Uma Abordagem de Alinhamento Múltiplo de Sequências Utilizando Evolução Diferencial

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1 Uma Abordagem de Alinhamento Múltiplo de Sequências Utilizando Evolução Diferencial Antônio L. V. da Silva Júnior 1, Rodrigo G. de Souza 1, Ricardo Yara 1, and Wellington P. dos Santos 1 1 Departamento de Engenharia Biomédica, Universidade Federal de Pernambuco, Brasil wellington.santos@ufpe.br Abstract Multiple sequence alignment (MSA) is one of the most important tasks in bioinformatics. The MSA is a fundamental technique for study of function, structure and evolution of biomolecules. From the use of MSA methods are possible the creation of statistical models for classification of protein families, phylogenetic analysis and the prediction of secondary structures of proteins. Considered as a problem of type NP-hard, the complexity of MSA becomes infeasible the use of exact methods to search for optimal solutions. Because of this it is important to use methods of optimization based heuristic to solve the problem of MSA. In this paper, we propose an approach to multiple sequence alignment by optimizing an objective function using Differential Evolution. Although the idea of using Evolutionary Algorithms is not new, the approach presented differs from the use of Differential Evolution and definition of alignment as a dispersion of gaps along the sequences, without considering the biological events such as insertion or emergence of bases, deletion or mutation of bases. The proposed solution has proven to be able to make significant improvements in alignments when compared to state-of-the art Clustal method. Keywords multiple sequence alignment, bioinformatics, evolutionary computing, differential evolution. I. INTRODUÇÃO O alinhamento múltiplo de sequências (Multiple Sequence Alignment, MSA) é um dos mais fundamentais e mais desafiadores problemas em biologia computacional. O MSA é uma técnica utilizada para o estudo da função, estrutura e evolução de biomoléculas. Algumas das aplicações do MSA estão na análise filogenética [1], na criação de modelos estatísticos para classificação de famílias de proteínas [2], na predição de estruturas secundárias de proteínas [3] e em ferramentas de extração de similaridade entre sequências [4]. Considerado como um problema do tipo NP-difícil [5], [6], a complexidade do MSA torna inviável o uso de métodos exatos para busca de soluções ótimas. Portanto, são usualmente utilizadas as seguintes estratégias: Alinhamentos Progressivos [7], destacando-se o Clustal [8] [10], MUSCLE [11], [12] e T-COFFE [13]; e os Algoritimos Iterativos onde se destaca a utilização de meta-heurísticas, como as dos Algoritmos Evolucionários (AE) [14], sendo SAGA [15], COFFE [16] e PWMAligner [17] os mais conhecidos. Inspirados nos principios da evolução natural de Darwin e na genética, os AEs são direcionados a encontrar ótimos globais, evitando a parada prematura em ótimos locais. Existem várias formas de AEs, dentre as que se aplicam a este trabalho podemos citar: Algoritmos Genéticos (Genetic Algorithmns, GA) [18] e os algoritmos de Evolução Diferencial (Differential Evolution, DE) [19], [20]. A utilização de AEs na solução de problemas de MSA tem-se apresentado com relativa frequência no estado da arte: Xhang e Wong [21], em 1997, apresentaram uma solução baseada no alinhamento exato de colunas, alcançando bons resultados. Contudo, a solução limita-se ao tratamento de sequências com alto grau de similaridade. Thomsen, Fogel e Krink [9], em 2002, apresentaram uma solução que utilizava como entrada alinhamentos já executados pelo Clustal V [10], com o objetivo de melhorar resultados já alcançados. Zhang e Huang [22], em 2004, propulseram um GA tendo uma estratégia de inicialização da população e um esquema de operador de cruzamento baseados em um ponto. Meshoul et al. [23] e Abdesselem et al. [24] propuseram, respectivamente em 2005 e 2006, algoritmos que mesclam conceitos de computação quântica e algoritmos evolucionários com o objetivo de obter melhores resultados. Ainda em 2006, Hu [25] apresentou uma solução utilizando uma forma híbrida de DE (Chaosdifferential