USO DA RESTRIÇÃO HÍDRICA NA INIBIÇÃO OU RETARDAMENTO DA GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE ARROZ E FEIJÃO SUBMETIDAS AO TESTE DE SANIDADE EM MEIO ÁGAR-ÁGUA 1

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1 127 USO DA RESTRIÇÃO HÍDRICA NA INIBIÇÃO OU RETARDAMENTO DA GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE ARROZ E FEIJÃO SUBMETIDAS AO TESTE DE SANIDADE EM MEIO ÁGAR-ÁGUA 1 WIRTON MACEDO COUTINHO 2, JOSÉ CRUZ MACHADO 3, MARIA GRAÇAS GUIMARÃES CARVALHO VIEIRA 4, RENATO MENDES GUIMARÃES 4 E DANIEL FURTADO FERREIRA 5 RESUMO - O experimento objetivou desenvolver um procedimento alternativo ao uso de 2,4- diclorofenoxiacetato de sódio na inibição ou retardamento da germinação de sementes de arroz e feijão submetidas ao teste de sanidade pelo método de incubação em ágar-ágar, utilizando a técnica de restrição hídrica. Avaliaram-se os efeitos da restrição hídrica do substrato, induzida pela adição de cloreto de sódio, cloreto de potássio e manitol, em relação à germinação de sementes e comprimento de plântulas de arroz e feijão submetidas à análise sanitária. Avaliou-se também, nesses testes, a influência da restrição hídrica na detecção dos fungos associados às sementes ou plântulas Foram testados os níveis de restrição hídrica de -0,6 e -0,7MPa do meio ágar-água para sementes de feijão e de -0,8 e -0,9MPa para sementes de arroz. O crescimento micelial in vitro de alguns fungos que podem se associar às sementes de arroz (Drechslera oryzae, Gerlachia oryzae, Phoma sorghina e Pyricularia grisea) e feijão (Colletotrichum lindemunthianum, Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli, Macrophomina phaseolina e Rhizoctonia solani) foi também avaliado em meio BDA osmoticamente modificado com os mesmos solutos e níveis de restrição hídrica utilizados nos testes de sanidade. A restrição hídrica do substrato induzida pelos solutos testados, nos níveis avaliados, inibiu ou retardou a germinação das sementes e o comprimento das plântulas e não interferiu na detecção dos fungosassociados às sementes. A restrição hídrica, nos níveis testados, não afetou o crescimento micelial in vitro dos fungos D. oryzae, G. oryzae, P. sorghina, P. grisea C. lindemunthianum e R. solani. O potencial osmótico de -0,7MPa do meio ágar-água, induzido por NaCl, afetou o crescimento micelial do fungo M. phaseolina. O crescimento micelial de F. oxysporum f.sp. phaseoli é maior nos tratamentos com meio ágar-água osmoticamente modificados. Termos para indexação: NaCl, KCl, manitol, Phaseolus vulgaris, Oryza sativa, teste de sanidade. WATER USE RESTRICTION IN THE INHIBITION OR RETARDATION OF SEED GERMINATION OF RICE AND COMMON BEAN SUBMITTED TO THE HEALTH TEST BY AGAR-WATER MEDIUM INCUBATION ABSTRACT - The experiment aimed to develop an alternative procedure to the use of 2,4-D in the inhibition or retardation of rice and common bean seeds germination submitted to the health test by the agar incubation method by utilizing the water restriction technique. The water restriction of the substrates effects on the germination, radicle elongation and mycoflora present in the samples tested of the seeds crops studied were evaluated by using sodium chlorite, potassium chlorite and mannitol incorporated into substrates. The water restriction of substrates levels of -0.6 and -0.7MPa were tested for common bean seeds, and -0.8 and -0.9MPa for rice seeds. The water restriction effects were also investigated on mycelial growth of some fungi transmitted by rice seeds 1 Aceito para publicação em ; parte de Dissertação de Mestrado do primeiro autor. 2 Eng o Agr o, MSc., Depto. de Fitopatologia/UFLA, Cx. Postal 37, , Lavras-MG. 3 Eng o Agr o, Ph.D., Prof. do Depto. de Fitopatologia/UFLA; machado@ufla.br 4 Eng os Agr os, Dr., Profs. do Depto. de Agricultura/UFLA; mariagvc@ufla.br 5 Eng o Agr o, Dr., Prof. do Depto. de Ciências Exatas/UFLA.

