OTIMIZAÇÃO DE UM PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA PARA O GÊNERO HIGROPHILA

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1 OTIMIZAÇÃO DE UM PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA PARA O GÊNERO HIGROPHILA Renata Borges Araujo 1 ; Isabela Pavanelli de Souza 2 ; Josana de Castro PeixotoMarcus 3 1 Bolsista PBIC/UEG, graduanda do Curso de Ciências Biologicas, UNUCET-UEG 2 Bolsista PVIC/UEG, graduanda do Curso de Ciências Biologicas, UNUCET-UEG 3 Orientador, docente do Curso de Ciências Biológicas e Farmácia,, UNUCET-UEG RESUMO A família Acanthaceae compreende cerca de 240 gêneros e espécies amplamente distribuídas em todo o mundo. As espécies de Acanthaceae ocorrem quase que exclusivamente nos trópicos e subtrópicos com distribuição em cinco centros de diversidade e riqueza: Indomalásia, Ásia, África Tropical e Madagascar e Américas incluindo os Andes e o Brasil. Os marcadores moleculares têm demonstrado eficácia na avaliação da variabilidade genética, pois são independentes das condições ambientais e mostram alto nível de polimorfismo, além de muito abundantes e com herança mendeliana, possibilitando uma descrição mais detalhada da estrutura genética de populações. Técnicas que fazem uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) têm acelerado o desenvolvimento de novos sistemas para obtenção de marcadores de DNA. Para utilização de uma técnica molecular como a citada é preciso contar com um DNA, íntegro e de qualidade. A maioria dos trabalhos que usam DNA genômico do gênero Hygrophyla, utilizam kits para a extração de DNA. Esses kits são caros e se tornam dispendiosos para estudo com grandes quantidades de indivíduos. Este trabalho consiste na otimização de um protocolo de extração de DNA para o gênero Hygrophyla, com base no reagente β - Mercaptoetanol, e CTAB. Serão testados concentrações diferentes de CTAB, NaCl e β - Mercaptoetanol, assim como novos reagentes que tendem a inibir a degradação do DNA genômico por fenóis e polifenóis. 1 Introdução A família Acanthaceae compreende cerca de 240 gêneros e espécies amplamente distribuídas em todo o mundo, sendo que o Novo Mundo possui uma representação de aproximadamente 85 gêneros e espécies conhecidas (Wasshausen, 2004). As espécies de 1

2 Acanthaceae ocorrem quase que exclusivamente nos trópicos e subtrópicos com distribuição em cinco centros de diversidade e riqueza: Indomalásia, Ásia, África Tropical e Madagascar e Américas incluindo os Andes e o Brasil. No Brasil ocorrem aproximadamente 40 gêneros e 500 espécies, tanto em áreas abertas quanto florestais (Souza & Lorenzi, 2005). Marcadores moleculares têm demonstrado eficácia na avaliação da variabilidade genética dentro e entre populações de plantas de uma espécie (Emygdio et al., 2003). Caracteres fenotípicos, tradicionalmente usados para estimar a diversidade genética, são de importância limitada, uma vez que são geralmente influenciados pelo ambiente (Tatineni et al., 1996). Os marcadores de DNA são independentes das condições ambientais e mostram alto nível de polimorfismo, além de muito abundantes e com herança mendeliana, possibilitando uma descrição mais detalhada da estrutura genética de populações (Williams et al., 1990; Borém, 1998). Técnicas que fazem uso da reação em cadeia da polimerase (PCR), têm acelerado o desenvolvimento de novos sistemas para obtenção de marcadores de DNA. Para utilização de uma técnica molecular como a citada é preciso contar com um DNA, íntegro e de qualidade. A maioria dos trabalhos que usam DNA genômico do gênero Hygrophyla, utilizam kits para a extração de DNA. Esses kits são caros e se tornam dispendiosos para estudo com grande quantidade de indivíduos. De acordo com Luciano (2004) existem vários métodos descritos na literatura, para extração de DNA a escolha dependerá do balanço entre a praticidade, qualidade e a finalidade de uso do ácido nucléico. De modo geral, os métodos e extração consistem dos seguintes passos: ruptura dos tecidos (através da trituração de tecidos congelados na presença de nitrogênio liquido ou gelo seco); liberação de componentes (celulares num tampão de lise da membrana com detergentes); inativação de nuclease (por esses detergentes e agentes quelantes (EDTA, ethilenodiamonotetraacetato). Este agente quelante imobiliza cátion de Mg, que são cofatores para várias endonucleases. A emulsificação da mistura de tampão e tecido com fenol ou clorofórmio leva a desnaturação das proteínas. Na extração de DNA de plantas, utiliza-se o PVP (polivinilpirrolidona) por possuir efeito antioxidante, e é adicionado para evitar a oxidação de polifenóis. O agente redutor ß- mercaptoetanol inibe a atividade de peroxidases e polifenoloxidases; remoção dos resíduos celulares e precipitação das proteínas por centrifugação. A desproteinização é obtida através de um tratamento com fenol ou clorofórmio, pois esses solventes orgânicos desnaturam as proteínas e enzimas, e são separadas após centrifugação, permanecendo na interface entre a fase aquosa (superior) contendo os ácidos nucléicos e a fase orgânica (inferior). Alguns protocolos incorporam proteases (proteína K) para facilitar a separação do DNA das proteínas da cromatina); recuperação dos ácidos nucléicos totais por precipitação em álcool e eliminação do RNA. Este trabalho consiste na otimização de um protocolo de extração de DNA para o gênero Hygrophyla, com base no reagente β -Mercaptoetanol, e CTAB. Serão testados 2