evolution, CDE), a fim de evitar a convergência prematura do processo de busca. Gondro e Kinghorn [26], em 2007, propuseram um GA tendo dois operadores para crossover, um para combinações horizontais e outro para combinações verticas, e quatro operadores de mutação, todos operando sobre lacunas do alinhamento, garantindo resultados superiores ao do ClustalW [8]. A desvantagem deste esquema é o número de gerações: cerca de Lee et al. [27], em 2008, propuseram o algoritmo GA-ACO, um GA que fazia uso do algoritmo de colônia de formigas [28] para otimizar o espaço de busca. Botta e Negro [17], em 2010, apresentaram uma solução onde uma matriz com pesos posicionais (Positional Wight Matrix, PWM) representava um indivíduo da população, contendo nela a probabilidade de uma determinada posição da sequência ser associada a uma coluna do alinhamento. Percebe-se a predominância do uso de GAs aplicados ao problema de MSA. Porém, estudos comparativos de DE, aplicados a outros problemas de otimização que não MSA, indicam que, apesar da simplicidade de sua implementação, a DE pode atingir bons resultados a um desempenho muito melhor se comparada com outras técnicas como PSO, G3 com PCX e até mesmo GA [29] [31]. A DE se destaca também em sua facilidade de uso, possuindo poucos parâmetros de controle. Este trabalho tem como objetivo apresentar um método de MSA baseado em algoritmos de evolução diferencial. O problema de MSA é encarado como um problema de otimização, sendo proposto neste trabalho uma função objetivo baseada na medida da qualidade do alinhamento obtida a partir da dispersão de lacunas (gaps) ao longo das sequências, sem considerar inserção, exclusão e mutação de bases, como é

2 comumente utilizado em outros métodos de alinhamento. Os resultados são comparados com o método de alinhamento progressivo Clustal [32]. O trabalho está organizado da forma que segue: Na seção II os conceitos e materiais utilizados são apresentados. Na seção III os resultados experimentais são apresentados. Discussões e conclusões formam a seção IV e finalmente temos a seção V com os trabalhos futuros. II. A. Evolução Diferencial MATERIAIS E MÉTODOS A Evolução Diferencial (Differential Evolution, DE) como outros algoritmos evolucionários, é iniciado com uma populações de vetores x i,g, (i = 1, 2..., NP ) que são aleatoriamente gerados. Os vetores possuem dimensão N P que não muda durante o processo de otimização. Para gerar uma nova população de vetores, o procedimento é o seguinte: 1) Mutação: Para cada vetor da população atual x i,g (vetor alvo), sendo i = 1, 2, 3, 4, 5..., NP, um vetor mutante é gerado de acordo com a regra: DE\rand\1\bin : v i,g+1 = x r1,g + F (x r2,g x r3,g) (1) onde os índices aleatórios r 1, r 2, r 3 {1, 2,..., NP }, inteiros, mutualmente diferentes e F é um fator constante [0, 2] que controla a amplificação da variação diferencial (x r2,g x r3,g). A estratégia de mutação apresentada na Equação 1 é conhecida como DE\rand\1\bin. Outras estratégias (Equações 2, 3, 4 e 5) de mutação são utilizadas neste trabalho: DE\best\1\bin: DE\rand-to-best\1\bin: v i,g+1 = x best,g + F (x r1,g x r2,g) (2) v i,g+1 = v i,g + F (x best,g v i,g) + F (x r1,g x r2,g) (3) DE\best\2\bin: v i,g+1 = x best,g + F (x r1,g x r2,g) + F (x r3,g x r4,g) (4) DE\rand\2\bin: v i,g+1 = x r1,g + F (x r2,g x r3,g) + F (x r4,g x r3,g), (5) onde x best,g é o vetor indivíduo que possui o melhor valor de aptidão da população na geração G. 2) Cruzamento: A DE faz uso do operador de cruzamento (Crossover) para prover diversidade populacional. No processo de cruzamento, um vetor ensaio definido como: u i,g+1 = (u 1i,G+1, u 2i,G+1,..., u Di,G+1 ) (6) é formado pela regra: { vji,g+1 se rand u ij,g+1 = j (0, 1) CR, caso contrário. x ji,g Na Equação 7, CR [0, 1] é uma constante predefinida e rand j (0, 1) corresponde j-éssima geração de um número aleatório com distribuição normal [0, 1]. (7) 3) Seleção de sobreviventes: Os vetores que irão fazer parte da geração G + 1 são definidos no processo de seleção de sobreviventes. O vetor ensaio u i,g+1 é comparado com o vetor alvo x i,g. O vetor que possuir melhor score será incluído na geração seguinte. 