadêmico do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR); 2 Msc em Biotecnologia. Prof a. Co-orientadora da Faculdade de Ciências Biológicas e de Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná. Curitiba, Paraná, Brasil. 3Doutora em Química Orgânica. Prof a. Orientadora da Faculdade de Ciências Biológicas e de Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná. Curitiba, Paraná, Brasil. Endereço para correspondência: Maria Luiza Fernandes Rodrigues mlmfernandes@hotmail.com RESUMO A parte experimental do presente trabalho foi desenvolvida no laboratório de Microbiologia da Faculdade de Ciências Biológicas e de Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná. Neste trabalho foi avaliada a efetividade de um agente antimicrobiano a base de triclosan (amostras de papel fornecidas pela Coveright Surfaces do Brasil Indústria e Comércio Ltda) presente em papel impregnado com resina MUF contra as bactérias Staphylococcus aureus (Gram positiva) ATCC 6538 (CP9) e Escherichia coli (Gram negativa) ATCC (CP7) e a levedura Candida albicans ATCC (CP5). As cepas utilizadas no presente trabalho são fabricadas pela American Type Culture Collection (ATCC) e foram gentilmente cedidas pela Universidade Tuiuti do Paraná. Utilizou-se a técnica de difusão em ágar. Verificou-se a presença de halos de inibição em todas as amostras de papel impregnado com e sem triclosan devido à presença do antimicrobiano e a presença de formol livre. A inibição foi observada apenas na bactéria gram-positiva em amostras de papel prensado com triclosan. Palavras-chaves: Triclosan, bactérias e leveduras. ABSTRACT The experimental part of this Project was developed in the Microbiology Laboratory of Biologic Science and Health Department of Tuiuti University of Paraná. The experimental part of this work was developed in the laboratory of Microbiology, School of Biological Sciences and Health University Tuiuti. We assessed the effectiveness of an antimicrobial agent triclosan on the (paper samples provided by Coveright Surfaces of Brazil Ltda) in this paper impregnated with MUF resin against Staphylococcus aureus (Gram positive) ATCC 6538 (CP9) and Escherichia coli (Gram negative) ATCC (CP7) and the yeast Candida albicans ATCC (CP5). The strains used in this work are manufactured by American Type Culture Collection (ATCC) and were kindly provided by the University Tuiuti of Paraná. We used the technique of agar diffusion. It was the presence of inhibition zones in all samples of paper impregnated with and without triclosan due to the presence of antimicrobials and the presence of formaldehyde free. Inhibition was observed only in samples of paper boards with triclosan front of gram-positive sample. Keywords: Triclosan, bacteria and yeast. 1

2 INTRODUÇÃO A necessidade de preservar o pouco que resta da flora natural do planeta nos leva a desenvolver novas técnicas para produção de vários bens materiais. Uma delas trata da produção de móveis fabricados com chapas de derivados de madeira (MDF, laminado colado, compensado laminado, placas de fibras de madeira) e uma lâmina de papel impregnado com resina sintética de melamina-uréia-formaldeído (MUF) (IWAKIRI, 2005). A resina de uréia-formaldeído é a mais utilizada pelas indústrias de painéis aglomerados. Ela tem vantagem em relação ao custo, entretanto, apresenta baixa resistência à umidade, sendo classificada como de uso interior. Para aplicações que requerem alta resistência à umidade, como em usos estruturais, as resinas fenol-formaldeído e melaminaformaldeído são as mais indicadas. Atualmente, os fabricantes de resinas para madeira passaram a produzir em escala comercial as resinas compostas, tais como melamina-uréiaformaldeído e fenol-melamina-uréia-formaldeído, para aplicações semi-estruturais, com maior resistência à umidade e custos compatíveis (MARRA, 1992). Para a fabricação deste tipo de resina, utiliza-se como matéria-prima o formaldeído 37% estabilizado. Durante a fabricação da resina, o formaldeído sofre um processo de polimerização. Com relação ao tipo de reação de polimerização, os polímeros sintéticos são classificados basicamente em dois grupos: de adição e de condensação. A polimerização entre as moléculas de uréia-formaldeído (figura 1) e melamina-formaldeído (figura 2) se dá através da policondensação. Os polímeros de condensação são formados geralmente pela reação entre dois monômeros iguais ou diferentes, com eliminação de moléculas pequenas, por exemplo, água (MANO, 1991). Como o rendimento dessa reação não é igual a 100%, acaba permanecendo na resina uma pequena quantidade de formaldeído livre, esta quantidade é inferior a 0,5% (COVERIGHT, 2005). Esta pequena concentração pode apresentar propriedades antimicrobianas. Figura 1. Reação simplificada da formação do polímero uréia-formaldeído. 2

