Estudo da Evolução de Edemas Agudos pelo Método da Capacitância Elétrica

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1 Estudo da Evolução de Edemas Agudos pelo Método da Capacitância Elétrica Eloá Ferreira Yamada, Antonio Balbin Villaverde, Renato A. Zângaro, Marcos T. T. Pacheco Grupo de Instrumentação Biomédica, Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D), Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP), Brasil, Fone: , Fax: Eloa@univap.br, abv@univap.br, zangaro@univap.br, mtadeu@univap.br Resumo - A inflamação é uma reação protetora de tecidos a estímulos agressores, na qual é neutralizado o agente agressor, desencadeando-se processos que tendem à reparação do tecido; e que se caracteriza por vasodilatação, aumento do fluxo sanguíneo e aumento da permeabilidade vascular, resultando na formação de edema. A proposta deste trabalho é mostrar que a capacitância elétrica pode ser utilizada para determinar a presença e a evolução temporal de edema no tecido biológico. Para mensurar a capacitância elétrica foi utilizada uma Ponte LCR, modelo HP LCR-15B, que afere a capacitância elétrica entre eletrodos, que foram posicionados na pele do dorso de ratos, no qual o processo inflamatório foi induzido, com conseqüente formação de edemas. O objetivo deste trabalho foi estudar a evolução, através da medida da capacitância elétrica, de edemas em processos inflamatórios agudos induzidos por carragenina. As aferições de capacitância elétrica foram mensuradas a cada 15 minutos nos animais submetidos à injeção de soro fisiológico ou carragenina a 1%. Os resultados do grupo controle mostraram que após a injeção de soro fisiológico, houve um aumento dos valores de capacitância elétrica, devido ao aumento da quantidade de água na região entre eletrodos. Posteriormente, devido à absorção do organismo ocorreu uma diminuição dos valores da capacitância elétrica. Após a indução de edema, houve maior quantidade de água, e elevou a magnitude da capacitância elétrica. À medida que a inflamação diminuiu, os valores da capacitância também decaíram. Com base em nossos resultados foi possível concluir que a medida de capacitância elétrica pode ser um método adequado para a determinação da evolução de edemas in vivo. Palavras-chave: Edema; Inflamação; Carragenina; Capacitância elétrica. Abstract - The inflammation is a protective reaction of tissues to aggressive stimulus. This reaction can neutralize the aggressive agent and promotes the tissue repair process. The inflammatory process can be characterized by vessel dilatation, increase of blood flow and vascular permeability, resulting in an edema formation. The aim of this work is to show that electrical capacitance can be used to determine the presence and time evolution of an edema in biological tissue. Measurements were done using a LCR meter, model HP LCR-15B, which measures the electrical capacitance between two electrodes localized on the rat skin across the edema caused by the inflammatory process. The aim of the present study was to determine the time evolution, by measuring the electrical capacitance, of edemas in a carrageenan induced acute inflammation process. This technique was undertaken in rats, which received an injection of physiologic serum or carrageenan at 1%. The electrical capacitance was measured every 15 minutes. Results from the control group showed that, after the physiologic serum injection, there was an increase of the electric capacitance due to an increase of the water in the region between the two electrodes. Subsequently, the values of capacitance decreased because of the absorption by the organism of the injected serum. After the edema formation, by injecting carrageenan, occurred first an increase on the rats electrical capacitance, followed by a decrease accompanying the inflammation reduction. On the basis of our results it is possible to conclude that electrical capacitance measurement may be an adequate method to determinate the edema evolution in vivo. Key-words: Edema; Inflammation; Carragenan; Electrical capacitance. Introdução Edema é um sinal clínico da inflamação que ocorre devido a alterações do calibre vascular, que levam a um aumento do fluxo sanguíneo, aumento da permeabilidade vascular, emigração de células inflamatórias do sangue para o local da lesão, liberação de agentes álgicos, que ocorrem devido aos efeitos dos mediadores químicos (Chandrasoma e Taylor, 1993; Contran et al., 1996). Vários são os métodos de avaliação de edema: medições através de plestimografia, nos quais o volume do edema é calculado pela