2 128 W.M. COUTINHO et al. (Drechslera oryzae, Gerlachia oryzae, Phoma sorghina and Pyricularia grisea) and common bean seeds (Colletotrichum lindemunthianum, Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli, Macrophomina phaseolina and Rhizoctonia solani), by using PDA amended with the osmotic solutes at the same potentials tested in the health tests. The water restriction tested at all levels inhibited or retarded germination and radicle elongation of common bean and rice seeds without affecting the detection of the fungi associated with seeds of the samples examined. The water restriction levels used not affect mycelial growth of D. oryzae, G. oryzae, P. sorghina, P. grisea, C. lindemunthianum and R. solani. Water restriction at -0.7MPa induced by NaCl affected the mycelial growth of M. phaseolina. The mycelial growth of F. oxysporum f.sp. phaseoli was larger in the treatments with agar-water medium adjusted osmotically. Index terms: NaCl, KCl, mannitol, Phaseolus vulgaris, Oryza sativa, health test. INTRODUÇÃO Existem vários métodos para detecção de patógenos em sementes, os quais diferem em sensibilidade e tipos de equipamentos utilizados. A escolha do método irá depender do(s) patógeno(s) a ser(em) detectado(s), da infra-estrutura disponível no laboratório, do grau de treinamento de pessoal envolvido na interpretação do resultado do teste, e do próprio objetivo do teste (ISTA, 1976 e Neergaard, 1979). O método de incubação em meio contendo agar é um dos mais utilizados na detecção de patógenos associados a sementes. É utilizado quando as condições de outros métodos empregados, como a incubação em papel de filtro umedecido, não são adequadas para o crescimento vegetativo, esporulação de fungos e indução de sintomas nas sementes ou plântulas, ou quando se deseja detectar patógenos que produzam colônias características em meio de cultura (Lucca- Filho, 1987). Este método consiste em distribuir as sementes em placas de Petri contendo meio agar apropriado para detecção do(s) patógeno(s) alvo. Os substratos mais utilizados são os meios BDA (extrato de batata - dextrose - ágar), MA (extrato de malte - ágar) e AA (ágar-água) (Mathur & Singh, 1988). Embora empregado na detecção de um grande número de patógenos associados a quase todos os tipos de sementes, como sementes de cereais, hortaliças, ornamentais e florestais, o método de incubação em meio agar pode ter sua prática prejudicada na detecção de patógenos de algumas espécies vegetais, por causa da germinação rápida das sementes, que dificulta a identificação dos fungos associados às sementes ou plântulas, comprometendo a validade do método pela possibilidade de contaminações secundárias entre as sementes e o exterior do recipiente. Em alguns casos, 2,4-diclorofenoxiacetato de sódio é utilizado para inibir a germinação de sementes ou retardar o crescimento de plântulas de espécies dicotiledôneas (Hargbog et al., 1950 e ISTA, 1976). No entanto, esse procedimento deve ser usado com cautela, pois, dependendo da concentração utilizada, o referido produto pode ser fungitóxico (Limonard, 1968 e Machado, 1980). A técnica de restrição hídrica tem sido eficazmente utilizada na inoculação de fungos em sementes (Amaral et al., 1996 e Carvalho, 1999). As sementes são colocadas em contato direto com o fungo desenvolvido em um meio de cultura apropriado, modificado osmoticamente pela adição de um soluto iônico ou não iônico, em um nível de restrição hídrica que não interfira no crescimento micelial do fungo, mas que seja suficiente para retardar a germinação das sementes por um período de tempo necessário para que ocorra o processo de infecção, que é aproximadamente sete dias. O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver um procedimento alternativo ao uso de 2,4-diclorofenoxiacetato de sódio na inibição ou retardamento da germinação de sementes de arroz e feijão em testes de sanidade, realizados pelo método de incubação em meio agar, utilizando a técnica de restrição hídrica. Foram estabelecidos como objetivos específicos: avaliar os efeitos da restrição hídrica em relação à germinação, comprimento de plântulas e micoflora associada a sementes ou plântulas oriundas de sementes de arroz e feijão, submetidas aos testes de sanidade pelo métodos de incubação em ágarágua; avaliar os efeitos da restrição hídrica em relação ao crescimento micelial in vitro de alguns dos principais fungos que se associam às sementes de arroz e feijão. MATERIAL E MÉTODOS As sementes de arroz, cultivar Caiapó e as sementes de feijão, da cultivar Carioca, utilizadas neste trabalho foram produzidas na safra 1998/1999.

