GERMINAÇÃO E DESENVOLVIMENTO PÓS-GERMINATIVO IN VITRO DE CALENDULA OFFICINALIS L. SOB DIFERENTES QUALIDADES DE LUZ

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1 Página 81 GERMINAÇÃO E DESENVOLVIMENTO PÓS-GERMINATIVO IN VITRO DE CALENDULA OFFICINALIS L. SOB DIFERENTES QUALIDADES DE LUZ Cristiane Pimentel Victório 1 ; Celso Luiz Salgueiro Lage 2 RESUMO O objetivo do trabalho foi avaliar a germinação in vitro e desenvolvimento inicial das plântulas de Calendula officinalis sob efeito de diferentes qualidades de luz: branca, azul, vermelha, verde e condição de escuro, possibilitando o início da cultura in vitro e obtenção de material vegetal selecionado, sob condições assépticas e padronizadas. A incidência das luzes branca e azul resultou em maior porcentagem de germinação das sementes que atingiu valores máximos de 57%. Mas a germinação aconteceu tanto sob luz como no escuro (25%). Após germinação, foi verificada baixa porcentagem de enraizamento das plântulas sob luz verde ao longo de 30 dias, mostrando padrão semelhante à condição de escuro nos primeiros 15 dias. Os dados para o peso fresco foi reduzido para as plântulas mantidas no escuro. Os parâmetros de desenvolvimento vegetal avaliados não mostraram diferenças significativas entre os tratamentos de luz, com exceção da redução do enraizamento sob luz verde. As plântulas atingiram altura entre 4 e 5 cm, com 30 dias. Unitermos: cultura de tecidos vegetais, luz verde, luz vermelha, planta medicinal IN VITRO GERMINATION AND SEEDLING OF CALENDULA OFFICINALIS L. UNDER DIFFERENT LIGHT QUALITIES ABSTRACT The objective was to evaluate the in vitro germination and seedlings of Calendula officinalis under effect of different light qualities: white, blue, red, green, and darkness, allowing starting in vitro cultures and acquisition of selected plant material, under aseptic and standardized conditions. The incidence of white and blue lights resulted in a higher percentage of seeds germination that reached maximum values of 57%. Germination occurred under light and darkness (25%). After germination, it was observed low rooting percentage of seedlings under green light within 30 days, similar pattern compared to dark condition in the first 15 days. Data of fresh weight was reduced to seedlings kept under dark condition. Evaluated parameters for plant development showed no significant differences among light treatments, except for the reduction of rooting under green light. The plantlets reached between 4 and 5 cm height within 30 days. Uniterms: green light, medicinal plant, plant tissue culture, red light INTRODUÇÃO A germinação se inicia com a absorção de água pelas sementes, subseqüente reativação metabólica e mobilização das reservas nutritivas do embrião, e se finda com o alongamento da radícula em direção ao substrato (Bewley, 1997). A luz está entre os principais fatores abióticos que regulam a germinação de sementes, junto com a temperatura e a umidade (Lima et al., 2006; Victório& Lage., 2009). Da mesma forma, parâmetros do desenvolvimento vegetal são influenciados pela variação qualitativa e quantitativa de luz. A ação da luz na regulação fisiológica do vegetal ocorre mediante a absorção de diferentes qualidades de luz por famílias de fitocromos, criptocromos e/ou fototropinas (Franklin, 2009). 1 Bióloga, Doutora em Ciências Biológicas (Biofísica). UFRJ/IBCCF/ Laboratório de Fisiologia Vegetal/CCS. Endereço para correspondência: Bloco G, Av. Carlos Chagas Filho, s/n, Cidade Universitária, Ilha do Fundão, , Rio de Janeiro - RJ, cris.pvictor@gmail.com. 2 Físico, Douto em Ciências Biológicas (Biofísica). UFRJ/IBCCF/Laboratório de Fisiologia Vegetal, CCS, clslage@biof.ufrj.br 81