2 diferença do volume inicial e final (Honmura et al., 1993), técnicas de fluorescência (Romano et al., 1997), histopatologicamente (Song et al., 1999; Lespi e Gregorini, 2). Para estudar o edema, este é induzido em pele de animais por injeção subcutânea contendo carragenina, que é um polissacarídeo sulfatado extraído de uma alga, conhecida como Irish Moss (Honmura et al., 1992). A avaliação clínica da pele permite uma avaliação imediata por especialistas; porém, a desvantagem desse método é a subjetividade. A biópsia e a microscopia, que fornecem informações detalhadas a respeito das camadas da pele e suas alterações, são subjetivas, pois o resultado é analisado apenas pelo patologista (Serup, 1992). Entre a avaliação clínica e as mais sofisticadas técnicas, destacam-se os métodos praticados na bioengenharia, que são não invasivos, pois fornecem informações objetivas in vivo em tempo real. Dentre os métodos de medida praticados em bioengenharia, destaca-se a medida de impedância elétrica que é uma resistência ao fluxo de corrente elétrica, quando há uma diferença de potencial entre eletrodos. A pele tem a propriedade de gerar uma resistência ao fluxo de corrente elétrica (impedância elétrica). A impedância elétrica com corrente alternada corresponde à resistência, indutância e capacitância (Dawes, 1952; 62.html, 2). Ollmar et al. (1994) relatam que os primeiros estudos envolvendo impedância elétrica de pele datam de Desde então, muitas aplicações de impedância elétrica têm sido realizadas em estudos de pele in vitro e in vivo, em animais e humanos. Em um estudo recente, Ollmar et al. (1994), constataram que mudanças na impedância elétrica podem estar correlacionadas com as respostas da pele para controlar a irritação (inflamação) induzida por diferentes concentrações de agentes agressivos. A partir da indução do processo inflamatório pelo agente agressivo (carragenina) propõe-se estudar a alteração do acúmulo de líquido no tecido intersticial (edema) através da medida de capacitância elétrica. Com isso, propõe-se um método não invasivo e objetivo para avaliar o grau do edema. Metodologia Animais Foram utilizados 13 ratos Wistar, com peso entre 2-3g., mantidos em condições de iluminação natural, temperatura ambiente, alimentação e água ad libitum. Os animais foram tricotomizados para facilitar as aferições. Essas regiões tricotomizadas foram limpas com algodão umedecido com álcool etílico 7%, para que os eletrodos pudessem ser melhor acoplados. Dividiram-se os animais em três grupos experimentais: o primeiro grupo (5 animais) injetou-se apenas o anestésico; o segundo grupo (4 animais), foi submetido à injeção de anestésico e soro fisiológico, e o terceiro (4 animais), recebeu o anestésico e o produto inflamatório. Medicamentos Para anestesiar os animais foi utilizado,1 ml de Zoletil 5 para cada 1g. de peso animal. Em todos os animais, a capacitância elétrica foi aferida 15 minutos após a anestesia. O primeiro grupo recebeu duas injeções de anestésico, e foram aferidas as alterações de capacitância elétrica, num período de 6 horas. O segundo grupo foi anestesiado com apenas uma injeção e posteriormente, os animais receberam 1 ml de soro fisiológico (cloreto de sódio a,9%), uma hora e meia depois. E o terceiro grupo, recebeu uma injeção inicial de anestesia, e foi submetido à injeção contendo 1 ml de carragenina a 1% (produto inflamatório), 15 minutos após a anestesia. O edema induzido pela carragenina atinge seu máximo 1 ou 2 horas depois (Honmura et al., 1992; Honmura et al., 1993). O soro fisiológico e a carragenina foram injetados na região subcutânea do dorso dos animais, entre os eletrodos. Ponte LCR As aferições de capacitância elétrica foram realizadas através de dois eletrodos conectados a uma Ponte LCR, modelo HP LCR-15B. Os eletrodos são próprios para eletrocardiograma, circulares, de diâmetro 1mm, contendo gel, com alto coeficiente de condução elétrica, e fita adesiva para fixação na pele. Esses eletrodos foram posicionados no dorso dos animais, com separação longitudinal de 5 cm e eqüidistante à região em que foi injetado o soro fisiológico ou a carragenina. Os parâmetros da Ponte LCR foram: freqüência de 1kHz (baixa freqüência), modo automático, nível interno e tensão de 1V. A Ponte LCR possui duas freqüências de operação: 12Hz e 1kHz, sendo esta última escolhida por apresentar maior estabilidade nas medidas de capacitância elétrica. A capacitância elétrica foi aferida a cada 15 minutos, até que os efeitos do anestésico terminassem, sendo a primeira medida de capacitância realizada 15 minutos após a injeção de anestesia. As medidas de capacitância elétrica foram realizadas em animais que permaneceram no

