ANÁLISE COMPARATIVA DE QUATRO PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO, EM GERGELIM 1

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1 525 ANÁLISE COMPARATIVA DE QUATRO PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO, EM GERGELIM 1 NAIR HELENA CASTRO ARRIEL 2, SANDRA HELENA UNÊDA-TREVISOLI 3, ANDRÉA CAPELOTO 4, SÔNIA M. ZINGARETTI DI MAURO 5 e ANTÔNIO ORLANDO DI MAURO 6 RESUMO: Em determinadas espécies, a otimização dos procedimentos de isolamento de DNA é fundamental para o sucesso nos estudos moleculares. Com a finalidade de se estimar a quantidade, a pureza e, preliminarmente, constatar a interferência da integridade do DNA nas amplificações das reações de polimerase em cadeia (PCR), comparam-se quatro protocolos de extração de DNA genômico (CTAB, Dellaporta modificado, Murray & Thompson e Miniextração) em folhas jovens de três cultivares de gergelim (CNPA G2, CNPA G3 e BRS CNPA G4). A quantificação do DNA foi obtida através de leitura em biofotômetro, tomando-se a razão das taxas de absorbância de 260/280 nm para determinação da pureza das amostras. Adicionalmente, comparou-se a qualidade do DNA através de eletrofrese em gel de agarose a 1,5%. Os dados foram analisados em delineamento inteiramente casualizados, com três repetições. Constatou-se que os quatro métodos forneceram quantidades de DNA suficientes para estudos de PCR; entretanto, o protocolo modificado de Dellaporta foi superior para obtenção de DNA de alta qualidade. A quantidade e a integridade do DNA extraído pelos diferentes métodos, não interferiram nos padrões de amplificação. Termos para indexação: Métodos, ácido nucléico, PCR, eletroforese, Sesamum indicum L. COMPARATIVE ANALYSIS OF FOUR GENOMIC DNA EXTRACTION PROTOCOLS IN SESAME ABSTRACT: The optimization of procedures for DNA isolation in some species is essential for the sucess of molecular studies. Aiming to estimate the quantity, the purity and to verify the interference of the DNA integrity in the PCR amplifications, four protocols of genomic DNA extractions were compared (CTAB, Dellaporta modified, Murray & Thompson modified and Miniextraction). Young leaves of three sesame cultivars (CNPA G2, CNPA G3 AND BRS 196-CNPA G4) were used and the DNA quantification was obtained by reading the concentration in a Biofotometer and the realtion of absorbance 260/280 nm was taken to determinate the purity. Besides, the DNA quality was compared from agarose gel eletrophoresis at 1,5%. Data was analysed using a completely random design, with three replications. All the methods gave sufficient DNA yield for PCR applications, however, highest yields of good quality were obtained using Dellaporta modified protocol. The amount and the integrity of DNA from differents methods did not have any effect in the PCR s amplifications. Index terms: Methods, nucleic acid, PCR, eletrophoresis, Sesamum indicum L. 1 Aceito para publicação em 12 de Março de Eng. Agr., M.Sc., Embrapa Algodão, Doutoranda em Produção Vegetal FCAV/UNESP. 3 Eng. Agr., D.Sc., Pós-Doutoranda em Genética e Melhoramento de Plantas, FCAV/UNESP. 4 Biologa, B.S., Mestranda em Genética e Melhoramento de Plantas - FCAV/UNESP. 5 Eng. Agr., D.Sc., Pós-Doutoranda em Genética e Melhoramento de Plantas FCAV/UNESP. 6 Eng. Agr., PhD., Professor Adjunto do Departamento de Produção Vegetal - FCAV/UNESP - orlando@fcav.unesp.br

2 526 N.H.C. ARRIEL, et al. INTRODUÇÃO Nos estudos de biologia molecular, freqüentemente são necessárias amostras de DNA genômico íntegro e em quantidade suficiente para análises. No caso particular de um programa de melhoramento genético vegetal baseado em marcadores moleculares, no qual muitas vezes um grande número de indivíduos é avaliado, é essencial que se disponha de métodos de extração rápidos e eficientes na obtenção de DNA de boa qualidade. Contudo, para algumas espécies o isolamento dos ácidos nucléicos ainda é considerado fator limitante, devido à presença de componentes indesejáveis na solução final. Inúmeros são os protocolos de extração de DNA genômico, os quais refletem a variabilidade da composição bioquímica que pode ser encontrada nas diferentes espécies vegetais (Romano, 1998). Ocorre que os tecidos de plantas de determinadas espécies florestais, racalcitrantes etc, apresentam uma série de características que podem prejudicar o isolamento de ácidos nucléicos. Além das paredes celulares interferirem na homogeneização dos tecidos, a qualidade do DNA extraído pode também ser afetada devido às grandes quantidades de polisssacarídeos, presentes nas células vegetais, os quais sendo polímeros carregados negativamente, podem algumas vezes ser purificados com o DNA (Lodhi et al., 1994; Mantell et al.,1994; Rogers et al., 1996; Vroh Bi et al., 1996; Csailk et al., 