3 129 Foram comparados os métodos de incubação em ágarágua padrão (testemunha) e ágar-água com restrição hídrica, em relação à germinação das sementes, comprimento de plântulas e detecção dos fungos associados às sementes de arroz (Oryza sativa L.) e ágar-água padrão (testemunha), ágarágua 2% contendo 2,4-diclorofenoxiacetato de sódio a 10µg.ml -1 e ágar-água com restrição hídrica, em relação à germinação das sementes, comprimento de plântulas e detecção dos fungos associados às sementes de feijão (Phaseolus vulgaris L.). O meio ágar-água padrão foi preparado utilizando 20g de ágar em 1000ml de água destilada. No método de incubação em ágar-água com restrição hídrica, a água utilizada para preparar o meio ágar-água foi substituída por soluções osmóticas de cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl) e manitol. Foram testados os níveis de restrição hídrica de -0,6 e -0,7MPa, para sementes de feijão e de -0,8 e -0,9MPa para sementes de arroz. Para calcular as quantidades de NaCl, KCl e manitol, utilizadas na preparação das soluções nos níveis de potencial osmótico testados, foi utilizado o software SPPM (Michel & Radcliffe, 1995). Utilizou-se a temperatura de 20 o C no cálculo das soluções osmóticas. As quantidades de solutos utilizados, em gramas/litro de água destilada, para obter cada nível de potencial osmótico testado estão apresentadas na Tabela 1. TABELA 1. Quantidade de produto utilizado para preparação das soluções de NaCl, KCl e manitol, nos diferentes níveis de potencial osmótico testados. Potencial osmótico g.l -1 de água destilada (MPa) NaCl KCl Manitol - 0,6 7,71 9,94 44,88-0,7 9,02 11,65 52,33-0,8 10,33 13,36 59,75-0,9 11,64 15,08 67,23 As sementes, em número de duzentos (25 sementes/placa) e duas placas por repetição, foram distribuídas em placas de Petri de 15cm de diâmetro, contendo 30ml de meio ágarágua (padrão ou ajustado aos potenciais osmóticos testados) previamente esterilizado. As sementes foram incubadas em câmara com temperatura de 20±2 o C e fotoperíodo de doze horas de luz negra (comprimento de onda próximo a ultravioleta), durante oito dias. Avaliaram-se a porcentagem de sementes de arroz e feijão germinadas e o comprimento das plântulas, após oito dias de incubação. Foram consideradas como sementes germinadas aquelas com sinais visíveis de emissão de radícula (comprimento maior que 0,1cm). Utilizou-se uma régua com precisão de 0,1cm para medir o comprimento das plântulas. Mediram-se as plântulas de arroz da extremidade da radícula até o ápice do coleóptilo ou folíolo de maior tamanho, enquanto que as plântulas de feijão foram medidas da extremidade da radícula até a inserção dos cotilédones. Na identificação e contagem dos fungos, as sementes e/ ou plântulas foram avaliadas individualmente em microscópio estereoscópico, após oito dias de incubação. Em alguns casos, a identificação foi confirmada pela visualização das estruturas morfológicas dos fungos em microscópio óptico. Obtenção e multiplicação do inóculo - utilizaram-se isolados fúngicos de Drechslera oryzae (Breda de Haan) Subram. & Jain, Phoma sorghina (Sacc.) Boerema, Dorenbosch & Van Kesteren, Pyricularia grisea (Cooke) Sacc. e Gerlachia oryzae Gams, obtidos de sementes de arroz submetidas à análise sanitária pelo método de incubação em papel de filtro com congelamento (-20 o C) e de Colletotrichum lindemunthianum (Sacc. & Magn.) Bri. & Cav., Fusarium oxysporum Schlecht. f.sp. phaseoli Kendr. & Snyd., Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. e Rhizoctonia solani Kühn, obtidos de sementes de feijão submetidas à análise sanitária pelo método de incubação em papel de filtro com 2,4-D. Os fungos cresceram em placas de Petri, de 9cm de diâmetro, contendo meio MA (extrato de malte - ágar) em uma câmara de incubação com temperatura de 20±2 o C e fotoperíodo de doze horas de luz negra (comprimento de onda próximo a ultravioleta), durante oito dias. Crescimento micelial em meio de cultura osmoticamente modificado - avaliaram-se os efeitos da restrição hídrica em relação ao crescimento micelial dos fungos utilizando-se meio BDA (extrato de batata - dextrose - ágar) osmoticamente modificado. Foram testados os níveis de -0,6 e -0,7MPa para os fungos C. lindemunthianum, F. oxysporum f.sp. phaseoli, M. phaseolina e R. solani, e os níveis de -0,8 e -0,9MPa para os fungos D. oryzae, P. sorghina, P. oryzae e G. oryzae. Os níveis de potencial osmótico desejados foram obtidos adicionando-se NaCl, KCl e manitol ao meio BDA. Para calcular as quantidades de NaCl, KCl e manitol adicionadas ao meio de cultura para atingir os níveis de potencial osmótico desejados, utilizou-se o software SPPM (Michel & Radcliffe, 1995), levando-se em consideração o potencial osmótico do meio BDA, que é aproximadamente -0,35MPa