3 concentrações diferentes de CTAB, NaCl e β -Mercaptoetanol, assim como novas reagentes que tendem a inibir a degradação do DNA genômico por fenóis e polifenois. O trabalho teve como objetivo estabelecer uma metodologia de isolamento DNA genômico para o gênero Hygrophila, utilizando o reagente β -Mercaptoetanol, para análise em PCR... Material e Métodos O estudo do gênero Hygrophila foi baseado em coletas realizadas nos anos de Coleta das amostras, extração e quantificação do DNA: Coletou-se folhas de indivíduos das diferentes espécies neotropicais de Hygrophila amostradas em diferentes locais. Essas folhas foram colocadas em sacos plásticos com cristais de sílica gel. O DNA genômico foi extraído segundo o protocolo descrito por Ferreira & Grattapaglia (1998), com modificações e consiste em três fases: extração, lavagem com sal e lavagem com álcool. Sendo elas: I Etapa: EXTRAÇÃO DO DNA Nesta etapa de liberação de componentes, remoção de resíduos celulares, com precipitação de proteinas e inativação de nuclease, foram realizados testes para definir a concentração do β -Mercaptaetanol, em que seguirá os seguintes passos:. 1) Macerar as folhas em presença de nitrogênio líquido em microtubos de 1,5 ml (eppendorf), com auxílio de chave Phillips e adicionar µ L de CTAB 2% ou 4% que serão responsável pela liberação dos componentes (contendo 2 10 (sendo testado 2, 5, 8, 10) µ L/mL de β -Mercaptaetanol, agente redutor que inibe a atividade de peroxidases e olifenoloxidases); 2) Levar ao banho-maria a 65 C por min (invertendo a cada 5 minutos); 3) Acrescentar 500 µ L de Clorofórmio Iso-amilíco, invertendo durante 5 minutos; 4) Centrifugar a rpm durante 5min; 5) Transferir a fase líquida para outro microtubos; 6) Acrescentar 500 µ Lde Clorofórmio Iso-amilíco, invertendo durante 5 minutos; 7) Centrifugar a rpm durante 5min; 8) Transferir o sobrenadante para outro microtubos; 3

4 9) Colocar 350 µ L de 2-propanol (agitar por 5min) e levar ao freezer (-20 C) por no mínimo 1 hora para precipitar o DNA; II Etapa: LAVAGEM COM SAL Na lavagem como o sal foram testados diferentes concentração do Sal NaCl, em que: 1) Centrifugar e descartar o sobrenadante; 2) Colocar 500 µ L de NaCl 1-5 M, para lavar e depois resuspender o pellet; 3) Levar ao Banho-Maria a 65 C por 30 minutos 4) Levar a geladeira por 20 minutos e depois centrifugar novamente; 5) Transferir o sobrenadante para outro microtubos e colocar 340 µ L de 2-propanol; III Etapa: LAVAGEM COM ÁLCOOL 1) Centrifugar 2) Ressuspender o pellet com 1mL de etanol 70%;(Procedimento realizado duas vezes) 3) Centrifugar a rpm por 1 minuto; 4) Descartar o sobrenadante; 5) Acrescentar 1 ml de etanol absoluto; 6) Centrifugar por 1 minuto a rpm; 7) Descartar o sobrenadante; 8) Deixar secar por 20 minutos e depois acrescentar 100mL de TE. 9) Deixar sobre a bancada por pelo menos 1 hora; 10) Armazenar na geladeira. IV - Etapa: QUANTIFICAÇÃO DO DNA A quantificação de DNA será realizada comparando-se a concentração de amostras de DNA de cada individuo com amostra de DNA de fago λ na concentração de 50, 100 e 200 ng/µ L. As amostras serão submetidas à eletroforese em gel de agarose a 1,0% e a concentração das amostras de DNA serão obtidas comparando-se a fluorescência delas, coradas com BrEt (Brometo de etídio) e visualizadas sobre luz ultravioleta. Resultados e discussão O isolamento de DNA de plantas é uma etapa importante na análise da estrutura e organização do genoma de plantas. Independente do tipo de estudo molecular, as preparações de DNA devem produzir amostras puras suficientes para não inibir os tratamentos enzimáticos ou causar interferências nos padrões de migração em gel de eletroforese. A integridade do 4