1998). Ressalta-se que o co-isolamento de polissacarídeos, fenóis e compostos secundários podem danificar o DNA e inibir a ação de enzimas de restrição ou da Taq Polimerase nas reações de PCR ou na separação eletroforética de fragmentos de DNA (Romano, 1998). Certos polissacarídeos podem causar mudanças na mobilidade durante a eletroforese resultando em falsas diferenças entre os genótipos. Isto pode não ser um problema quando se está analisando uma população que está segregando para poucos fragmentos de restrição. Contudo, irá interferir sobremaneira quando envolver a análise de muitos indivíduos, os quais apresentam grande polimorfismo entre si (Kidwell & Osborn, 1992; Ferreira & Grattapaglia, 1996; Bered, 1998; Csailk et al., 1998). De acordo com Romano (1998) apesar do número de métodos disponíveis aumentar constantemente, a maior parte deles é uma variação de dois protocolos básicos: o fundamentado na utilização do detergente Brometo de Cetiltrimetilamônio (CTAB) que tem a função de romper as membranas celulares para que ocorra a liberação do DNA e o descrito por Dellaporta et al. (1983) que se baseia na precipitação simultânea de proteínas e polissacarídeos por alta concentração de acetato de potássio na presença de Dodecil Sulfato de Sódio (SDS). Este método é considerado um dos mais laboriosos devido à necessidade de várias etapas de purificação (Molinari & Crochemore, 2001). Um outro procedimento de extração foi descrito por Murray & Thompson (1980), cuja proposta foi apresentada para o isolamento de DNA de alto peso molecular ( pares de bases ou mais de comprimento) e livre de contaminantes. A técnica também é ideal para o rápido isolamento de pequenas quantidades de DNA em grande escala. Romano (1998) relata diversos protocolos descritos principalmente em experimentos de PCR que necessitam de pequenas quantidades (20 a 200 ng) de DNA; entretanto, esses protocolos podem fornecer DNA s parcialmente degradados e/ou com contaminantes que podem comprometer a reprodutibilidade das reações de PCR. Sabe-se que, dependendo da análise molecular que será utilizada, existe a necessidade de menor ou maior quantidade de DNA com pureza adequada aos estudos a que se destinam. Nas reações de polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (RAPD) além de ser usada pequena quantidade de DNA, a técnica tolera amostras de baixa qualidade; entretanto, a otimização da obtenção de DNA íntegro é fundamental para que se obtenha amplificações reproduzíveis e confiáveis. Em se tratando disso, o próprio procedimento de extração poderá gerar DNA que induz a resultados contraditórios (Milach, 1998). No caso do gergelim (Sesamum indicum L.) onde praticamente não existem trabalhos envolvendo a análise a nível de DNA, Bhat et al. (1999) utilizaram o procedimento com base no método descrito por Sagai-Maroof (1984); contudo, em testes iniciais, observaram-se

3 ANÁLISE COMPARATIVA DE QUATRO PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO 527 problemas na extração, como excesso de viscosidade da solução final, em função de que sentiu-se a necessidade de se testar diferentes protocolos para se otimizar o processo de extração do DNA da espécie, em um método rápido e eficiente, já que a finalidade é avaliar centenas de genótipos para estudos de polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (RAPD). Pelo exposto, este trabalho teve por objetivo testar diferentes protocolos de extração de DNA em gergelim, em relação à quantidade e à pureza obtidas e preliminarmente constatar a interferência da integridade do DNA nas amplificações das reações de PCR-RAPD. No decorrer dos trabalhos, esses métodos sofreram algumas modificações com a finalidade de se promover maior rapidez, facilidade no manuseio para um grande número de amostras e qualidade de DNA obtido. MATERIAL E MÉTODOS Para a realização deste trabalho, três cultivares de gergelim (CNPA G2, CNPA G3 e BRS 194-CNPA G4) foram semeadas em casa de vegetação do Departamento de Produção Vegetal da UNESP, Campus Jaboticabal. Aos 20 dias após o semeio, duas folhas jovens foram coletadas por planta. A amostragem do tecido foliar foi efetuada em dez indivíduos de cada cultivar, as folhas armazenadas em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e acondicionadas em gelo para serem transportadas até o Laboratório de Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento de Plantas, onde foram armazenadas a -80ºC. A quantidade de tecido foliar variou de 50 a 100 mg. As paredes e membranas celulares foram rompidas através da maceração do tecido foliar com nitrogênio líquido. Protocolos de Extração Método CTAB proposto por Ferreira & Grattapaglia (1996) Procedimentos: Ao tecido foliar macerado dentro do microtubo, foram adicionados 700 µl de