4 130 W.M. COUTINHO et al. (Sommers et al., 1970 e Wearing & Burgess, 1979). Utilizouse a temperatura de 25 o C no cálculo dos níveis de potencial osmótico testados. As quantidades dos solutos utilizados, em gramas/litro de meio BDA, para obter cada nível de potencial osmótico avaliado, estão apresentadas na Tabela 2. TABELA 2. Quantidade de NaCl, KCl e manitol utilizada para ajustar o meio BDA em diferentes níveis de potencial osmótico. Potencial osmótico ajustado g.l -1 de meio BDA do meio BDA (MPa) NaCl KCl Manitol - 0,6 3,10 4,00 18,42-0,7 4,40 5,61 25,73-0,8 5,71 7,32 33,10-0,9 6,91 8,93 40,44 O meio BDA ajustado aos níveis de potenciais osmóticos desejados, após esterilização, foi distribuído em placas de Petri de 9cm de diâmetro, utilizando 15ml por placa. No centro de cada placa foi colocado um disco de 0,5cm com micélio dos fungos a serem testados. As placas com inóculo dos fungos foram mantidas em câmara do tipo BOD com fotoperíodo de doze horas e temperatura de 25 o C, por um período de oito dias. O diâmetro médio das colônias foi mensurado em centímetros, a cada dois dias, e o índice de crescimento micelial (ICM) determinado pela fórmula descrita por Oliveira (1991): ICM = C 1 + C C n N 1 + N N n sendo: ICM = índice de crescimento micelial; C 1, C 2, C n = crescimento micelial das colônias na primeira, segunda e última avaliação; N 1, N 2, N n = número de dias. Utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualisado com quatro repetições para cada tratamento. Excetuando-se as avaliações de germinação e comprimento de plântulas de sementes de arroz, cuja análise estatística foi realizada por métodos não-paramétricos (teste de Kruskal- Wallis), em razão de os resíduos dessas avaliações apresentarem distribuição binomial, todos os dados das demais avaliações foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas entre si pelo teste de Tukey (P 0,05), utilizando-se o procedimento GLM do sistema estatístico SAS (SAS Institute, 1992). RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados referentes à germinação das sementes e comprimento de plântulas em relação ao arroz e ao feijão submetidas à análise sanitária pelos métodos de incubação em ágar-água padrão (testemunha), ágar-água com 2,4-D e ágar-água com restrição hídrica, induzida pela adição de NaCl, KCl e manitol ao substrato, nos potenciais osmóticos testados, estão apresentados nas Tabela 3 e 4 e nas Figuras 1 e 2. TABELA 3. Valores médios de germinação (G) e comprimento de plântulas (CP) de um lote de sementes de arroz, cultivar Caiapó, submetidas ao teste de sanidade pelos métodos de incubação em ágar-água (testemunha) e ágar-água com restrição hídrica. Germinação (%) CP (cm) Ágar-ágar (testemunha) 80a 1,3a Ágar-ágar + NaCl (-0,8MPa) 0 b 0,0 b Ágar-ágar + NaCl (-0,9MPa) 0 b 0,0 b Ágar-ágar + KCl (-0,8MPa) 0 b 0,0 b Ágar-ágar + KCl (-0,9MPa) 0 b 0,0 b Ágar-ágar + Manitol (-0,8MPa) 0 b 0,0 b Ágar-ágar + Manitol (-0,9MPa) 0 b 0,0 b Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Kruskal-Wallis (P 0,05). TABELA 4. Valores médios de germinação (G) e comprimento de plântulas (CP) de um lote de sementes de feijão, cultivar Carioca, submetidas ao teste de sanidade pelos métodos de incubação em ágar-água (testemunha) e ágar-água com restrição hídrica. G (%) CP (cm) Ágar-ágar (testemunha) 82a 14,5a Ágar-ágar + 2,4-D (10µg.mL -1 ) 75ab 1,9 bc Ágar-ágar + NaCl (-0,6MPa) 50 bc 1,3 c Ágar-ágar + NaCl (-0,7MPa) 36 cd 1,1 c Ágar-ágar + KCl (-0,6MPa) 34 cd 1,5 bc Ágar-ágar + KCl (-0,7MPa) 34 cd 1,2 c Ágar-ágar + Manitol (-0,6MPa) 44 cd 2,4 b Ágar-ágar + Manitol (-0,7MPa) 18 d 1,3 c CV (%) 25 7,5 Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P 0,05).