4) Parâmetros: Os parâmetros utilizados na execução de cada estratégia de DE estão na Tabela I. Table I. PARÂMETROS DAS ESTRATÉGIAS DE EVOLUÇÃO DIFERENCIAL Parâmetro Descrição Valor Utilizado CR Taxa de cruzamento 1 F Amplificação da diferença 1 NP Tamanho da População 1500 QntInteracoes N o de Iterações 1500 B. Função objetivo A função objetivo definida na Equação 8 busca atender mais de um aspecto do problema de MSA. A ideia da função objetivo proposta é premiar aspectos desejáveis e penalizar os não-desejáveis. Para realizar isso a função objetivo é definida como uma combinação linear de outras quatro funções. f(w i ) = ω sp f sp (w i )+ ω penal f penal (w i )+ ω corresp f cossesp (w i )+ ω consec f consec (w i ) Na função objetivo, ω sp, ω penal, ω corresp e ω consec são os multiplicadores reais das funções componentes, cujos os valores utilizados estão na Tabela II. Table II. MULTIPLICADORES DAS FUNÇÕES COMPONENTES Parâmetro Valor Utilizado ω sp 1,0 ω penal 1,0 ω corresp 2,0 ω consec 1,0 O primeiro termo da função objetivo é definido pela Equação 9. A matriz W n,s corresponde ao alinhamento resultante, sendo n o índice da sequência alinhada e s o índice da coluna do alinhanto. Em f sp (w i ) é realizado o somatório para cada coluna do alinhamento de todas as correspondências entre bases de uma mesma coluna, onde, o peso de cada correspondência seja determinado através de uma matriz de similaridades M (i j). f sp (w i ) = S s=1 n=1 (8) N IUB (W 1,s, W n,s ) (9) A matriz de similaridade utilizada foi a matriz IUB, que corresponde à matriz padrão usada pelo Clustal em alinhamento de sequências de DNA. Na matriz IUB, cada elemento m i,j é um valor real representativo da similaridade entre a i-ésima e a j-ésima base. Todos os elementos da diagonal principal, sendo os representativo das correspondências (matches), são preenchidos com 1.9, enquanto que os

3 elementos restantes, conhecidos como não-correspondentes (mismatches) são preenchidos com zeros. O segundo aspecto considerado na função objetivo é definido na Equação 10, que leva em conta o distribuição das lacunas ao longo das sequências. { 0, s C1 gap penal (w i, n, s) = penal gapext, s C 2 penal gapopen, s C 3, (10) C 1 = {(s = 1) (s < p F B (w i, n)) (s < p LB (w i, n))} (11) C 2 = {(s > 1) (gap penal (w i, n, s 1) < 0)} (12) C 3 = {(s > 1) (gap penal (w i, n, s 1) 0)} (13) Semelhante a outros métodos de alinhamento, a função objetivo deste trabalho trata a necessidade de desencorajar o mau posicionamento de lacunas através da aplicação de uma função de penalidade. Assim, caso à esquerda da lacuna exista uma base então tal lacuna dá início a uma abertura de espaço (chamado de gap open). Caso contrário, ou seja, se na posição à esquerda existe outra lacuna então trata-se de uma extensão da lacuna. Neste trabalho, lacunas do tipo extensão são penalizadas em 0.2 e lacunas do tipo abertura são penalizadas com 10. O terceiro aspecto considerado na função objetivo é o número de correspondências existentes na mesma coluna. Definido na Equação 14, f cossesp (w i ) tem o objetivo de premiar alinhamentos onde o total de correspondências identificadas crescem a cada coluna do alinhamento. N penal gapopen f cossesp (w i ) = N S s=1 numcorresp (w (14) i, s) Onde numcorresp (w i,s ) representa o número de correspondências identificadas na s-ésima coluna da i-ésima linhda do alinhamento, sendo 0 columngaps (w i,s ) (N 1). O quarto aspecto considerado pela função objetivo, definido na Equação 15, trata da necessidade de privilegiar alinhamentos nos quais colunas de alta similaridade ocorram consecutivamente. Isto permite identificar regiões de alta similaridade. S f consec (w i ) = Consec (s), (15) s=1 com 0, s=1 Consec(s)(w i)= Consec(s 1) (N numcorresp(w i,s)) 2, s 1 (16) C. Sequências utilizadas Para formar a base de dados utilizada nos experimentos, foram construídos no total 50 conjuntos de 4 sequências retiradas do genoma do fungo Pyrenophora tritici-repentis da base pública do EMBL-EB. Foram utilizadas as sequências AAXI até AAXI Para cada sequências AAXI010000* foram capturadas as primeiras 960 bases e em seguida distribuídas em linhas de comprimento igual a 60 bases. Na construção de cada um dos 50 