3 interior de uma Gaiola de Faraday para evitar interferências eletromagnéticas do ambiente. A temperatura e a umidade do ar foram controladas para que não houvesse flutuações nos valores de capacitância elétrica. Resultados No primeiro grupo, os animais receberam 2 injeções de anestésico para mantê-los durante um período de 6 horas (36 minutos) e, averiguou-se os efeitos do anestésico através de capacitância elétrica a cada 15 minutos. Na primeira, foi injetado,1 ml de Zoletil 5 para cada 1g de peso; na segunda,,1 ml de Zoletil 5, injetado aproximadamente 2 horas após o início do experimento. visualização do gráfico, uma vez que se obteve o comportamento semelhante. Uma vez verificado que o anestésico altera os valores da capacitância elétrica até os 9 minutos, então, optou-se por submeter o segundo grupo de animais à apenas uma injeção, no início do experimento, e verificaram-se as aferições de capacitância elétrica até que os efeitos do anestésico terminassem. Assim, já que o anestésico altera os valores da capacitância elétrica, escolheu-se injetar o soro fisiológico algum tempo depois da injeção de anestésico, quando a capacitância elétrica alcançou um certo grau de estabilidade; isso acontece a aproximadamente 9 min de tempo de experiência. Deste modo, podem ser separadas as mudanças na capacitância elétrica devidas ao anestésico e ao soro fisiológico. Capacitance (nf) Rat 3 Capacitance (nf) Figura 1 Curvas características da capacitância elétrica em ratos anestesiados. Na Figura 1, a capacitância elétrica é mostrada em função do tempo para os animais que pertencem ao primeiro grupo (ratos que receberam apenas anestésico). Pode ser observado um aumento inicial na capacitância, alcançando um máximo entre 15 e 3 min desde o início da experiência; em seguida, a capacitância diminui lentamente. Os efeitos dos anestésicos para ratos 1 e 2 começam a terminar a 9 min, sendo necessário então, uma injeção adicional de anestésico em cada rato (,1 ml de Zoletil 5 ). Deste modo, foi possível manter os animais anestesiados durante as 6 horas de experimento. Verificou-se novamente um aumento na magnitude da capacitância elétrica entre 15 e 21 minutos. A partir deste momento, os valores mantiveram-se constantes até o fim do experimento, num total de 36 minutos. Foi observado um comportamento diferente no 3º animal, no qual o efeito de anestesia permaneceu durante um tempo mais longo. Neste caso não foi necessária a segunda injeção de anestésico. A capacitância elétrica para o rato 3, inicialmente aumentou até 15 min, seguida por uma diminuição lenta até aproximadamente 9 min, mantendo-se constante até o fim da experiência. Outras curvas, referentes a outros dois ratos não foram incluídas na Figura 1, para facilitar a Figura 2 Curvas características da capacitância elétrica em ratos anestesiados e submetidos à injeção contendo soro fisiológico. Na Figura 2, é mostrada a capacitância elétrica de dois ratos do segundo grupo (anestésico e soro fisiológico) em função de tempo. O comportamento é semelhante para todos os ratos do grupo. Pôde-se observar que após a injeção de anestesia nos animais, houve um pico inicial dos valores da capacitância elétrica até o 9 minuto, como foi mostrado anteriormente. Aos 9 minutos, os animais foram submetidos à injeção contendo 1 ml de soro fisiológico. A partir deste momento, foi possível verificar um aumento da capacitância elétrica para os dois animais. Os efeitos do Zoletil 5, na maioria dos animais, terminaram entre 135 e 15 minutos. Curvas referentes a outros 2 ratos não foram incluídas na Figura 2, para facilitar a visualização do gráfico, considerando que foi obtido o mesmo comportamento.