2 Página 82 A Calendula officinalis L. (Asteraceae) é uma planta herbácea originária do continente europeu que apresenta diferentes substâncias químicas de interesse terapêutico: óleos essenciais, saponinas, fitosterinas, triterpenos e flavonóides (Danielski et al., 2007; Victório et al., 2008). Devido à ampla ação medicinal, a espécie C. officinalis é de interesse para as indústrias fitoterápicas e cosméticas, o que representa um aspecto relevante nos estudos de cultura de tecidos vegetais, em vista da necessidade de padronização e suprimento de matéria-prima fidedigna para a produção de drogas vegetais e formulações fitoterápicas (Tabela 1) (Balducci-Roslindo et al., 1999; Silva, 2001; Lima et al., 2001; Hamburger et al., 2003; Victório et al., 2008). Além disso, a micropropagação viabiliza a avaliação dos parâmetros fisiológicos e morfológicos do desenvolvimento vegetal, sob condições físicas padronizadas. A germinação é uma etapa importante para iniciação das culturas in vitro. Logo, este trabalho teve o objetivo de avaliar a germinação in vitro e desenvolvimento inicial das plântulas de C. officinalis sob efeito de diferentes qualidades de luz, visando à introdução in vitro e posterior propagação em massa da espécie. Tabela1 Produtos fitoterápicos obtidos a partir de plantas oriundas de cultura de tecidos vegetais. Espécies Nome popular Usos Produtos* Referência Senecio cineraria DC. cinerária catarata, conjuntivites Colírio Silva, 2001 Polygonum acre H.B.K. var. aquatile erva-de-bicho varizes inflamadas, úlceras varicosas, hemorróidas Pomadas e comprimidos Lima et al., 2001 Calendula officinalis L. calêndula cicatrizante, antiinflamatório, anti-séptico *Produtos comercializados no Brasil. Pomadas, cremes Victório et al., 2008 MATERIAL E MÉTODOS Desinfestação e germinação in vitro Os aquênios de C. officinalis foram obtidos comercialmente da Feltrin (tratadas com 0,15% de Captan 75). Para viabilizar a germinação, o pericarpo foi retirado dos aquênios com o auxílio de uma pinça. Posteriormente, foi feito o procedimento de desinfestação das sementes em fluxo laminar: imersão em álcool 70% (1min), detergente comercial (15min), hipoclorito de sódio 20% (45s) e introdução no meio de cultura (Victório et al., 2008). Após cada etapa, as sementes eram lavadas em água destilada estéril. As sementes foram inoculadas em tubos de ensaio (145 x 22 mm) contendo 20 ml de meio MS (Murashige & Skoog, 1962) estéril reduzido à metade das soluções NH 4 NO 3 e KNO 3 que contem nitrogênio e suplementado com 30 g.l -1 de sacarose, vitaminas (tiamina HCl - 1,3 µm, piridoxina 3 µm e ácido nicotínico - 4,1µM), mio-inositol - 0,6 mm e solidificado com 7 g.l -1 de agar, em ph 5,8. As sementes foram mantidas sob temperatura de 25 ± 2 o C, fotoperíodo de 16h. O delineamento experimental foi ao acaso, com quatro repetições com aproximadamente 25 sementes. As sementes foram submetidas à condição de escuro e quatro condições de luz: branca (controle nm, 20 µmol.m -2.s -1 ), azul ( nm, 17 µmol.m -2.s - 1 ), vermelha ( nm, 12 µmol.m -2.s -1 ) e verde ( nm, 12 µmol.m -2.s -1 ). Todas as qualidades de luz foram obtidas a partir de uma lâmpada fluorescente (Sylvania, F-20 W T-12) por prateleira. As irradiâncias foram obtidas utilizando um medidor de quantum (Biospherical Instruments Inc., QSL-100). A ausência de luz foi obtida cobrindo os tubos com papel alumínio, e posteriormente as sementes foram colocadas em prateleira sem iluminação. As sementes foram mantidas em sala de crescimento a temperatura de 25 ± 2 o C. A avaliação da germinação foi feita diariamente durante 15 dias. Foram observados os parâmetros percentagem de germinação (GER), representada pela porcentagem total de sementes germinadas após 15 dias; índice de velocidade de emergência (IVE), a partir de contagens diárias das plântulas emergidas durante 15 dias e o tempo médio da germinação (TMG) calculado segundo Labouriau (1988) com base no número de sementes germinadas diariamente durante 15 dias. As plântulas obtidas após o segundo dia da 82