tampão CTAB (NaCl 1,4M; Tris HCl ph 8,0 100 mm; EDTA 20 mm; CTAB 2%; β- Mercaptoetanol 0,2% e água Milli-Q) preaquecido a aproximadamente 65ºC. Incubouse em banho maria com circulação a essa temperatura, entre 30 minutos e uma hora, agitando-se a cada 10 minutos. Ao homogeneizado foram adicionados 600 µl de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e se agitou manualmente por cinco minutos; em seguida, centrifugou-se por dez minutos a x g. Em novos tubos identificados transferiu-se a fase aquosa (fase superior). Nesta solução adicionaram-se 400 µl de isopropanol gelado (-20ºC) misturando-se suavemente por inversão dos tubos, várias vezes. As amostras foram então submetidas à temperatura de -20ºC por 30 minutos ou mais, para formação do sedimentado. Centrifugaram-se as amostras por 20 minutos a x g e se descartou o sobrenadante. O precipitado foi lavado duas vezes com 1mL de etanol 70%, por cinco a dez minutos e uma vez com etanol absoluto, por três minutos. Secou-se o precipitado, deixando os tubos em câmara de fluxo laminar. O DNA extraído foi ressuspendido em 150 µl de TE (Tris- HCl 1M, EDTA 500 mm) ph 8,0 com RNAse (10 µg/ml) e incubou-se a 37ºC, por 30 minutos a duas horas. Método Dellaporta (1983) modificado Procedimentos: Ao tecido foliar macerado dentro do microtubo foram adicionados 750 µl de tampão (NaCl 500 mm; Tris HCl ph 8,0 100 mm; EDTA 50 mm; β-mercaptoetanol 0,2% e água Milli-Q) preaquecido a aproximadamente 65ºC. Adicionaram-se 50 µl de SDS 20% e misturando-os por inversão. Foram incubados a 65ºC, por 30 minutos a uma hora, com agitação periódica a cada 10 minutos. Adicionaram-se 250 µl de acetato de potássio 5M, misturando-se por inversão e incubando-se em seguida por 20 minutos no gelo, com agitações a cada 5 minutos. Centrifugou-se a x g por 10 minutos. Após essa etapa, o procedimento de filtragem, recomendado no protocolo original, foi suprido para dinamizar a metodologia. Assim, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo, adicionando-se, aproximadamente, 400 µl de isopropanol

4 528 N.H.C. ARRIEL, et al. gelado, misturando-se por inversão e incubandose por pelo menos uma hora, a 20ºC. Centrifugou-se por 10 minutos a x g e descartando-o a seguir o sobrenadante. O DNA foi precipitado pela adição de 1/10 do volume de acetato de sódio 3M, ph 5,2 e 0,7 do volume de isopropanol gelado (250 µl). Misturou-se por inversão e incubou-se por uma hora ou mais, a 20ºC, para formação do sedimentado. As amostras foram centrifugadas a x g por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com etanol 70%. Secou-se o precipitado em câmara de fluxo laminar, dissolvendo-o a seguir em 150 µl de tampão TE ph 8,0 com RNAse (10 µg/ml) enfim, incubouse por 37º durante pelo menos 30 minutos. Protocolo Murray & Thompson (1980) modificado Procedimentos: Ao tecido foliar macerado dentro do microtubo foram adicionados 750 µl de tampão CTAB (CTAB 2%; NaCl 1,4M; Tris- HCl ph 8,0 100 mm; EDTA 20 mm; β- Mercaptoetanol 1% e água Milli-Q) preaquecido a aproximadamente 65ºC. Incubou-se nessa temperatura, por 30 minutos a uma hora, agitando-se a cada 10 minutos. Adicionaramse 400 µl de clorofórmio:octanol (24:1) e se agitou manualmente por cinco minutos. Centrifugou-se por 15 minutos a x g. Retirou-se o sobrenadante, transferindo-o para outro tubo adicionando-lhe 75% do volume de isopropanol (aproximadamente 400 µl) a -20ºC. Inverteu-se o tubo gentilmente. Incubou-se a -20ºC por, no mínimo, 30 minutos. Centrifugouse a x g por 15 minutos. Descartou-se o sobrenadante. Adicionou-se 1ml de Wash solution (Etanol absoluto, acetato de sódio 3M, ph 5,2 e água Milli-Q) agitando-o por 20 minutos, centrifugando-o por 10 minutos a x g; em seguida, descartou-se o sobrenadante adicionando-se 150 µl de TE ph8,0 com RNAse (10 µg/ml). Protocolo Miniextração para PCR proposto por Romano (1998) Procedimentos: Adicionaram-se, ao tecido macerado, 750 µl de tampão de extração para PCR (CTAB 0,8%; NaCl 800 mm; EDTA 22 mm; Tris-HCl 220 mm; Sarcosil 1%; Sorbitol 140 mm; β-mercaptoetanol a 0,2% e água Milli-Q) e 400 µl de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). Incubou-se com agitação periódica a 55ºC por minutos, centrifugando-o x g, durante 5 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, ao qual se adicionou 1,2 o volume de isopropanol a -20ºC. Centrifugou-se a x g, por 10 minutos. Descartou-se o sobrenadante, lavando-se o precipitado com 1mL de Etanol 70%, centrifugando-o a x g durante 10 minutos. Descartou-se o sobrenadante e secouse o precipitado, deixando o tubo em câmara de fluxo laminar. Dissolveu-se o precipitado em 150 µl de tampão TE ph 8,0 com RNA se (10 µg/ml). Quantificação e Verificação da Qualidade do DNA Genômico A quantidade de DNA extraído foi determinada por meio