5 131 FIG. 1. A - Sementes de arroz submetidas à análise sanitária pelos métodos de incubação em ágar-água padrão (a) e ágarágua com restrição hídrica (-0,9MPa) (b); B - Plântulas oriundas de sementes de arroz submetidas à análise sanitária pelos métodos de incubação em ágar-água padrão (a) e ágar-água com restrição hídrica (-0,9MPa) (b). Fotos: Ana Regina Nogueira. FIG. 2. A - Sementes de feijão submetidas à análise sanitária pelos métodos de incubação em ágar-água padrão (a), ágar-água com 2,4-D (b) e ágar-água com restrição hídrica (-0,7MPa) (c); B - Plântulas oriundas de sementes de feijão submetidas à análise sanitária pelos métodos de incubação em ágar-água padrão (a), ágar-água com 2,4-D (b) e ágar-água com restrição hídrica (-0,7MPa) (c). Fotos: Ana Regina Nogueira. Na avaliação da germinação e comprimento de plântulas oriundas de sementes de arroz (Tabela 3), constataram-se efeitos de tratamentos (P 0,05). Houve 80% de germinação com um comprimento médio de plântula de 1,3cm no tratamento-testemunha. Nos tratamentos em que se utilizaram soluções osmóticas nos potenciais testados, para substituir a água destilada na preparação do meio ágar-água, as sementes não germinaram. Na avaliação das sementes de feijão, verificaram-se efeitos significativos de tratamentos (P 0,05), tanto na germinação de sementes quanto no comprimento de plântulas (Tabela 4), sendo os valores de germinação, observados nos tratamentos em que se utilizaram soluções osmóticas de NaCl, KCl e manitol, inferiores ao observado no tratamento testemunha (ágar-água padrão). Excetuando-se o tratamento em que se utilizou solução osmótica de NaCl no potencial de -0,6MPa, todos os demais tratamentos inibiram ou retardaram a germinação das sementes mais eficazmente do que o tratamento em que se utilizou 2,4-diclorofenoxiacetato de sódio a 10µg.ml -1, que é o procedimento convencional utili-

6 132 W.M. COUTINHO et al. zado para inibir ou retardar a germinação de sementes de espécies dicotiledôneas em testes de sanidade. Na avaliação de comprimento médio de plântulas, os valores observados tanto no tratamento em que se utilizou 2,4-diclorofenoxiacetato de sódio a 10µg.ml -1 quanto nos tratamentos em que se utilizaram soluções osmóticas de NaCl, KCl e manitol, nos potenciais testados, foram inferiores à testemunha (ágar-água padrão). O prolongamento das fases que antecedem a germinação de sementes em substratos osmoticamente modificados com solutos iônicos e não iônicos tem sido atribuído à diminuição do metabolismo das sementes em função da menor disponibilidade de água para digestão das reservas e translocação dos produtos metabolizados. O estresse hídrico atua geralmente reduzindo a velocidade e restringindo a porcentagem de germinação, além de afetar o elongamento celular e a síntese de parede (Wenkert et al., 1978 e Adegbuyi et al., 1981). Ainda segundo esses autores, para cada espécie existe um valor de potencial hídrico abaixo do qual a germinação não ocorre. Além do efeito osmótico, vários pesquisadores atribuem a redução de germinação e vigor de sementes submetidas ao estresse hídrico aos efeitos tóxicos dos solutos utilizados. Solutos como manitol e NaCl interferem na germinação de sementes tanto pelo efeito osmótico quanto pela penetração em níveis tóxicos nas células (Van Der Moezel & Bell, 1987 e Braccini et al., 1996). Campos & Assunção (1990) atribuíram uma maior redução da germinação de sementes de arroz pelos sais NaCl e Na 2 S0 4, quando comparados ao polietileno glicol 6000, a uma aparente inibição da síntese e/ou atividade de enzimas hidrolíticas necessárias à germinação das sementes, provocada pelos sais em altas concentrações. As diferenças verificadas entre os solutos utilizados, em relação à eficácia em inibir ou retardar a germinação das sementes, neste estudo, podem estar relacionadas, além das diferenças de toxidez desses solutos, às diferenças de potencial hídrico de equilíbrio, específico entre a semente e o meio externo, que, segundo Heydecker et al. (1975) e Bradford (1986), podem variar amplamente em função das características das sementes de cada espécie e cultivar e, possivelmente, entre lotes de um mesmo cultivar. Os resultados referentes à incidência dos fungos detectados nos lotes de sementes de arroz e feijão pelos métodos de incubação em ágar-água padrão (testemunha) ágar-água com 2,4-D e ágar-água com restrição hídrica induzida por NaCl, KCl e manitol nos potenciais osmóticos de -0,6 e -0,7MPa (feijão) e -0,8 e -0,9MPa (arroz), estão apresentados nas Tabelas 5 e 6. Foram detectados os fungos D. oryzae e P. sorghina, associados às sementes de arroz, e Fusarium semitectum Berk. Rav. e M. phaseolina, associados às sementes de feijão. TABELA 5. Incidência (porcentagem média de ocorrência) de fungos em um lote de sementes de arroz, cultivar Caiapó, submetidas ao teste de sanidade pelos métodos de incubação em ágar-água (testemunha) e ágar-água com restrição hídrica. Incidência (%) Drechslera oryzae Phoma sorghina Ágar-água (testemunha) 50a 12a Ágar-água + NaCl (-0,6MPa) 42a 15a Ágar-água + NaCl (-0,7MPa) 52a 18a Ágar-água + KCl (-0,6MPa) 51a 18a Ágar-água + KCl (-0,7MPa) 47a 10a Ágar-água + Manitol (-0,6MPa) 52a 15a Ágar-água + Manitol (-0,7MPa) 57a 14a CV (%) Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P 0,05). TABELA 6. Incidência de fungos em um lote de sementes de feijão, cultivar Carioca, submetidas ao teste de sanidade pelos métodos de incubação em ágar-água (testemunha), ágar-água com 2,4-D e ágar-água com restrição hídrica. Fusarium semitectum Incidência (%) Macrophomina phaseolina Ágar-água (testemunha) 83a 5a Ágar-água + 2,4-D (10µg.mL -1 ) 83a 2a Ágar-água + NaCl (-0,6MPa) 87a 5a Ágar-água + NaCl (-0,7MPa) 88a 3a Ágar-água + KCl (-0,6MPa) 89a 6a Ágar-água + KCl (-0,7MPa) 88a 7a Ágar-água + Manitol (-0,6MPa) 89a 5a Ágar-água + Manitol (-0,7MPa) 89a 7a CV (%) 5 93 Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P 0,05).