3 Figura 2. Reação simplificada de formação do polímero melamina-formaldeído. Em locais que exigem maiores cuidados com a higiene e assepsia como hospitais, clínicas, creches e berçários há a necessidade de produzir móveis com materiais que apresentam propriedades antimicrobianas a fim de minimizar os riscos de contaminação por bactérias e fungos patogênicos. Como todo processo de impregnação realiza-se em escala industrial, é possível introduzir na fórmula da resina MUF agentes com ação bactericida e fungicida. Estes, por sua vez, têm a função de inibir o crescimento de microrganismos. Dentre as infecções hospitalares são comuns às infecções causadas principalmente por Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans (MARCHETTI et al., 2003). A candidíase é provocada por leveduras do gênero Candida, que fazem parte da microbiota endógena do corpo humano, justamente por isso, a candidíase é a principal infecção fúngica oportunista do ser humano. Esta levedura está presente no trato gastrointestinal e geniturinário da espécie humana (CARVALHO, 2003). A Escherichia coli apresenta forma de bacilo gramnegativo, seu habitat natural é o lúmen intestinal de seres humanos e outros animais, dentre os sintomas causados por sua intoxicação estão diarréia sanguinolenta ou não, dores abdominais e febre. Juntamente com a Escherichia coli, o Staphylococcus aureus é uma das espécies patogênicas mais comuns. É uma espécie de estafilococo gram-positiva presente na saliva, nasofaringe, pele e tubo digestivo de certos animais. Os sintomas da intoxicação estafilocócica são náuseas, vômitos, diarréias moderadas e cólicas abdominais (SEIXAS, 2003). O triclosan (2, 4, 4- tricloro- 2- hidroxi-difenil éter) (figura 3) é um agente anti-séptico efetivo contra bactérias e fungos. Ele é incorporado juntamente com outros insumos na resina MUF durante o processo de impregnação. Apresenta grande espectro de ação, sendo utilizado em sabonetes, medicamentos, cremes dentais, talcos, desodorantes, shampoos, dentre outros. O triclosan apresenta aspecto de pó cristalino branco, um composto não-iônico, derivado de um difenil éter, solúvel em diversos solventes orgânicos (etanol, propilenoglicol, 3

4 éter e clorofórmio, por exemplo) e em surfactantes, o que o torna um produto fácil de ser incorporado à maioria das formulações. Outra característica que também facilita sua incorporação às formulações é sua estabilidade térmica, pois suporta o aquecimento a altas temperaturas (200 C) durante 2 horas, sem sofrer decomposição (INFORMATIVO TÉCNICO TRICLOSAN, 2008). Segundo Oliveira (2004) o triclosan é capaz de bloquear a síntese de ácidos graxos por meio de inibição enzimática, inibindo o crescimento de bactérias gram-positivas e gram-negativas, mofos e leveduras. Figura 3. Estrutura química do triclosan. O método de disco-difusão foi idealizado por Bauer et al. (1966), e desde então é um dos métodos mais utilizados nos laboratórios de microbiologia. O princípio deste método baseia-se na difusão, através do ágar, de um antimicrobiano impregnado em um disco de papel-filtro. A difusão do antimicrobiano leva à formação de um halo de inibição do crescimento bacteriano, cujo diâmetro é inversamente proporcional à concentração inibitória mínima (MIC) (JORGENSEN, 1999; BARRY, 1991). Esse método é qualitativo, ou seja, permite classificar a amostra bacteriana em suscetível (S), intermediária (I) ou resistente (R) ao antimicrobiano (NCCLS, 2000). O objetivo deste trabalho foi avaliar a efetividade de um agente antimicrobiano a base de triclosan presente em papel impregnado com resina MUF utilizado como matéria prima para fabricação de móveis contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans, utilizando a técnica de difusão em ágar. MATERIAIS E MÉTODOS Obtenção dos Discos Neste estudo foram utilizadas amostras de papel impregnado com e sem triclosan fornecidas pela Coveright Surfaces do Brasil Indústria e Comércio Ltda (São José dos Pinhais 4