3 Página 83 inoculação das sementes, sob luz branca, foram avaliadas a cada 2 dias e tiveram seu alongamento medido até 15 dias. Desenvolvimento in vitro de C. officinalis Transcorridos 15 e 30 dias da germinação, as plântulas com até duas folhas foram avaliadas segundo os parâmetros: altura da plântula (cm), porcentagem de enraizamento (%) e peso fresco (g). A altura das plântulas foi mensurada utilizando um paquímetro. O delineamento experimental foi ao acaso, com três repetições com aproximadamente 10 plântulas, em esquema fatorial 5 x 3. Análises Estatísticas Para as análises estatísticas foi utilizado o teste da diferença entre duas porcentagens (p 1 e p 2 ), ao nível de significância (p<0,05) para os valores em porcentagem e para as médias a análise de variância (ANOVA) com comparações estatísticas pelo teste de Tukey, p <0,05. RESULTADOS E DISCUSSÃO O procedimento de imersão em álcool 70% antes do prosseguimento da desinfestação das sementes reduziu a incidência média de culturas contaminadas para 3,25 %. A germinação de C. officinalis é epígena e o processo germinativo iniciou-se a partir do segundo dia, sob luz branca, e estendeu-se até o 15º dia, no qual foi verificado 57% de germinação. Na ausência de luz, as sementes apresentaram reduzida germinabilidade (25%). As sementes de C. officinalis podem ser classificadas como não fotoblásticas ou indiferentes a luz. Embora não apresentando fotoblastismo positivo ou negativo, a sensibilidade das sementes à luz pode variar com base nas formas do fitocromo que são ativados ou inativados conforme a absorção de luzes com diferentes relações de vermelho e vermelho extremo (Takaki, 2001). A porcentagem de germinação sob luz azul (57%) foi semelhante a obtida sob luz branca. A luz verde e vermelha induziu 39% e 36% de germinação, respectivamente, valores mais baixos comparados ao tratamento com luz branca. A redução na porcentagem de germinação de C. officinalis sob luz verde e vermelha sugere uma inibição do fitocromo por estas qualidades de luz. A maior porcentagem de germinação sob luz verde quando comparado a condição de ausência de luz indica que ao menos para a espécie C. officinalis não se pode considerar-la como luz de segurança. O tempo médio de germinação para todos os tratamentos de luz foi de 9 a 10 dias (Tabela 2). As sementes sob luz verde apresentaram maior TMG e menor IVE. Enquanto as sementes mantidas sob luz azul apresentaram menor tempo médio e maior velocidade de germinação. Tabela 2 - Avaliação da porcentagem de germinação (GER), velocidade (IVE) e tempo médio de germinação (TMG) na germinação in vitro de C. officinalis, cultivada in vitro sob diferentes qualidades de luz, período de 15 dias. Qualidade de luz GER (%) TMG (dias) IVE Branca (controle) 57a 9,35 0,106 Vermelha 36b 9,53 0,105 Azul 57a 9,03 0,110 Verde 39b 10,3 0,007 Escuro 25c - - Diferentes letras para mesma coluna indicam diferenças significativas, p<0,05. Desenvolvimento inicial in vitro de C. officinalis As plântulas oriundas da germinação atingiram altura média entre 2,4 cm (luz azul) e 3,0 cm (escuro) ao final de 15 dias (Figura 1A). Para as plântulas sob luz branca que foram avaliadas a cada 2 dias, o maior aumento em altura a partir do segundo dia no qual se verificou a germinação, 83

4 Página 84 ocorreu entre o 4º e 6º dia (0,68 cm) in vitro, após a germinação. Depois deste período as plântulas cresceram mais 1,52 cm ao longo de 6 dias. Com 15 dias as plântulas mantidas sob luz verde e na condição de escuro apresentaram maior crescimento, mostrando no início um rápido processo de estiolamento. Características como estiolamento e fragilidade são comuns em plantas cultivadas na ausência de luz. Após 30 dias, as plântulas mantidas sob luz vermelha, luz branca e condição de escuro mostraram uma maior diferença em crescimento em relação a 15 dias de cultivo (2,0; 1,7 e 1,7 cm, respectivamente). No entanto, não foi verificada diferenças estatísticas para a altura das plântulas entre os tratamentos para cada 15 ou 30 dias (Figura 1A). A presença de luz ou ausência não resultou em variações significativas no crescimento inicial de C. officinalis, evidenciando que neste estágio inicial a plântula ainda é dependente das reservas nutritivas do cotilédone. No entanto, na ausência de luz as plantas apresentaram o menor peso fresco (Figura 1C) que pode indicar a baixa produção de substâncias orgânicas em relação às plantas mantidas sob luz. Apesar da luz não ser necessária para a germinação das sementes desta espécie, as plântulas obtidas dos testes conduzidos no escuro apresentaram redução significativa em parâmetros do desenvolvimento vegetal como enraizamento e peso fresco em relação aos experimentos conduzidos sob luz. O enraizamento das plântulas mantidas na condição de escuro e luz verde foi baixíssimo após 15 dias, ao contrário dos resultados para outras qualidades de luz após mesmo período (Figura 1B). A qualidade de luz se mostrou um fator importante na rizogênese. Pode-se sugerir que a luz possibilitou a aquisição de cadeias de carbono do meio de cultura para produção de metabólitos primários e especiais o que contribui também para o melhor desenvolvimento vegetal. Aos 30 dias, a porcentagem de enraizamento sob condição de escuro aumentou para 48%, como se até 15 dias as regiões basais das plântulas estivessem em estado de dormência. Bertazza et al. (1995) sugeriram o envolvimento da luz vermelha na indução da rizogênese em Pyrus communis. Sabe-se que a luz afeta a morfogênese e consequentemente a produção de raízes, mas até então o presente estudo é o primeiro relato mostrando a inibição do enraizamento ante a incidência de luz verde. O alongamento dos brotos foi reduzido para as plântulas sob luz azul, embora sem diferenças significativas. A redução do alongamento de brotos e do entrenó tem sido observado como resposta a absorção de luz azul por criptocromos (Lin, 2000; Muleo e Morini, 2008). 84