4 Capacitance (nf) Figura 3 Curvas características da capacitância elétrica em ratos anestesiados e submetidos à injeção contendo carragenina a 1%. No terceiro grupo (Figura 3), os animais foram anestesiados e 5 minutos após a primeira medida de capacitância elétrica, foi injetado no dorso de cada animal 1 ml de carragenina a 1%. Como foi observada nos outros dois grupos anteriores, a capacitância tem um pico inicial. Considerando que a inflamação induzida pela carragenina se desenvolve lentamente, alcançando seu máximo após 2 a 3 horas da indução (Honmura et al., 1992; Honmura et al., 1993), dessa forma, foi possível ver ambas as contribuições separadamente: a anestesia e o agente agressivo. No rato 1, a capacitância começou a aumentar em torno de 9 minutos, alcançando um máximo em 135 minutos, e permaneceu constante por quase 7 minutos. Aos 21 minutos, a capacitância elétrica começou a diminuir até o fim do experimento (em aproximadamente 24 minutos). No segundo animal, os valores da capacitância elétrica aumentaram a partir de 135 minutos até 21 minutos (de 9,4 nf para 14,3 nf); os efeitos da anestesia terminaram em 1 minutos. Curvas referentes a outros 2 ratos não foram incluídas na Figura 3, para facilitar a visualização do gráfico, uma vez que foi obtido o mesmo comportamento. Discussão e Conclusões Em 1961, Linus Pauling e S. L. Miller formularam uma teoria molecular a respeito da anestesia geral, na qual se estabelece que moléculas podem estar ligadas entre si por pontes de hidrogênio. Formando-se invólucros, que são semelhantes a algumas cadeias protéicas cerebrais, que poderiam formar hidratos, à temperatura corpórea, na presença de um gás anestésico (Booth e McDonald, 1992). Para explicar essa teoria com alguns anestésicos, outras hipóteses foram consideradas. Há muito se especulou que membranas biológicas deveriam expandir-se na presença de anestésicos, porque eles podem penetrar e expandir películas colocadas na interface entre o ar e água. O mecanismo mais simples para compreender essa expansão das membranas biológicas foi à observação de que o volume se altera, isto é, ocorre um aumento no volume da membrana, com a penetração das moléculas do anestésico na membrana celular. (A área de expansão da membrana é da ordem de 1 vezes o volume das moléculas de anestésico) (Booth e McDonald, 1992). Esta hipótese explicativa da teoria de Pauling e Miller corrobora os resultados obtidos no presente trabalho, como demonstrados na Figura 1, em que após a anestesia nos animais, há um aumento dos valores da capacitância elétrica, devido, então, ao fato da expansão do volume das membranas celulares. De acordo com Lóden e Lindberg (1991), quando a região superficial da pele está mais hidratada, há um aumento da capacitância elétrica. Assim, pode-se afirmar que após a injeção contendo soro fisiológico entre os eletrodos, ocorre um aumento na quantidade de água na região superficial da pele, conseqüentemente, há um aumento da capacitância elétrica. A constante dielétrica de água (K) é muito alta, cerca de K=., assim qualquer aumento na quantidade de água entre os eletrodos aumentará a capacitância elétrica. Na Figura 3, pôde-se constatar um aumento da magnitude da capacitância elétrica à medida que o edema inflamatório aumenta. Estes dados reafirmam os resultados de Lee et al. (1997), Choi et al. (2) e Agner et al. (2), no qual uma resposta inflamatória aguda pode causar um aumento dos valores da capacitância elétrica; reações inflamatórias fortes podem causar um aumento da capacitância, e reações menos acentuadas, podem registrar a diminuição da capacitância elétrica. Pode-se observar que a técnica de capacitância elétrica permite determinar mudanças nas propriedades de pele. Tal mudança pode ser devido à injeção de anestésico, soro fisiológico ou por uma inflamação, causada por agente externo agressivo, como carragenina. Assim, a capacitância elétrica pode ser considerada um método adequado para determinar a evolução de edemas in vivo. Agradecimentos Os autores são gratos à FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pelo suporte financeiro para a realização deste estudo. Referências Agner, T.; Held, E.; West, W.; Gray, J. (2) Evaluation of an experimental patch test model for the detection of irritant skin reactions to moisturizers. Skin Research & Technology. p Vol. 6, n. 4.

