ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE FILME DE ACETATO DE CELULOSE INCORPORADO COM ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO (Origanum vulgare L.) EM QUEIJO MINAS FRESCAL

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1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE FILME DE ACETATO DE CELULOSE INCORPORADO COM ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO (Origanum vulgare L.) EM QUEIJO MINAS FRESCAL E.A.A. Medeiros 1, R.R. Cardoso 2, D.M.G. Boggione 3, R.B.T. Alves 4, J.D.V. Ângulo 5, N.F.F. Soares 6 1- Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Viçosa, Av. P.H. Rolfs s/n, Campus Universitário, CEP: , Viçosa, MG, Brasil, Telefone: (55-31) (ebermedeiros@yahoo.com.br). 2- similar ao similar ao similar ao similar ao similar ao 1. RESUMO Embalagens ativas incorporadas com óleos essenciais são utilizadas com o objetivo de controlar o crescimento de micro-organismos patogênicos e deterioradores em alimentos, prolongando sua vida de prateleira. Esta pesquisa avaliou a eficiência antimicrobiana de filmes de acetato de celulose incorporados com 50 % de óleo essencial de orégano para a conservação de queijo Minas Frescal. Foram analisados S. aureus, coliformes totais, bactérias psicrotróficas e bolores e leveduras no queijo embalado com filme e armazenado a 7 C durante 8 dias. O filme incorporado com óleo essencial apresentou efeito antimicrobiano in vitro, sobre S. aureus e no queijo embalado promoveu uma redução de 1.4 ciclos log na contagem desse patógeno. Nos testes com os filmes acondicionando o queijo, verificou-se que o mesmo possui potencial de aplicação na conservação de queijo Minas Frescal, visto que reduziu o crescimento dos micro-organismos testados. PALAVRAS-CHAVE: Embalagem ativa, óleo essencial de orégano, queijo Minas Frescal. 1. INTRODUÇÃO Filmes à base de biopolímeros podem ser desenvolvidos com vários polissacarídeos e proteínas, tendo significantes vantagens ambientais sobre os plásticos convencionais. Com essas matrizes, é possível desenvolver filmes incorporados de compostos antimicrobianos e/ou funcionais (Hanani et al., 2012). Neste contexto o acetato de celulose vem sendo estudado para aplicações em embalagens de alimentos por ser um polímero amorfo, não tóxico e inodoro, estável em óleos minerais, permeável a vapor de água e, de acordo como o grau de substituição, solúvel em acetona, além de ser um composto biodegradável. A partir desse polímero, é possível a produção de filmes transparentes e flexíveis, que podem ser utilizados em alimentos (Cerqueira et al., 2010; Silveira, 2005). Segundo a Comissão Reguladora (EC) n. 450/2009 (European Commission, 2009), as substâncias responsáveis pela função ativa incluídas em uma embalagem são associadas para estender a vida útil ou para manter ou melhorar as condições de embalagem de alimentos. Vários agentes antimicrobianos podem ser incorporados e, ou imobilizados no material da embalagem de alimentos (López et al., 2007; Nerin, 2012). Estes agentes com ação antimicrobiana incluem substancias químicas, biológicas, naturais e probióticas (Han, 2005; Vonasek, Le e Nitin, 2014; Gouvêa et al., 2015). 1

2 Alguns estudos têm avaliado a incorporação de óleos essenciais (OE) em filmes plásticos biodegradáveis (López et al., 2007). Esses estudos são motivados pelo aumento do interesse do consumidor por alimentos com uma menor quantidade de aditivos sintéticos. Uma vez que os OE são considerados seguros, esses aditivos naturais podem ser utilizados em contato direto com o alimento, sem efeitos à saúde dos consumidores (Appendini e Hotchkiss, 2002). Entre os óleos essenciais mais eficazes, o óleo essencial de orégano tem demostrado possuir um dos melhores efeitos antimicrobianos, devido a presença de compostos fenólicos, como timol e sobretudo o carvacrol, considerados como os responsáveis pela sua atividade antimicrobiana (Burt et al., 2005; López et al., 2007; Solomakos et al., 2008). O queijo Minas Frescal é um dos produtos lácteos mais apreciados no Brasil, é de consumo imediato, pois possui vida de prateleira curta, mesmo sob refrigeração, sendo muito susceptível a contaminações microbianas (Rocha et al., 2006). Nesse contexto, este trabalho teve por objetivo avaliar a eficiência antimicrobiana de filmes incorporados com óleo essencial de orégano para a conservação microbiológica do queijo Minas Frescal. 2. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi conduzido no Laboratório de Embalagens (LABEM) do Departamento de Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal de Viçosa. O queijo Minas Frescal foi produzido artesanalmente por um feirante da cidade de Viçosa - MG e fornecido ao laboratório para aplicação do filme Produção dos filmes Os filmes foram elaborados pelo método cast segundo Soares (1998) e adaptado por Silveira (2005), com modificações. Os flocos de acetato de celulose foram adicionados de acetona (Vetec ) na proporção de 1/10 (10 % p/v) e deixados em repouso por aproximadamente h. Após o repouso os filmes foram adicionados de 50 % de óleo essencial de orégano em relação ao peso de acetato. Após a homogeneização a mistura foi espalhada em placas de vidro, previamente higienizadas. Após evaporação do solvente, em condições ambientes, os filmes foram retirados das placas e utilizados para embalar os queijos. Como controle, foram produzidos filmes sem adição de óleo Atividade antimicrobiana do filme (teste do halo) Para os filmes incorporados com óleo essencial de orégano o método utilizado foi o de discodifusão em ágar sugerido pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa, 2009) para teste rápido de sensibilidade in vitro de bactérias aeróbias e agentes antimicrobianos. O método adaptado é semelhante ao utilizado por Imran et al., As análises foram feitas em três repetições. As placas contendo Ágar Mueller Hinton (Himedia ) foram previamente inoculadas com a cultura de Staphylococcus aureus ATCC 6538 utilizando a técnica swab. Swabs esterilizados foram umedecidos em solução contendo a bactéria pré-ativada e friccionados sobre a placa contendo o ágar, este processo foi realizado por quatro vezes. Discos de 1 cm 2 do filme de acetato foram dispostos nas placas, e incubados a 35 C ± 2 C por 24 h. O halo de inibição foi medido através da visualização de seu diâmetro Atividade antimicrobiana do filme na conservação de queijo Minas Frescal 2

