Utilização do Corante Rosa Bengala no Método de Preparação Úmida para Avaliação Morfológica de Sêmen Ovino

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1 Rev. Cient. Prod. Anim., v.0, n.2, p.74-80, 2008 Utilização do Corante Rosa Bengala no Método de Preparação Úmida para Avaliação Morfológica de Sêmen Ovino Liliane Moreira Silva, Cleidson Manoel Gomes da Silva, Tânia Vasconcelos Cavalcante 2, Jorge Luís Ferreira 2, José Adalmir Torres de Souza 3 RESUMO Esta pesquisa foi realizada visando-se comparar a eficiência do método de preparação úmida corada com rosa bengala, avaliado sob microscopia óptica, com o método convencional de preparação úmida, na identificação das anormalidades em células espermáticas ovinas. Foi utilizado o sêmen de 25 carneiros adultos da raça Santa Inês. Após exame andrológico, a morfologia espermática dos animais foi avaliada por dois métodos: preparação úmida convencional, observada sob microscopia de contraste de fase (Leitz, Germany) (controle) e preparação úmida corada com rosa bengala, analisada sob microscopia óptica comum (Bioval, USA), ambos com aumento de 400x. A comparação entre o método de preparação úmida convencional (4,28±2,73) e corado com rosa bengala (4,69±2,58) não apresentou diferença significativa (P>0,05), quanto ao percentual médio de defeitos totais. Dessa forma, o método de coloração rosa bengala apresenta-se viável na avaliação das patologias espermáticas em sêmen ovino, sendo, portanto uma alternativa a ser usada no exame andrológico, principalmente em condições de campo. Palavras-chave: patologia espermática, exame andrológico Use of Bengal Rose Dye in Humid Preparation as a Method of Morphological Evaluation of Sperm Sheep ABSTRACT - The objective of the present work was to compare the effectiveness of the humid preparation method dyed with bengal rose with the conventional humid preparation method in the identification of abnormalities in sheep sperm cells. The semen of 25 adult Santa Inez ram were used. After andrologic examination, the sperm morphology of the animals were evaluated by two methods: conventional humid preparation observed under phase-contrast microscopy (Leitz, Germany) (control) and humid preparation dyed Bolsista de PIBIC/UFT. (liligomesvet@hotmail.com) 2 Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia/UFT. (cavalcante.tv@gmail.com) 3 CCA/UFPI. (adalmir@ufpi.br) 74

2 with bengal rose analyzed under common optic microscopy (Bioval, USA), being both observed in an increase of 400x. The comparison between conventional humid preparation method (4.28±2.7) and rose bengal dye (4.69±2.58) presented no significant difference (p>0.05) on the average percentage of total defects. Hence, the bengal rose method is considered viable on the evaluation of sperm pathologies in ram semen and is therefore an alternative to be used in andrologic tests under field conditions. Key Words: sperm pathology, andrologic examination Introdução Os ovinos (Ovis aries) têm sido explorados mundialmente pela excelente qualidade de carne e lã, principalmente em países em desenvolvimento. Assim, inúmeras pesquisas têm sido desenvolvidas para o aprimoramento de biotecnologias associadas à reprodução desses animais, com o objetivo geral de garantir o beneficiamento e conservação do sêmen para fins de inseminação artificial, transferência de embriões e fertilização in vitro nessa espécie (De Pauw et al., 2003). Neste sentido, o desenvolvimento de novas metodologias e estratégias que permitam predizer a capacidade fecundante do sêmen ovino torna-se cada vez mais importante (Nunes, 998). Nas últimas décadas os métodos mais sofisticados utilizados para a avaliação da viabilidade espermática são Computer Assisted Sperm Analyses (CASA) (Gravance et al., 995), citometria de fluxo (Harrison e Vickers, 990), microscopia de fluorescência (Centola et al., 990) e microscopia de contraste de fase. Esses métodos, apesar de serem mais recomendados, ainda possuem um grande entrave quanto ao uso prático na rotina veterinária, principalmente devido ao alto custo dos equipamentos (Medeiros et al., 2006). Dessa forma, surge à necessidade de se desenvolver novas técnicas que permitam uma boa visualização do contorno e divisões da célula espermática, permitindo identificar alterações na morfologia (Chemineau et al., 99), de forma simples, prática, com baixo custo e, principalmente, que seja aplicável a campo. Dentre essas técnicas pode-se destacar a utilização de corantes, que têm sido descritos para avaliar a viabilidade espermática sob preparação úmida (Rodrigues e Rodrigues, 998) e/ ou através da confecção de esfregaços (Galvani et al., 2000). Na espécie ovina, diversos corantes, eosina-nigrosina (Colas, 980), Williams modificado (Vale Filho, 980), coloração de Karras (CBRA, 998) e vermelho congo (Aguiar et al., 994), têm sido utilizados na confecção de esfregaços para examinar 75