5 DNA é fundamental para a nitidez e reprodutibilidade dos produtos de amplificação via reação de polimerase em cadeia (Mullis & Falooma, 1987). O DNA deve ser protegido da ação de compostos fenólicos, que oxidam o DNA irreversivelmente, tornando este inacessível às enzimas de restrição. A contaminação por compostos fenólicos pode ser evidenciada pela coloração do DNA que tende a ficar marrom. Para evitar o efeito oxidativo dos polifenóis deve ser adicionado ao tampão de extração agentes anti-oxidantes, como PVP (polivinilpirrolidona), BSA (albumina de soro bovino) ou β -Mercaptoetanol em protocolos de extração de DNA é de 2 µ l por Ml de CTAB. As amostras de Hygrophila, foram submetidas ao teste de quatro concentrações de β -Mercaptoetanol, em que as de 5µ l por ml de CTAB, proporcionaram uma quantidade de DNA extraído da amostra bastante relevante, pois a quantidade de material foi superior a 150 ng/μl. A utilização da etapa de lavagem com sal foi de extrema importância, pois NaCl em alta concentração auxilia na redução dos teores de polissacarídeos, polifenóis e compostos secundários. As amostras de Hygrophyla tinham aspecto gelatinoso e excessivamente viscoso no final do processo de extração. A inclusão de uma etapa de lavagem com NaCL (1M), melhorou a qualidade das amostras. Ao final dos experimentos pode ser observado que o protocolo otimizado proporcionou a obtenção de uma relevante quantidade de extração de DNA. Conclusão O protocolo estabelecido é eficiente para extração de DNA íntegro. As concentrações de β-mercaptoetanol utilizadas foram importante, pois esse reagente evita o efeito oxidativo dos polifenois. A lavagem com NaCL, favorece na eliminação das impurezas promovendo uma melhor visualização durante a quantificação do mesmo. Ao final dos experimentos pode ser visualizados géis com padrões elevados na quantidade de DNA, logo o objetivo deste trabalho foi alcançado. Referências Bibliográficas: 1. An update of Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders an families of flowering plants: APG II. Botanic Journal of the Linnean Society 141 (4), Avise, J. C Mitochondrial DNA Polymorphism and a Connection Between Genetics and Demography of Relevance to Conservation. Conservation Biology 9:

6 3. Avise, J. C The history and purview of phylogeography: a personal reflection. Molecular Ecology 7: Barroso, G. M., Peixoto, A. L., Costa, C. G., Ichaso, C. L. F., Guimarães, E. F., Lima, H. C Acanthaceae. Sistemática das Angiospermas do Brasil, v. 3, p Editora Universitária, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. 5. Bremekamp, C. E. B Notes on some acanthaceous genera of controversial position. Acta Botanica Neerlandica 4: Cameron, K.M Phylogeny and biogeography of Pogoniinae (Vanilloideae: Orchidaceae). North Amer. Nat. Orchid J. 5: Cameron, K.M Utility of plastid gene sequences for investigating intrafamilial relationships within Orchidaceae. Mol. Phylogenet. Evol. 31: Clement M.; Posada D.; Crandall K.A TCS: a computer program to estimate gene genealogies. Molecular Ecology 9: Cronquist, A An integrated system of classification of flowering plants. Columbia University Press, New York. 10. Cronquist, A Integrated System of classification of flowering plants. 2. ed. The New York Botanical Garden. 555p. 11. Desmesure, B.; Sodzi, N.; Petit, R. J A set universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants. Molecular Ecology 4: Diniz Filho, J. A. F Métodos Filogenéticos Comparativos. Ribeirão Preto: Holos. 64p. 11. Ezcurra, C Systematics of Ruellia (Acanthaceae) in Southern South America. Annal Missouri Botanical Garden 80: Ferreira, M. E.; Grattapaglia, D Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3. ed. Brasília: Embrapa Cenargen, 220p. 13. Hall, T.A BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. 6