de leitura por radiação ultravioleta, utilizando-se um Biofotômetro - Eppendorf , Hamburg. Este equipamento fornece a quantidade de DNA em µg/ml e a razão de duas densidades óticas de leitura (260 nm/280 nm) para verificação do nível de pureza da amostra. Para isto, preparou-se uma solução de DNA na diluição de 1:50 (DNA:água Mili-Q). Posteriormente, as concentrações e a integridade das amostras de DNA obtidas pelos diferentes métodos foram observadas através da análise comparativa da intensidade das bandas formadas por eletroforese em géis de agarose (1,5%) em tampão TBE 1X (Tris base 1M, Ácido Bórico e EDTA 500mM), corado com 3 µl brometo de etídio (10 mg/ml). O volume de DNA a ser carregado para corrida eletroforética foi determinado em função da quantidade dos sedimentados obtidos e da viscosidade da solução de DNA ao final da extração. Assim, juntaram-se 20 µl de solução de DNA mais 6 µl de tampão de carregamento, deste volume, 15 µl foram retirados para aplicação no gel. Ao lado das amostras, 10 µl de DNA padrão 1kb foram aplicados para observação da qualidade da eletroforese e amostras de DNA do fago lambda de

5 ANÁLISE COMPARATIVA DE QUATRO PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO 529 concentração conhecida para comparar as quantidades extraídas pelos diferentes métodos. Após a corrida, o gel foi visualizado em um Transiluminador de Ultravioleta e fotografado com equipamento EDAS 290 Kodak Digital Science 1D TM. PCR e eletroforese em gel de agarose A reação de polimerase em cadeia ou PCR foi utilizada para constatar se as amostras obtidas nos diferentes métodos permitiriam amplificação das seqüências do DNA genômico a partir de iniciadores de seqüência aleatória. A reação de PCR foi conduzida em um Termociclador MJ Research, modelo PTC-100. O volume de cada reação de amplificação foi de 25 µl, cada reação continha tampão de PCR (10 mm Tris-HCL, ph 8,0 e 50 mm KCl), 2,5 mm MgCl 2, 1,0 unidade de Taq DNA Polimerase, 0,2 mm de dntps 15 ng do iniciador (Operon Technologies OPAW15), 50 ng de DNA genômico e água Milli-Q esterilizada e filtrada. As condições de amplificação envolveram um passo inicial de denaturação a 94ºC por 3 minutos, seguidos de 42 ciclos de denaturação a 94ºC por 1 minuto; anelamento do iniciador a 37ºC por 1 minuto e extensão a 72ºC por 3 minutos. Ao término das reações, as amostras foram mantidas a 4ºC até o momento da sua aplicação no gel de agarose. Para efeito de comparação estatística os diferentes métodos de extração de DNA genômico foram analisados através de delineamento inteiramente casualizados, com três repetições. As avaliações incluíram rendimento ng/µl e pureza de DNA extraído (OD260/OD280). médio para a pureza das amostras aponta que pode haver presença de proteínas e/ou outras substâncias. Na comparação das médias obtidas nos diferentes métodos, Tabela 1, verifica-se que a concentração de DNA variou consideravelmente entre as metodologias e que a menor quantificação foi obtida na extração baseada no método de Murray & Thompson (291,24 ng/ µl) enquanto a extração baseada no método de Dellaporta modificado forneceu a maior quantidade de DNA (618,35 ng/µl) inclusive apresentando também a melhor qualidade de DNA (relação de pureza 1,80) sendo que este método foi também estatisticamente semelhante à pureza obtida no método CTAB, proposto por Ferreira & Grattapaglia (1996), o qual apresentou uma razão de 1,71. Contudo, as etapas de purificação do método Dellaporta refletiram a superioridade de qualidade das amostras de DNA, em relação principalmente à obtida na Miniextração, que apresentou alto nível de proteínas (1,31). De acordo com Barbosa (1998) um DNA puro tem OD260/OD280 de 1,8 a 2,0 e uma razão de 1,6 ou menos indica que deve haver proteínas e/ou outras substâncias em demasia na amostra, enquanto a razão maior que 2,0 indica que as amostras devem estar contaminadas com clorofórmio ou fenol, nessas situações é aconselhável reprecipitar o DNA. TABELA 1. Quantificação e pureza das amostras de DNA genômico em gergelim a partir de 50 a 100mg de tecido foliar, obtidas de diferentes protocolos de extração. Laboratório de Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento de Plantas. FCAV/ UNESP, Jaboticabal, SP, RESULTADOS E DISCUSSÃO A média de DNA extraído envolvendo todos os protocolos foi de 409,49 ng/µl, com relação de pureza de 1,60. Esses resultados indicam que a quantidade do DNA obtido a partir de 50 mg de tecido foliar de gergelim é suficiente para estudos envolvendo análise de polimorfismo de DNA amplificado ao acaso, enquanto o valor *Os valores médios foram obtidos de trinta amostras de plantas, com três repetições. Médias seguidas das mesmas letras na mesma coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.