5 Booth, N. H.; McDonald, L. (1992) Farmacologia e Terapêutica em Veterinária. Ed. Guanabara Koogan S. A., Rio de Janeiro, Brasil. p Chandrasoma, P.; Taylor, C. R. (1993) Basic pathology. Ed. Prentice-Hall do Brasil Ltda., Rio de Janeiro, Brasil. p Choi, J. M.; Lee, J. Y.; Cho, B. K. (2) Chronic irritant contact dermatitis: recovery time in man. Contact dermatitis. Vol. 42, n. 5: Contran, R. S.; Kumar, V.; Robbins, S. L.; Schoen, F. J. (1996) Structural and Functional pathology. Ed. Guanabara Koogan S. A., Rio de Janeiro, Brasil. Dawes, C. L. (1952) Curso de Eletrotécnica. Ed. Globo, Porto Alegre, Brasil. Vol. 1, p Honmura, A.; Yanase, M.; Obata, J.; Haruki, E. (1992) Therapeutic effect of Ga-Al-As the diode laser irradiation on experimentally induced inflammation in rats. Lasers in Surgery and Medicine., Vol. 12, p Honmura, A.; Yanase, M.; Obata, J.; Haruki, E. (1993) Analgesic effect of Ga-Al-As diode laser irradiation on hyperalgesia in carrageenin-induced in inflammation. Lasers in Surgery and Medicine. Vol. 13, p Impedance (impedance), 2 (on line). Available Internet: ml (27/7/2). Lee, J. Y.; Efendi, I.; Maibach, H. I. (1997) Acute irritant contact dermatitis: recovery in man. Contact dermatitis. Vol. 36, n. 6, p Lespi, P. J.; Gregorini, S. D. (2) Follicullotropic T cells in regressive basal cell carcinoma of skin. Am. Journal Dermatopathologic. Vol. 22, n. 1, p Lóden, M.; Lindberg, M. (1991) The influence of a single application of different moisturizers on the skin capacitance. Acta Dermatovenereologica. Vol. 71, n.1, p Ollmar, S.; Nyrén, M.; Nicander, I.; Emtestam, L. (1994) Electrical impedance compared with other non-invasive bioengineering techniques and visual scoring goes detection of irritation in human skin. British Journal of Dermatology. Vol. 13, n. 1, p Romano, M.; Faggioni, R.; Sironi, M.; Sacco, S.; Echtenacher, B.; Di Santo, E.; Salmona, M.; Ghezzi, P. (1997) Carragenan-induced acute inflammation in the mouse air pouch synovial model. Role tumour necrosis factor. Mediators of Inflammation. Vol. 6, p Serup, J. (1992) Characterization of contact dermatitis and atopy using bioengineering techniques. The survey. Acta Dermatovenereologica. Suppl. (Stockh). Vol. 177, p Song, W. K.; Park, H. J.; Cinn, Y. W.; Rheem, I.; Pai, H.; Shini, J. H. (1999) Primary cutaneous mucormycosis in a trauma patient. Journal Dermatology. Vol. 26, n.12, p