7 133 Diferenças estatísticas entre tratamentos na detecção dos fungos associados às sementes de ambas espécies testadas não foram verificadas. A restrição hídrica induzida pela adição de NaCl, KCl e manitol, nos níveis testados, não interferiu na detecção dos fungos associados às sementes. Os fungos que invadem as sementes requerem para o seu desenvolvimento um conteúdo de água em equilíbrio com a umidade do ar de 65 a 85% ( fungos de armazenamento ) e de 90 a 95% ( fungos de campo ) (Christensen & Kaufmann, 1965), que correspondem a teores de água de 15 a 20% (base seca) e 22 a 25% (base seca), para sementes de arroz, respectivamente, e 15 a 24% (base seca) e 27 a 32% (base seca), para sementes de feijão, respectivamente, em ambientes com temperatura de 20 o C (Roa & Rossi, 1976 e Rossi & Roa, 1980). Neste estudo, os teores de água nas sementes de feijão submetidas aos testes de sanidade estavam acima dos limites críticos necessários ao crescimento de ambos os grupos de fungos, pois a água contida no substrato utilizado (meio ágarágua) foi suficiente para que as sementes atingissem a fase III do processo germinativo. Carvalho & Nakagawa (1988) reportam que a fase III de germinação, que é caracterizada pelo crescimento visível do eixo embrionário, é alcançada quando sementes endospermáticas, como as de arroz, e cotiledonares, como as de feijão, atingem teores de água de 54 a 67% (base seca) e 100 a 150% (base seca), respectivamente. As sementes de arroz submetidas aos tratamentos com restrição hídrica não atingiram a fase III do processo germinativo, no entanto o teor de água contidos nas sementes foi suficiente para o crescimento dos fungos associados às sementes. KCl e manitol ao meio BDA, nos níveis de potencial osmótico testados, não interferiu no crescimento micelial desses fungos. Verificaram-se diferenças estatísticas significativas entre tratamentos (P 0,05) em relação aos fungos D. oryzae, F. oxysporum f.sp. phaseoli e M. phaseolina. Com relação ao fungo D. oryzae, constataram-se diferenças estatísticas significativas apenas entre os tratamentos que se utilizaram NaCl no potencial osmótico de -0,9MPa e manitol no potencial osmótico de -0,8MPa, cujos índices de crescimento micelial foram os menores e maiores, respectivamente. Na avaliação do fungo F. oxysporum f.sp. phaseoli, com exceção do tratamento que se utilizou NaCl no potencial osmótico de -0,6MPa, todos os demais tratamentos diferiram da testemunha. Nesses tratamentos, verificaram-se índices de crescimento micelial superiores ao da testemunha. Na avaliação do fungo M. phaseolina, o tratamento que se utilizou NaCl no potencial osmótico de -0,7MPa diferiu estatisticamente da testemunha (BDA padrão), sendo o índice de crescimento micelial, observado nesse tratamento, inferior ao da testemunha. O índice de crescimento micelial diferenciado desses fungos pode estar relacionado aos efeitos combinados de permeabilidade seletiva de membranas e compatibilidade ou toxidez de solutos, tanto externamente quanto internamente à membrana celular. O crescimento micelial de fungos em meios de cultura ajustados osmoticamente é variável para cada espécie (Duniway, 1979). O maior crescimento micelial de alguns desses fungos em meio de cultura ajustado osmoticamente com manitol pode estar também relacionado à utilização desse açúcar como fonte adicional de energia pelos fun- Os resultados referentes aos índices de crescimento micelial dos fungos D. oryzae, P. sorghina, P. grisea, G. oryzae, C. lindemunthianum, F. oxysporum f.sp. phaseoli, M. phaseolina e R. solani em meio BDA e em meio BDA modificado com NaCl, KCl e manitol, nos potenciais osmóticos testados, estão apresentados nas Tabelas 7 e 8. Em relação aos fungos G. oryzae, P. sorghina, P. grisea, C. lindemunthianum e R. solani, não foram verificadas diferenças estatísticas entre os tratamentos. A restrição hídrica induzida pela adição dos solutos NaCl, TABELA 7. Índice de crescimento micelial (ICM) in vitro de alguns dos principais fungos que se associam às sementes de arroz, em potenciais osmóticos de -0,8 e -0,9MPa, promovidos pela adição de NaCl, KCl e manitol ao meio BDA. Drechslera oryzae Fungos (ICM) Gerlachia oryzae Phoma sorghina Pyricularia grisea BDA - testemunha (-0,35MPa) 2,52ab 2,46a 2,54a 0,99a BDA + NaCl (-0,8MPa) 2,50ab 2,46a 2,55a 0,89a BDA + NaCl (-0,9MPa) 2,48 b 2,39a 2,44a 0,95a BDA + KCl (-0,8MPa) 2,53ab 2,51a 2,62a 0,96a BDA + KCl (-0,9MPa) 2,51ab 2,44a 2,59a 0,98a BDA + manitol (-0,8MPa) 2,61a 2,51a 2,60a 1,03a BDA + manitol (-0,9MPa) 2,52ab 2,50a 2,55a 1,03a CV (%) 0,7 1,0 0,4 5,7 Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P 0,05).