6 530 N.H.C. ARRIEL, et al. A comparação com os resultados descritos na literatura é difícil, pois, apesar dos procedimentos seguirem protocolos padrões sempre ocorrem modificações para adequar às necessidade em função do tecido e/ou da espécie utilizados. Entretanto, é possível uma comparação geral em função da quantidade de tecido vegetal. De acordo com Ferreira & Grattapaglia (1996) usando-se os procedimentos do método CTAB, é possível se obter concentrações de 10 a 200 ng/µl a partir de 50 a 200 mg de tecido foliar, neste trabalho, o valor médio de quantificação obtido para o método CTAB, foi de 370,9 ng/µl, partindo-se de 50 a 100 mg de tecido foliar. No protocolo original, incluindo purificação com cloreto de césio, Murray & Thompson (1980) relatam que se pode obter rendimentos de 20 a 70 µg de DNA partindo-se de 100 mg de tecido vegetal de diferentes espécies, enquanto, Fulton et al. (1995) baseados em um protocolo de miniextração (Murray & Thompson modificado) utilizaram 50 a 100 mg de folhas de plântulas de tomate e outras plantas herbáceas e obtiveram rendimentos de aproximadamente 10 a 20 µg de DNA. Seguindose a metodologia deste protocolo obtiveram-se rendimentos de DNA de gergelim de 43,68 µg. Ao utilizarem uma modificação do método de Dellaporta et al. (1983), Molinari & Crochemore (2001) obtiveram em torno de 126 µg de DNA com no máximo 40 mg de tecido foliar de maracujá. No presente trabalho os rendimentos de DNA, extraídos a partir de 50 a 100 mg de folhas jovens de gergelim, foram de 92,7 µg com base no protocolo Dellaporta. Quanto à execução dos métodos, observouse que o protocolo baseado na Miniextração para PCR (Romano, 1998) consumiu menos tempo, enquanto o de Dellaporta foi o mais laborioso. Sabe-se que o aspecto do DNA ao final da preparação já pode ser utilizado para diagnosticar a presença de impurezas. A contaminação por polifenóis pode ser evidenciada pela coloração do sedimentado, que tende a ficar escurecido devido à oxidação dos polifenóis em compostos quinônicos (Romano, 1988). Isto ocorreu apenas em algumas amostras, provavelmente em função de problemas com o armazenamento após a coleta. No geral, o redutor de oxidação (βmercaptoetanol) foi eficiente mesmo nas menores concentrações (0,2%). Um outro fator a se considerado é a presença de polissacarídeos na solução final. De acordo com Stewart Jr. & Via (1993) a maioria das técnicas de isolamento de DNA empregadas na área vegetal utilizam o tampão de extração contendo o detergente CTAB, sendo este preferido sobretudo para aquelas espécies que contêm muitos polissacarídeos. Segundo Ferreira & Grattapaglia (1996) ocasionalmente, a precipitação de DNA na presença de etanol ou isopropanol, a partir de uma extração com o detergente CTAB, resulta em uma massa gelatinosa e excessivamente viscosa, possivelmente, rica em polissacarídeos. No presente trabalho, isto foi detectado em muitas amostras dos protocolos CTAB. O uso do CTAB na purificação de DNA foi originalmente descrito para um procedimento que envolvia a precipitação de DNA através de baixas concentrações de cloreto de sódio (0,4M) na presença desse detergente (Murray & Thompson, 1980). O sal, auxilia na etapa de dissociação das proteínas do DNA, e dependendo da concentração de NaCl no tampão de extração, forma-se um complexo DNA-CTAB que pode ser utilizado para precipitar o DNA seletivamente (Kidwell & Osborn, 1992; Lodhi et al., 1994; Vroh Bi et al., 1996; Ferreira & Grattapaglia, 1996; Bered, 1998). Fang et al. (1992) verificaram que a concentração de 1M de NaCl facilitou a remoção de polissacarídeos pelo aumento da solubilidade em etanol, não permitindo a co-precipitação com o DNA, mas Lodhi et al. (1994) constataram que somente altas concentrações de NaCl (>2,5M) foram eficientes para o isolamento de DNA genômico em uva. Já para extração de DNA de folhas de gergelim, constatou-se que nos protocolos com este detergente e uma concentração de sal de 1,4M, tanto a quantidade como a qualidade do DNA foram inferiores às obtidas pelo procedimento de Dellaporta, no qual se usou dodecil sulfato de sódio, como detergente, e o NaCl numa concentração de 0,5M. Neste protocolo, provavelmente a alta concentração de acetato de potássio (5M) na presença do SDS foi mais eficiente na precipitação de proteínas