conjuntos de sequências, quatro desses genomas foram escolhidos uniformemente ao acaso e de cada um, foi extraída a n-ésima linha onde n corresponde a um número aleatório [1,16] com distribuição uniforme. Estas quatro linhas irão compor um conjunto de quatro sequências que serão exclusivas para um ensaio. D. Clustal Os 50 conjuntos de 4 sequências foram alinhado através método de Clustal através da ferramenta Clustal W2 disponível no website do EMBL-EBI. Para todos alinhamentos foram utilizados os parâmetros padrões da ferramenta, conforme a Tabela III. Table III. PARÂMETROS DO CLUSTAL Parâmetro Descrição Valor Utilizado dnamatrix DNA/RNA scoring matrix IUB gapopen gap creation penalty -10 noendgaps no end gap separation penalty no gapext gap extension penalty -0.2 gapdist gap separation penalty 5 iteration iteration strategy none numiter maximum number of iterations 1 Estes alinhamentos são posteriormente avaliados pela mesma função objetivo que é aplicada a todos os alinhamentos encontrados pelas estratégias de DE para fins de comparação. III. RESULTADOS Ao longo dos 50 ensaios para cada estratégia de DE, os percentuais de pontuações que superaram os alinhamentos realizados pelo Clustal, estão na Tabela IV. Table IV. PERCENTUAIS DE SUPERAÇÃO DAS ESTRATÉGIAS DE DE Estratégia de DE % de ensaios com maior pontuação best\1\bin 80% best\2\bin 74% rand\1\bin 76% rand\2\bin 76% rand-to-best\1\bin 80% Na Figura 1 temos o gráfico box-plot comparativo das pontuações obtidas com os alinhamentos realizados com as estratégias de DE e com o Clustal. Os limites extremos correspondem aos valores de máximo e mínimo, enquanto que a marca central é o valor médio, abaixo e acima do valor médio temos os percentis 25 e 75. Admitindo um intervalo de confiança de 0,05, todos os resultado do teste de hipóteses de Wilcoxon executados foram iguais e favoráveis às estratégias de DE. IV. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES Foi visto uma abordagem de otimização de uma função objetivo proposta para o problema de MSA, utilizando a metaheurística Evolução Diferencial. Foram utilizadas 5 estratégias de Evolução Diferencial: DE\best\1\bin, DE\best\2\bin, DE\rand\1\bin, DE\rand\2\bin e DE\rant-to-best\1\bin. As pontuações obtidas para cada estratégia foram comparadas com as pontuações obtidas com os alinhamentos realizados pelo método de Alinhamento Progressivo Clustal.

4 Figure 1. Gráfico box-plot delimitado pelos pontos de máximo e de mínimo, percentil 75 e 25 Para a maioria dos ensaios realizados em cada estratégia de Evolução Diferencial testada, a meta-heurística da Evolução Diferencial mostrou-se eficaz para o problema de alinhamento múltiplo de sequências, quando comparamos os seus resultados com os obtidos pelo método de Alinhamento Progressivo Clustal. No geral, a abordagem com Evolução Diferencial conseguiu obter melhores resultados em até 80% dos ensaios. As menores porcentagem de superação ficaram com as estratégias DE\rand\1\bin e DE\rand\2\bin que superaram o Clustal em 76% dos ensaios. As maiores pontuações ficaram com as estratégias DE\rand-to-best\1\bin e DE\best\1\bin que superaram o Clustal em 80% dos ensaios. TRABALHOS FUTUROS Como forma de ampliar a investigação na obtenção de melhores alinhamentos, vem sendo estudada a utilização de alinhamentos já obtidos por métodos progressivos como dados de entrada no processo evolucionário, para constatar se os alinhamentos obtidos ao término do processo irão possuir uma melhor pontuação. REFERENCES [1] D. Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences: Computer Science and Computational Biology. Cambridge University Press, [Online]. Available: [2] M. J. SIPPL, Biological sequence analysis. probabilistic models of proteins and nucleic acids, edited by r. durbin, s. eddy, a. krogh, and g. mitchinson cambridge: Cambridge university press. 356 pp.. PRS, vol. 8, pp , [3] D. T. Jones, Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices, Journal of Molecular Biology, vol. 292, no. 2, pp , [Online]. Available: [4] S. Altschul, T. Madden, A. Schäffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller, and D. 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