3 a morfológica espermática. No entanto, na literatura ainda não existem relatos da utilização do rosa bengala como corante de espermatozóide ovino em preparação úmida. Esta pesquisa foi realizada com o objetivo de se comparar a eficiência do método de coloração de rosa bengala em preparação úmida, avaliado sob microscopia óptica, com o método convencional de preparação úmida, observada em microscopia de contraste de fase, na identificação das anormalidades em células espermáticas ovinas. Material e Métodos Esta pesquisa foi realizada no Laboratório de Reprodução Animal da Universidade Federal do Tocantins, localizado no Campus de Araguaína-TO. Coletou-se sêmen de 25 reprodutores ovinos da raça Santa Inês provenientes de rebanhos criados em regime extensivo, na região Sul do Estado de Tocantins, nos municípios de Cariri, Formoso e Dueré, com idade superior a oito meses, escore de condição corporal 2,5 a 3,5 (escala 0-5) e clinicamente saudáveis. Após a coleta com vagina artificial, os ejaculados foram identificados e imediatamente avaliados quanto ao volume (ml), cor (perolado para espécie ovina), odor (sui generis), aspecto (cremoso, leitoso ou aquoso), turbilhonamento (0-5), vigor (0-5), motilidade total (0-00%) e concentração, utilizando uma câmara de Neubauer (espermatozóides/mm 3 ), segundo metodologia proposta pelo CBRA (998). Concomitante às análises, 0 μl de sêmen de cada reprodutor foi diluído em ml de solução formol salina (SFS) e, em seguida, identificado e transportado imediatamente ao laboratório, onde permaneceu estocado à temperatura de 4ºC até realização da análise morfológica. A morfologia espermática foi realizada seguindo-se duas técnicas: preparação úmida convencional (controle) e preparação úmida corada com rosa bengala. Na primeira técnica, apenas 0 μl de sêmen previamente diluído em SFS foi depositado sobre lâmina, coberto com lamínula e, em seguida, analisado sob microscopia de contraste de fase (Leitz, Germany). Na segunda, após colocar 0 μl de sêmen sobre lâmina, 0 µl do corante rosa bengala foi adicionado, homogeneizou-se e, em seguida, cobriuse com lamínula, retirando-se o excesso com papel absorvente. Após um minuto procedeu-se a avaliação sob microscopia óptica comum (Bioval, USA). Em ambas as técnicas, um total de 200 células em duplicata, pertencentes à mesma amostra, foram contadas em aumento de 400x. A análise morfológica foi classificada, 76

4 segundo Blom (973), em defeitos maiores, menores e totais. As diferenças entre o percentual médio de patologias espermáticas foram avaliadas pela ANOVA, adotando-se o procedimento NPARWAY do pacote estatístico SAS (2002), considerando o efeito fixo de método de avaliação da morfologia espermática sobre as variáveis dependentes: defeitos maiores, menores e totais, transformados para (x + 0,5). As médias foram comparadas pelo teste de Mann-Whitney-Wilcoxon (P<0,05). Resultados e Discussão Os valores médios dos parâmetros seminais volume, turbilhonamento, vigor, motilidade e concentração, dos 25 reprodutores ovinos estão apresentados na Tabela. Todos os parâmetros avaliados estão de acordo com os valores estabelecidos pelo CBRA (998). Tabela - Valores médios e desvio padrão referentes aos parâmetros seminais de 25 reprodutores ovinos da raça Santa Inês Vol = volume, 2 Tur = turbilhonamento. O número de defeitos obtidos com adoção das duas técnicas está apresentado na Tabela 2. Não houve diferença (P>0,05) no percentual de defeitos menores, maiores e totais, entre as técnicas (preparação úmida convencional 4,28±2,73% e preparação úmida com rosa bengala 4,69±2,58%). Barkawi et al. (2006) e Zamiri e Heidari (2006), obteram percentuais de defeitos totais em sêmen caprino fresco corado com eosina-nigrosina de 3,5 e 9,85%, respectivamente. Os resultados deste estudo e dos autores citados encontram-se dentro do limite aceitável para as duas espécies que é no máximo de 20% para defeitos totais. Viu et al. (2005), não verificaram diferenças no percentual de morfologia espermática de bovinos quando utilizaram o corante panótico em preparação úmida, observada em microscopia óptica, quando comparada à microscopia de contraste de fase. Os percentuais de patologias de cabeça, peça intermediária e cauda estão apresentados na Tabela 3. Não houve diferença (P>0,05) no percentual de patologias espermáticas entre a técnica convencional e a preparação úmida 77