5 PR), empresa atuante no setor de impregnação de papel para fins de revestimento desde As amostras foram divididas em quatro grupos: Papel impregnado com triclosan (PICT); Papel impregnado sem triclosan (PIST); Papel prensado com triclosan (PPCT); Papel prensado sem triclosan (PPST); Foram cortadas amostras de aproximadamente 1,0 x 1,5 cm dos grupos PICT e PIST. Estes discos apresentaram uma área de aproximadamente 1,5 cm². Para os grupos PPCT e PPST, foram cortadas amostras circulares de aproximadamente 0,7 cm de raio, sendo sua área aproximadamente 1,5 cm². A quantidade de triclosan presente nos grupos PICT e PPCT é a mesma, sendo que nos grupos PIST e PPST não existe antimicrobiano. No processo de impregnação industrial, a quantidade de antimicrobiano acrescentada é de 0,3% em relação à resina, ou seja, para 400 Kg de resina são utilizados 1,2 Kg de antimicrobiano. Preparo do meio de cultura Foi preparado o meio de cultura Mueller Hinton liofilizado. Após homogeneização, o meio foi autoclavado por 15 minutos à temperatura de 121ºC. Posteriormente o meio foi transferido para placas de Petri de 100 mm de diâmetro. Foram utilizadas duas placas para cada microrganismo padrão e uma placa para controle positivo e uma para negativo, totalizando 26 placas. Foram utilizados dois discos por placa totalizando quatro resultados por tipos de papel. Microrganismos utilizados Para o presente estudo foram utilizadas cepas da American Type Culture Collection (ATCC) cedidas pela Universidade Tuiuti do Paraná. Como inóculo Gram-positivo, utilizouse Staphylococcus aureu ATCC 6538 (CP9); como Gram-negativo, Escherichia coli ATCC (CP7); como levedura, Candida albicans ATCC (CP5). Revitalização das cepas padrão Com o auxílio de uma pinça flambada e resfriada removeu-se um disco do frasco contendo as cepas liofilizadas. Este disco foi transferido para um tubo com 3 ml de caldo triptona de soja (TSB). Posteriormente este tubo foi colocado em estufa a 36ºC por um 5

6 período de 24 a 48 horas. Este procedimento foi realizado para todas as cepas utilizadas no presente estudo. Padronização da suspensão microbiana Com relação à suspensão microbiana, utilizou-se a técnica de diluições sucessivas (figura 4). Esta técnica consiste na transferência de 0,1 ml da suspensão bacteriana para um tubo contendo 0,9 ml de solução salina estéril (1:10). Pipetou-se 0,1 ml da diluição anterior (solução-mãe) para outro tubo contendo 0,9 ml de salina atingindo assim a concentração 1:100. O procedimento foi repetido até ser atingida a concentração 1: Essa concentração é ideal para o crescimento microbiano, pois se aproxima de 0,5 Mcfarland que é uma concentração adequada para o crescimento de vários microrganismos. Figura 4. Esquema de diluição seriada. 6