8 134 W.M. COUTINHO et al. TABELA 8. Índice de crescimento micelial (ICM) in vitro de alguns dos principais fungos que se associam às sementes de feijão, em potenciais osmóticos de -0,6 e -0,7MPa, promovidos pela adição de NaCl, KCl e manitol ao meio BDA. Colletotrichum lindemunthianum Fungos (ICM) Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli Macrophomina phaseolina Rhizoctonia solani BDA - testemunha (-0,35MPa) 1,02a 1,68 b 3,75a b 3,53a BDA + NaCl (-0,6MPa) 0,97a 1,72a b 3,52 bc 3,54a BDA + NaCl (-0,7MPa) 0,94a 1,76a 3,42 c 3,53a BDA + KCl (-0,6MPa) 1,00a 1,80a 3,68a bc 3,52a BDA + KCl (-0,7MPa) 1,00a 1,76a 3,65a bc 3,48a BDA + manitol (-0,6MPa) 0,98a 1,86a 3,82a 3,58a BDA + manitol (-0,7MPa) 1,04a 1,88a 3,79a b 3,54a CV (%) 8,2 1,6 2,7 1,1 Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P 0,05). gos. Gao & Shain (1995) constataram um maior crescimento micelial de Cryphonectria parasitica em meio de cultura ajustado osmoticamente com sacarose do que em meios de cultura ajustados com NaCl, KCl e a mistura dos sais NaCl, KCl e NaSO 4 (5:3:2) em potenciais osmóticos semelhantes. Além da utilização da sacarose como fonte adicional de energia pelo fungo, esses autores atribuíram o crescimento diferenciado de C. parasitica aos efeitos tóxicos dos sais utilizados, principalmente em potenciais osmóticos mais negativos. Alam et al. (1996) também constataram os efeitos tóxicos dos sais NaCl, KCl, CaCl 2 e Na 2 SO 4, utilizados isoladamente ou em mistura, para ajustar o potencial osmótico de meios de cultura utilizados no crescimento dos fungos Alternaria alternata e Botrytis cinerea. Em ambos os estudos, os sais foram tóxicos em potenciais osmóticos mais negativos que -1MPa. Na avaliação dos efeitos da restrição hídrica em relação a F. oxysporum f.sp. phaseoli, houve um maior crescimento micelial desse fungo nos tratamentos que se utilizaram solutos para ajustar osmoticamente o meio de cultura, o qual que pode estar relacionado a um melhor ajuste osmótico da célula fúngica propiciado pela absorção dos solutos, permitindo maior turgor para extensão celular. CONCLUSÕES! A restrição hídrica induzida por NaCl, KCl e manitol, nos potenciais osmóticos testados, inibe ou retarda a germinação e o comprimento de plântulas oriundas de sementes de arroz e feijão submetidas à análise sanitária pelo método de incubação em ágar-água, e não interfere na detecção dos fungos associados às sementes ou plântulas;! a restrição hídrica do meio BDA, nos potenciais osmóticos testados, não afeta o crescimento micelial in vitro dos fungos D. oryzae, G. oryzae, P. sorghina, P. grisea C. lindemunthianum e R. solani;! o potencial osmótico de -0,7MPa do meio ágar-água induzido por NaCl afeta adversamente o crescimento micelial in vitro do fungo M. phaseolina;! o crescimento micelial in vitro do fungo F. oxysporum f.sp. phaseoli é maior nos tratamentos em que o meio ágar-água é osmoticamente modificado com NaCl, KCl e manitol. AGRADECIMENTO Ao CNPq e FAPEMIG pelo apoio concedido para a condução deste trabalho. REFERÊNCIAS ADEGBUYI, E.; COOPER, S.R. & DON, R. Osmotic priming of some herbage grass seed using polyethylene glycol (PEG). Seed Science and Technlogy, Zürich, v.9, n.3, p , ALAM, S.; JOYCE, D. & WEARING, A. Effects of equilibrium relative humidity on in vitro growth of Botrytis cinerea and Alternaria alternata. Australian Journal of Experimental Agriculture, East Melbourne, v.36, n.3, p , AMARAL, E.A.S.; VIEIRA, M.G.G.C. & SANTOS, C.D. Avaliação da influência de diferentes potenciais osmóticos no índice de crescimento de Fusarium moniliforme Sheldon, Aspergillus sp. e Penicillium sp. em meio de cultura. In: SEMINÁRIO PANAMERICANO DE SEMILLAS, 15 e WORKSHOP SOBRE MARKETING EM SEMENTES E MUDAS, 3, Gramado, 28/30 out Anais. Gramado: CESM-RS/ FELAS, p.93. (Resumo, 157).