5 Tabela 2 - Percentual médio e desvio padrão de patologias espermáticas em sêmen de ovinos Santa Inês, avaliadas sob preparação úmida convencional e preparação úmida corada com rosa bengala Segundo a classificação de Blom (973). * Médias seguidas da mesma letra nas colunas, não diferem entre si, pelo teste de Mann- Whitney-Wilcoxon (P>0,05). com rosa bengala, estando os valores em consonância aos estabelecidos pelo CBRA (998). Resultados semelhantes a morfologia espermática foram descritos por Medeiros et al. (2006), ao verificarem que não há diferenças quanto à integridade de membrana e tipo de patologia encontrada em células espermáticas de ovinos. Tabela 3 - Percentual de patologias espermáticas em sêmen de 25 reprodutores ovinos da raça Santa Inês, avaliados sob preparação úmida convencional e preparação úmida corada com rosa bengala Médias seguidas da mesma letra nas colunas, não diferem entre si, pela ANOVA (P>0,05). Pela técnica convencional e por preparação úmida com rosa bengala foi possível a análise das células espermáticas, obtendo-se alta nitidez do contorno celular, permitindo-se identificar alterações na morfologia. Essa característica também foi observada por Rodrigues e Rodrigues (998) ao analisarem a viabilidade do sêmen de cães, observando boa qualidade das lâminas confeccionadas. Resultados semelhantes também foram descritos por Galvani et al. (2000) em esfregaços de sêmen de touro Nelore utilizando o corante rosa bengala. Além disso, Streit Júnior et al. (2004), ao analisarem sêmen descongelado de peixe utilizando o corante rosa bengala, obtiveram melhor definição celular, quando comparado com o vermelho congo 78

6 e Williams modificado. Conclusão O corante rosa bengala em preparação úmida é um método eficiente para avaliação morfológica de sêmen ovino, apresentando os principais pré-requisitos para realização de uma boa coloração, como formulação correta do corante, praticidade na aplicação da técnica e, principalmente, baixo custo da metodologia, podendo ser aplicada a campo. Referências Bibliográficas AGUIAR, P.H.P.; COSTA, M.E.L.T.; ABREU, J.J. et al. Coleta e avaliação de sêmen canino. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.46, n.5, p , 994. BARKAWI, A.H.; ELSAYED, E.H.; ASHOUR, G. et al. Seasonal changes in semen characteristics, hormonal profiles and testicular activity in Zaraibi goats. Small Ruminant Research, v.66, n.-3, p , BLOM, E. The ultrastructure of some characteristic sperm defects and a proposal for a new classification of the bull spermiogram. Nordisk Veterinaer Medicin, v.25, n.7, p , 973. CENTOLA, G.M.; MATTOX, J.H.; BURDE, S. et al. Assesment of the viability and acrossome status of fresh and frozen-thawed human spermatozoa using single-wave-length fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development, v.27, n. 2, p.30-35, 990. CHEMINEAU, P.; CAGNIE, Y.; GUÉRIN, Y. et al. Training Manual on Artificial Insemination in Sheep and Goats. 2.ed., Rome: FAO, p. COLAS, G. Variations saisonnieres de la qualité du sperme chez le belier Ile-de- France. Etude de la morphologie cellulaire et de la motilité massale. Reproduction Nutrition Development, v.20, n.-2, p , 980. COLÉGIO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL. CBRA. Manual para Exame Andrológico e Avaliação do Sêmen Animal. 2. ed., Belo Horizonte: CBRA, p. DE PAUW, I.M.C.; VAN SOOM, A.; MAES, D. et al. Effect of sperm coating on the survival and penetrating ability of in vitro stored bovine spermatozoa. Theriogenology, v.59, n.5-6, p.09-22,

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