7 ANÁLISE COMPARATIVA DE QUATRO PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO 531 e polissacarídeos, enquanto nos protocolos CTAB, certos polissacarídeos podem ter permanecido insolúveis com as taxas de concentração de NaCl utilizadas (Murray & Thompson, 1980; Romano, 1998). Existem várias opções para a eliminação de proteínas e polissacarídeos, como o aumento da concentração do detergente CTAB, lavagens adicionais com NaCl, acetato de amônio e cloroformio:octanol e a purificação por gradiente de cloreto de césio, conforme propõem Murray & Thompson (1980); Ferreira & Grattapaglia (1996) e Romano (1998). Romano (1998) relata ainda que em um protocolo CTAB, após o uso do isopropanol, deve-se evitar a etapa de centrifugação, pois pode levar a uma co-precipitação de DNA e polissacarídeos; para tanto, pode-se usar uma pipeta Pasteur para pescar o DNA. Porém, num processo de extração de dezenas de amostras este procedimento seria muito trabalhoso. A comparação do rendimento de DNA obtido nos diferentes métodos (Figura 1) foi realizada através de gel de agarose (1,5%) corado com brometo de etídio e visualizado em luz ultravioleta. No gel, usaram-se como padrão, amostras de DNA não cortado do bacteriófago Lambda (300 e 600 ng). Comparando-se as bandas das amostras extraídas com as bandas padrões, constando-se que as concentrações dos DNA s obtidas se encontram no intervalo dos padrões. Verifica-se que as bandas mais intensas foram observadas no protocolo Dellaporta (618,4 ng/µl) seguidas pelo método CTAB (379,9 ng/µl), Miniextração (357,5 ng/µl) e Murray & Thompson (291,0 ng/µl) respectivamente. Outra análise comparativa foi realizada através de gel de agarose (Figura 2A a 2D) utilizando-se, para aplicação no gel, amostras de DNA quantificadas no biofotômetro com valores representativos das médias obtidas pela análise estatística para cada método (Tabela 1). Verifica-se que as bandas formadas pelos DNA s dos métodos CTAB e Dellaporta foram as de melhor qualidade e expressam os maiores rendimentos de DNA s obtidos (Figuras 2A e 2B) enquanto as bandas formadas pelas amostras do método Murray & Thompson (Figura 2C) foram menos intensas, refletindo as menores concentrações de DNA. Para o perfil eletroforético do protocolo da Miniextração (Figura 2D) observa-se que, apesar do rendimento de DNA obtido por este método ter sido bem próximo ao do método CTAB, as bandas formadas não foram representativas da quantidade de DNA extraído e que algumas amostras não apresentaram banda, como não se observa a formação de rastros de fragmentos na linha do gel, pode-se inferir que não ocorreu degradação das amostras utilizadas; essa situação pode ser explicada pelo alto teor de proteínas ligadas ao DNA, que impedem que o brometo de etídio se intercale às moléculas do DNA ou, ainda, que a quantificação pelo biofotômetro pode ter sofrido interferência em função do alto nível de impureza das amostras obtidas por este método (Robyt & White, 1990; Barbosa, 1998; Nóbrega et al., 1999). Além disso, a viscosidade das amostras obtidas interferiu bastante durante as aplicações no gel de agarose, principalmente para o método da Miniextração, pois em algumas situações o DNA não permanecia nas canaletas, difundindo-se no tampão de corrida da eletroforese, mesmo quando se aumentou a quantidade de tampão de carregamento. Em relação às quantidades de DNA obtidas (43 a 93 µg) entre os diferentes métodos, esses rendimentos permitem que centenas de reações de RAPD sejam conduzidas. Quantidades entre 20 a 34 g representam de reações de RAPD (Stewart Jr. & Via, 1993). Na Figura 3 estão apresentados os padrões de amplificação obtidos para amostras de DNA de gergelim, com o iniciador OPAW15. Observase que a quantidade e a pureza do DNA extraído não interferiram nos padrões de amplificação, ou seja, mesmo com o excesso de contaminantes de algumas amostras, ocorreu a amplificação em todos os métodos de extração testados. Apesar da capacidade das técnicas de amplificação como a de PCR-RAPD, em relação às de hibridização, como as de Southern, em tolerar pequena quantidade e baixa qualidade do DNA (Brunel, 1992), Romano (1998) ressalta que amostras de DNA obtidas por protocolos muito simples, como o da Miniextração, devem ser utilizadas com ressalvas, pois mesmo