7 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados da atividade antimicrobiana dos diferentes tipos de papel impregnado testados frente aos microrganismos mais encontrados em ambientes hospitalares encontram-se na Tabela 1, que mostra o diâmetro dos halos de inibição. Tabela 1. Medidas dos halos de inibição em milímetros. Placa 1 Placa 2 Cepa Tipo Disco 1 Disco 2 Disco 1 Disco 2 CP5 PICT CP5 PIST CP5 PPCT MOR MOR MOR MOR CP5 PPST MOR MOR MOR MOR CP7 PICT CP7 PIST CP7 PPCT MOR MOR MOR MOR CP7 PPST MOR MOR MOR MOR CP9 PICT CP9 PIST CP9 PPCT CP9 PPST MOR MOR MOR MOR Legenda: MOR Microrganismo resistente PICT - papel impregnado com triclosan PIST - papel impregnado sem triclosan PPCT - papel prensado com triclosan PPST - papel prensado sem triclosan Verificou-se que o triclosan presente no papel impregnado (PICT) realmente foi efetivo contra as cepas de o Staphylococcus aureu (CP9), Escherichia coli (CP7) e Candida albicans (CP5). Nota-se uma sensibilidade mais acentuada do S. aureus, que apresentou halos de inibição que variaram de 52 a 60 mm de diâmetro, enquanto a E. coli e C. albicans variaram de 30 a 35 mm. Segundo informativo Cefar de microbiologia (1997), a principal ação do triclosan é sobre microrganismos gram-positivos, quando empregado na concentração de 1%, já a ação contra gram-negativas e fungos é limitada. Esta diferença está relacionada com a composição da parede celular. A parede das gram-positivas é praticamente formada de uma só camada, enquanto a das gram-negativas é formada por duas camadas. Os dois tipos de parede apresentam uma camada em comum, situada externamente à membrana citoplasmática que é denominada camada basal. A segunda camada presente somente nas gram-negativas é denominada membrana externa. A constituição da parede celular dos fungos é uma das 7

8 características que levou à sua separação de reino, ela é composta por fibras de quitina (PELCZAR, 1996). Também foi observada inibição em todas as placas contendo discos de papel impregnado sem o triclosan (PIST). Este resultado indica atividade antimicrobiana causada pela presença de formaldeído livre na resina MUF. Os halos variaram de 30 a 34 mm frente à C. albicans, de 25 a 40 mm frente à S. aureus e foram iguais a 20 mm contra E. coli. Foi possível observar resistência das cepas de C. albicans e E. coli frente ao papel prensado com triclosan (PPCT), porém contra S. aureus foram obtidos halos de inibição que variaram entre 16 a 21 mm. Esta resistência e a diminuição nos diâmetros dos halos estão associadas ao método de obtenção do papel prensado. Para que o papel impregnado seja prensado é necessário que ele seja submetido à pressão de 76 bar a 172ºC por 50 segundos (COVERIGHT, 2005). Esta metodologia utilizada para obtenção do papel prensado poderia explicar a maior resistência dos microrganismos testados, devido à degradação do triclosan e do formol livre. Outras propriedades podem ter afetado o resultado dos halos de inibição, são eles: prazo de validade e grau de oxidação da solução do antimicrobiano. Para as amostras de papel prensado sem triclosan (PPST) o resultado não foi diferente. Houve resistência de todas as cepas testadas. Isto prova que a quantidade de formol livre presente na resina possui ação antimicrobiana e também nos diz que o processo de prensagem acaba degradando em parte o antimicrobiano. CONCLUSÃO De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, foi possível observar que existe atividade antimicrobiana do papel impregnado na ausência de triclosan, devido ao formol livre presente na resina MUF frente aos microrganismos Staphylococcus aureu, Escherichia coli e Candida albicans. Para um melhor resultado do papel prensado é necessário que ocorram mudanças no processo de prensagem bem como a quantidade de antimicrobiano adicionado à resina. Foi verificada ação inibitória dos microrganismos testados frente aos diferentes tipos de papéis, porém não foi possível verificar se o insumo que contém o triclosan apresenta ação bactericida ou bacteriostática devido a não possibilidade de realizar a análise de número de células viáveis. Através dos estudos realizados, verificou-se a necessidade de se acrescentar à resina MUF agentes antimicrobianos, porém fica clara a necessidade de utilizar outros métodos para que se ocorra uma desinfecção mais acentuada dos ambientes que exigem maior assepsia. 8