9 135 BRACCINI, A.L; RUIZ, H.A.; BRACCINI, M.C.L. & REIS, M.S. Germinação e vigor de sementes de soja sob estresse hídrico induzido por soluções de cloreto de sódio, manitol e polietileno glicol. Revista Brasileira de Sementes, Brasília, v.18, n.1, p.10-16, BRADFORD, K.J. Manipulation of seed water relations via osmotic priming to improve germination under stress conditions. HortScience, Alexandria, v.21, n.5, p , CAMPOS, I.S. & ASSUNÇÃO, M.V. Estresse salino e hídrico na germinação e vigor do arroz. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v.25, n.6, p , CARVALHO, J.C.B. Uso da restrição hídrica na inoculação de Colletotrichum lindemunthianum em sementes de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.). Lavras: UFLA, p. (Dissertação Mestrado). CARVALHO, N.M. & NAKAGAWA, J. (eds.). Sementes: ciência, tecnologia e produção. 3.ed. Campinas: Fundação Cargill, p. CHRISTENSEN, C.M. & KAUFMANN, H.H. Deterioration of stored grains by fungi. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v.3, p.69-84, DUNIWAY, J.M. Water relations of water molds. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v.17, p , GAO, S. & SHAIN, L. Effect of osmotic potential on virulent and hypovirulent strains of the chestnut blight fungus. Canadian Journal of Forest Research, Ottawa, v.25, n.6, p , HARGBOG, W.A.F.; WARNER, G.H. & PHILIPS, N.A. Use de 2,4-D as an inhibition of germination in routine examination of beans for seed borne infection. Science, Washington, v.111, n.2874, p.91, HEIDECKER, W.; HIGGINS, J. & TURNER, Y.J. Invigoration of seeds? Seed Science and Technology, Zürich, v.3, n.3/4, p , ISTA - International Seed Testing Association. Seed health testing. Seed Science and Technology, Zürich, v.4, n.1, p.3-49, LIMONARD, T. Ecological aspects of seed health testing. Proceedings of International Seed Testing Association, Wagenigen, v.33, n.3, p , LUCCA-FILHO, O.A. Metodologia dos testes de sanidade de sementes. In: SOAVE, J. & WETZEL, M.M.V.S. (eds.). Patologia de sementes. Campinas: Fundação Cargill, p MACHADO, J.C. Studies on some seed-borne disease of zinnia african marigold and soybean. Manchester: University of Manchester, p. (Tese Doutorado). MATHUR, S.B. & SINGH, K. Seed health testing for field fungi. In: CTA Seminar held at Copenhagen, Proceedings. Copenhagen: Technical Centre for Agricultural and Rural Cooperation, p MICHEL, B.E. & RADCLIFFE, D. A computer program relating solute potential to solution composition for five solutes. Agronomy Journal, Madison, v.87, n.1, p , NEERGAARD, P. Seed pathology. 2.ed. London: MacMillan, v.2, 1191p. OLIVEIRA, J.A. Efeito do tratamento fungicida em sementes e no controle de tombamento de plântulas de pepino (Cucumis sativus L.) e pimentão (Capsicum annun L.). Lavras: ESAL/ UFLA, p. (Dissertação Mestrado). ROA, G. & ROSSI, S.J. Determinação experimental de curvas de teor de umidade de equilíbrio mediante a medição de umidade relativa de equilíbrio. Revista Brasileira de Armazenamento, Viçosa, v.2, n.2, p.17-22, ROSSI, S.J. & ROA, G. Secagem a armazenamento de produtos agropecuários com uso de energia solar e ar natural. São Paulo: ACIESP, p. (Publicação ACIESP, 22) SAS Institute. SAS technical report SAS/STAT software: changes and enhacenment release 607. Cary Nc: SAS Institute, SOMMERS, L.E.; HARRIS, R.F.; DALTON, F.N. & GARDNER, W.R. Water potential relations of three root-infecting Phytophthora species. Phytopathology, St. Paul, v.60, n.6, p , VAN DER MOEZEL, P.G. & BELL, D.T. The effect of salinity on the germination of some Western Australian Eucalyptus and Malaleuca species. Seed Science and Technology, Zürich, v.15, n.1, p , WEARING, A.H. & BURGESS, L.W. Water potential and the saprophytic growth of Fusarium roseum graminearum. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v.11, n.6, p , WENKERT, W.; LEMON, E.R. & SINCLAIR, T.R. Leaf elongation and turgor pressure in field; grown soybean. Agronomy Journal, Madison, v.70, n.5, p , "#"#"