8 532 N.H.C. ARRIEL, et al FIG. 1. Comparação do rendimento de DNA (ng/µl) de tecido foliar de gergelim, obtido através de quatro protocolos de extração. Colunas 1 e 2 padrão lambda 300 e 600ng; colunas 3 a 5 - protocolo CTAB; colunas 6 a 8 - protocolo Dellaporta; colunas 9 a 11 - Protocolo Murray & Thompson; colunas 12 a 14 - Protocolo Miniextração A - Protocolo CTAB B - Protocolo DELLAPORTA C - Protocolo MURRAY & THOMPSON D - Protocolo MINIEXTRAÇÃO FIG. 2. Perfil eletroforético das bandas de DNA obtidas para os quatro protocolos de extração. Coluna 1 padrão 100pb; colunas de 2 a 9 DNA s isolados de folhas de gergelim.

9 ANÁLISE COMPARATIVA DE QUATRO PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO 533 FIG. 3. Comparação dos produtos de amplificação de DNA genômico de folhas de gergelim a partir do iniciador OPAW15, obtidos de diferentes protocolos de extração: Coluna 1: DNA padrão de peso molecular 1 Kb; CN: controle negativo; colunas de 3 a 5 protocolo CTAB; colunas 6 a 8 protocolo Dellaporta; colunas 9 a 11 protocolo Murray & Thompson; colunas 12 a 14 protocolo Miniextração demonstrando reprodutibilidade nas amplificações, podem fornecer resultados contraditórios. Para evitar a ocorrência de falso polimorfismo durante a comparação de grandes populações, em especial daquelas espécies de difícil isolamento de DNA, acredita-se que purificações sejam necessárias, já que os contaminantes interagem irreversivelmente com as proteínas e ácidos nucléicos. E, ao se comparar os resultado do protocolo CTAB proposto por Ferreira & Grattapaglia (1996) com o de Dellaporta, constatou-se que a simplicidade e a rapidez do método CTAB, tornaram o processo muito prático para extração de DNA de gergelim de boa qualidade; além disso, pelo fato de se ter evitado etapas subseqüentes de purificação, minimizou-se o tempo e o custo (quantidade de reagentes) da extração. Há de se considerar que nos estudos em nível molecular com PCR, em que se utilizam centenas de amostras de plantas, grandes quantidades de DNA obtidas podem ser aparentemente menos importantes que a velocidade e o custo de preparo das amostras. Nestas situações, o método CTAB proposto por Ferreira & Grattapaglia (1996) poderia também ser indicado para as reações de RAPD. No entanto, para muitos estudos, tais como bibliotecas genômicas, a disponibilidade de altos rendimentos de DNA de elevada qualidade é essencial na obtenção de resultados confiáveis. Neste sentido, o valor médio de DNA obtido com base no protocolo de Dellaporta et al. (1983) indica que o mesmo pode ser utilizado com sucesso na obtenção de DNA genômico de folhas de gergelim envolvendo estudos moleculares, em comparação aos demais protocolos testados. Assim, com base nos resultados obtidos, pode-se inferir que todos os métodos foram eficientes para extração de DNA genômico de folhas de gergelim; entretanto o protocolo modificado de Dellaporta et al. (1983) foi mais adequado para obtenção de DNA de alta qualidade e quantidade para realização de reações de PCR-RAPD, pois se mostrou mais eficiente na eliminação de contaminantes. CONCLUSÕES 1. Todos os métodos foram eficientes para extração de DNA genômico de folhas de gergelim, e em quantidade suficiente para realização de reações de polimerase em cadeia, mas o protocolo modificado de Dellaporta foi mais adequado para obtenção de DNA de alta qualidade. 2. A quantidade e a integridade do DNA extraído pelos diferentes métodos não interferiram nos padrões de amplificação.