9 AGRADECIMENTOS Agradeço a pesquisadora e orientadora Maria Luiza F. Rodrigues, a pesquisadora Roseli Mello, a todos os técnicos e funcionários da Universidade Tuiuti do Paraná, pelo apoio ao desenvolvimento deste trabalho. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] BARRY, A.L. Procedures and theoretical considerations for testing antimicrobial agents in agar media. In: Lorian, Antibiotics in Laboratory Medicine. 3. ed. Baltimore: The Williams & Wilkins Co., Md, [2] CARVALHO, R. J. V. et al. IgA, IgE e subclasses de IgG anti-candida albicans no soro e lavado vaginal de pacientes com candidíase vulvovaginal. Revista Associação Médica Brasileira, 2003, p [3] INFORMATIVO CEFAR DE MICROBIOLOGIA. Cefar em notícias. Ano 3, ed. 24, [4] IWAKIRI, S.; ANDRADE, A. S.; JUNIOR, A. A. C; CHIPANSKI, E. R.; PRATA, J. G.; ADRIAZOLA, M. K. O. Produção de painéis aglomerados de alta densificação com uso de resina melamina-uréiaformaldeído. Cerne, Lavras, v. 11, n. 4, p , [5] JORGENSEN, J.H.; TURNIDGE, J.D. & WASHINGTON, J.A. Antimicrobial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods. In: Murray, R.P. et al. Manual of Clinical Microbiology. 7. ed. American Society for Microbiology, Washington DC, 1999, p [6] MANO, E.B.; DIAS, M.L.; OLIVEIRA, C.M.F. Química experimental de polímeros. 1. ed., São Paulo, [7] MARCHETTI, M. G. et al. Evaluation of the bactericidal effect of fi ve products for surgical hand disinfection according to pren and pren The Journal of Hospital Infection, v. 54, n. 1, p , [8] MARRA, A. A. Technology of wood bonding. New York: V. Nostrand Reinhold, [9] NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS (NCCLS). Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. Approved standards M7-A5. Wayne, PA, [10] OLIVEIRA, L.M; OLIVEIRA, P.A.P.L.V. Revisão: Principais Agentes Antimicrobianos Utilizados em Embalagens Plásticas. Brazilian Journal of Food Technology, v.7, n.2, p , [11] PELCZAR, M. J., et al. Estrutura das células procarióticas e eucarióticas. In: Microbiologia conceitos e aplicações. V. 1, 2ª ed., c. 4, p , São Paulo, Makron Books, [12] SEIXAS, J. Doenças Microbianas do Trato Gastrointestinal. Espírito Santo, Disponível em: Acesso em 14 out [13] SISTEMA DE GESTÃO INTEGRADO COVERIGHT SURFACES DO BRASIL, Instruções de Trabalho, [14] TRICLOSAN, Ficha de Informações de Segurança de Produtos Químicos. São Paulo, Disponível em: Acesso em: 19 mar

10 APÊNCICE 10

11 CP5 Candida Albicans Candida albicans é uma espécie de fungo diplóide que causa, oportunamente, alguns tipos de infecção oral e vaginal nos seres humanos. Papel impregnado com antimicrobiano Papel impregnado sem antimicrobiano Papel impregnado prensado com antimicrobiano Papel impregnado sem antimicrobiano 11

12 CP9 - Staphylococcus aureus São bactérias gram positivas de forma esférica e cor amarelada que se desenvolve em locais salinos. Em contato com as células humanas tem função destrutiva e é adquirida através de cortes na pele, contato com doentes e por ingestão de alimentos pré-salgados Papel impregnado com antimicrobiano Papel impregnado sem antimicrobiano Papel impregnado prensado com antimicrobiano Papel impregnado sem antimicrobiano 12

13 CP9 Escherichia coli A Escherichia coli é uma bactéria bacilar Gram-negativa, que, juntamente com o Staphylococcus aureus é a mais comum e uma das mais antigas bactérias simbiontes do Homem. Papel impregnado com antimicrobiano Papel impregnado sem antimicrobiano Papel impregnado prensado com antimicrobiano Papel impregnado sem antimicrobiano 13