5 Página 85 alltura das plântulas (cm) A Branca Vermelha Azul Verde Escuro 15 dias 30 dias enraizamento (%) B * * * Branca Vermelha Azul Verde Escuro dias 30 dias C peso fresco (g) * 0.0 Branca Vermelha Azul Verde Escuro 30 dias Figura 1-Desenvolvimento in vitro de plântulas de C. officinalis sob diferentes qualidades de luz e escuro, após 15 e 30 dias da germinação (25±2 o C). A. Altura das plântulas; B. Enraizamento (%); C. Peso fresco (g). *Diferença estatística entre os tratamentos de luz, para 15 e 30 dias, em separado. Teste de Tukey, p<0,05, n 30. CONCLUSÃO As sementes de C. officinalis germinam tanto na condição de claro quanto de escuro. Os resultados obtidos para germinação de sementes de C. officinalis mostraram que as qualidades de luz vermelha, azul e verde induziram menores índices de germinação em relação à luz branca, não favorecendo a germinação da espécie. O desenvolvimento inicial das plântulas de C. officinalis sob as diferentes qualidades de luz evidenciou diferenças em relação ao enraizamento para as plântulas mantidas sob luz verde que foi 85

6 Página 86 significativamente menor em relação aos outros tratamentos de luz. Comparando as condições de claro e escuro, as principais diferenças foram para peso fresco e enraizamento. AGRADECIMENTOS CAPES, FAPERJ, FINEP e Laboratório Simões Ltda. REFERÊNCIAS Balducci-Roslindo, E.; Silvério, K. G.; Malagoli, D. M. (1999). Processo de reparo em feridas de extração dentária em camundongos tratados com o complexo Symphytum officinale e Calendula officinallis. Revista Odontologia Universidade de São Paulo, 13(2): Bertazza, G.; Baraldi, R.; Predieri, S. (1995). Light effects on in vitro rooting of pear cultivars of different rhizogenic ability. Plant Cell Tissue Organ Cult., 41, Bewley, J. D. (1997). Seed germination and dormancy. Plant Cell, 9: Danielski, L., Campos L.M.AS., Bresciani, L.F.V, Hense, H., Yunes, R.A.; Ferreira, S.R.S. (2007). Marigold (Calendula officinalis L.) oleoresin: solubility in SC-CO 2 and composition profile. Chemical Engineering and Processing, 46(2): Franklin, K.A. (2009). Light and temperature signal crosstalk in plant development. Curr. Opin. Plant Biol., 12(1): Hamburger, M.; Adler, S.; Baumann, D., Forg, A.; Weinreichb, B. (2003). Preparative purification of the major anti-inflammatory triterpenoid esters from Marigold (Calendula officinalis). Fitoterapia, 74: Labouriau, L. G. (1988). A germinação de sementes. Washington: Organização dos Estados Americanos. Lima, S.S.; Esquibel, M.A.; Henriques, A.B.; Silva, F.O.; Silva, P.H.B.; Lage, C.L.S. (2001). Monoclonal culture of erva-de-bicho (Polygonum acre H. B. K. var. aquatile) for commercial scale production of a phyto-therapeutic medicine. Braz. J. Med. Plants, Botucatu, 4(1): Lima, D. J; Almeida, C. C.; Dantas, V. A. V.; Silva, B. M. S.; Moraes, W. S. (2006). Effect of temperature and substrate on seed germination of Caesalpinia ferrea Mart. Ex Tul. (Leguminosae, Caesapinoideae). Revista Árvore, 30(4): Lin, C. (2000). Plant blue-light receptors. Trends Plant Sci. 5, Muleo, R.; Morini, S. (2008). Physiological dissection of blue and red light regulation of apical dominance and branching in M9 apple rootstock growing in vitro. J. Plant Physiol., 165(17): Murashige, T.; Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant.,15: Silva, N.C.B. (2001). Senecio cineraria (DC): abordagens biofísica e biotecnológica na obtenção de um produto fitoterápico. Rio de Janeiro - RJ, 117p. Dissertação de Mestrado Programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), Universidade Federal do Rio de Janeiro. 86

7 Página 87 Takaki, M. (2001). New proposal of classification of seeds based on forms of phytochrome instead of photoblastism. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, 13(1): Victório, C.P.; Sato, A.; Esquibel, M.A.; Lage, C.L.S. (2008). Sucrose on in vitro cultures of Calendula officinalis L. Plant Cell Cult. Micropropag., 4(1): Victório, C.P.; Lage, C.L.S. (no prelo). Light quality effects on in vitro germination and initial development of Phyllanthus tenellus. Revista Ciência Agronômica. 87