10 534 N.H.C. ARRIEL, et al. REFERÊNCIAS BARBOSA, M.M. Quantificação e controle da qualidade do DNA genômico. In: MILACH, S. ed. Marcadores moleculares em plantas. Porto Alegre, p BERED, F. Extração de DNA - considerações e prática. In: MILACH, S. (Ed) Marcadores moleculares em plantas. Porto Alegre, p BHAT, K.V.; BABREKAR, P.P.; LAKHANPAUL, S. Study of genetic diversity in Indian and exotic sesame (Sesamum indicum L.) germplasm using random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Euphytica, v.110, n.1, p.21-33, BRUNEL, D. An alternative, rapid method of plant DNA extraction for PCR analyses. Nucleic Acids Research, v.20, n.17, p.4676, CSAILK, U.M.; BASTIAN, H.; BRETTSCHNEIDER, R.; GAUCH, S.; MEIR, A.; SCHAUERTE, F.; SCHOLZ, F.; SPERISEN, C.; VORNAM, B.; ZIEGENHAGEN, B. Comparative analysis of different DNA extraction protocols: A fast, universal maxi-preparation of high quality plant DNA for genetic evaluation and phylogenetic studies. Plant Molecular Biology Reporter, v.16, p.69-86, DELLAPORTA, S.L.; WOOD, J.; HICKS, J.B. A plant minipreparation: version II. Plant Molecular Biology Report, v.1, p.19-20, FANG, G.; HAMMAR, S.; REBECCA, R. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. Bio Techniques. v.13, n.1, p.52-56, FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 2ª edição. Brasília: Embrapa-CENARGEN, 1996, pp. 220, Documento, 20. FULTON, T.M.; CHUNWONGSE, J.; TANKSLEY, S.D. Microprep protocol for extraction of DNA from tomato and other herbaceus plants. Plant Molecular Biology Reporter. v.13, n.3, p , KIDWELL, K.K; OSBORN,T.C. Simple plant DNA isolation procedures. In: BECKMANN, J.S.; OSBORN, T.C. Plant genomes: Methods for genetic and physical mapping. ed. London: Kluwer Academic Publishers, p LODHI, M.A.; YE, G.N.; WEEDEN, N.F.; REISCH, B.I. A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars and Vitis species. Plant Molecular Biology Reporter, v.12, n.1, p.6-13, MANTELL, S.H.; MATTHEWS, J.A.; MCKEE, R.A. Princípios de biotecnologia em plantas: Uma introdução à engenharia genética em plantas, Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de Genética, p.344. MILACH, S.C.K. Marcadores moleculares em plantas, Porto Alegre:S.C.K. Milach, 1998.p.141. MOLINARI, H.B.; CROCHEMORE, M.L. Extração de DNA genômico de Passiflora spp. para análises PCR-RAPD. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v.23, n.2, p , ago MURRAY, M.G.; THOMPSON, W.F. Rapid isolation of high molecular weigth plant DNA. Nucleic Acids Research, Standford, v.8,n.19, p , NÓBREGA, M.B. de M.; MEDEIROS, A.C. de; MELLO, A.A. ; COSTA, J.N. da C.; SILVA, A. F. Extração de DNA genômico de alto peso molecular em cultivares de algodão (Gossypium spp L.). Resultados preliminares. In: Anais do Congresso Brasileiro de Algodão, 2., 1999, Ribeirão Preto. Anais... Campina Grande: EMBRAPA-CNPA, p ROBYT, J.F.; WHITE, B.J. Biochemical Techniques: Theory and practice. Ilinois: Waveland Press, p.407. ROGERS, H.J.; BURNS, N.A.; PARKERS, H.C. Comparison of small-scale methods for the rapid extraction of plant DNA suitable for PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter, v.14, n.2, p , 1996.

11 ANÁLISE COMPARATIVA DE QUATRO PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO 535 ROMANO, E. Extração de DNA de tecidos vegetais. In: BRASILEIRO, A.C.M.; CARNEIRO, V.T.C. ed. Manual de transformação genética de plantas. Brasília. Embrapa-SPI/Embrapa- CENARGEN p SAGHAI-MAROOF, M.A.; SOLIMAN, K.M.; JORGENSEN, R.A.; ALLARD, R.W. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. v.81, p , Dec., STEWART, C.N.JR.; VIA, L.E. A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications. BioTechniques, v.14, n.4, p , VROH BI, I.; HARVENGT, L.; CHANDELIER, A.; MERGEAI, G.; DU JARDIN, P. Improved RAPD amplification of recalcitrant plant DNA by the use of actived charcoal during DNA extraction. Plant Breeding, v.115, n.205, p , 1996.