3 Montagem do experimento com o queijo Os queijos uniformes com 200 g cada foram fabricados e fornecidos por um feirante local. Os queijos foram envolvidos com o filme de acetato de celulose (controle) e filme incorporado com 50 % de óleo essencial de orégano. Os filmes de acetato de celulose foram submetidos a luz ultravioleta (UV) por 15 minutos antes da aplicação nos queijos. Os queijos foram acondicionados em sacos de polietileno de baixa densidade e armazenados sob refrigeração a 7 C ± 2 C por 8 dias (Figura 1). Figura 1 - Fotos do queijo Minas Frescal sendo envolvido por filme de acetato de celulose (A) e, posteriormente, acondicionado em saco de polietileno de baixa densidade para armazenamento sob refrigeração (B). A B Análises microbiológicas Foram realizadas análises de psicrotróficos, coliformes totais, bolores e leveduras e Staphylococcus aureus (log UFC g -1 ), conforme metodologia sugerida pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Brasil, 2003). As análises foram realizadas nos tempos 0, 2, 4, 6 e 8 dias. O experimento foi conduzido em três repetições e os resultados expressos como média das repetições. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Atividade antimicrobiana in vitro do filme O filme de acetato de celulose incorporado com óleo essencial de orégano 50 % apresentou atividade antimicrobiana sobre S. aureus (Figura 2). O halo de inibição médio foi de 20 mm. Em um estudo realizado por Botre et al. (2010) também foi constatado atividade antimicrobiana contra S. aureus de filmes de acetato de celulose com óleo essencial de orégano 50%. Os autores constataram que o filme incorporado com 25 % de óleo essencial de orégano formou um halo de inibição menor. Figura 2. Halo de inibição formado pelo filme de acetato de celulose incorporado com óleo essencial de orégano sobre S. aureus. Jouki et al. (2014) estudaram a atividade antimicrobiana in vitro de filmes produzidos a partir da mucilagem de semente de marmelo incorporados com óleo essencial de orégano sobre 11 diferentes 3

4 estirpes de bactérias patogênicas veiculadas por alimentos. Nesse trabalho, o óleo essencial de orégano na concentração de 2 % (v/v) foi eficaz contra todos as estirpes bacterianas. 3.2 Atividade antimicrobiana do filme em queijo Minas Frescal O filme incorporado com óleo essencial de orégano promoveu a redução do crescimento dos micro-organismos analisados, em relação ao filme controle, durante a estocagem do queijo Minas Frescal a 7 C por 8 dias (Figura 3). A redução das contagens microbianas foi observada apenas após o quarto dia de estocagem. Provavelmente, a diminuição da volatilidade do óleo essencial de orégano, quando submetido a baixas temperaturas, leva a uma redução na saturação dos compostos fenólicos no espaço livre da embalagem do queijo, comprometendo sua atividade antimicrobiana nos primeiros dias de estocagem. Segundo Botre et al. (2010), o óleo essencial possui ação efetiva após atingir maiores concentrações de timol e carvacrol, o que leva certo tempo devido a necessidade de conversão de um composto em outro, assim como ao uso de temperaturas de estocagem maiores que 7 ºC, que facilitaria a formação e volatilização dos compostos antimicrobianos. Figura 3. Crescimento de S. aureus (A), coliformes totais (B), bactérias psicrotróficas (C) e bolores e leveduras (D) em queijo Minas Frescal embalado com filme de acetato de celulose incorporado com óleo essencial de orégano 50 % e filme controle (sem antimicrobiano) armazenado a 7 C durante 8 dias. A B C D O filme incorporado com óleo essencial de orégano foi mais efetivo contra o crescimento de S. aureus (Figura 3A) e bolores e leveduras (Figura 3D), promovendo uma redução na contagem de 1.4 e 0.9 ciclos log, respectivamente, em relação ao filme controle, após o oitavo dia de estocagem. Soares et al. (2008) também estudaram a atividade antimicrobiana de filmes incorporados com diferentes concentrações do óleo essencial de orégano durante estocagem do queijo Minas Frescal a 7 C por 12 dias. Esses autores constataram que os filmes ocasionaram uma redução variando de 0.5 a 1.0 ciclos log em relação ao tratamento com filme controle (sem adição do antimicrobiano), indicando a sua eficiência em inibir o crescimento de Listeria innocua em queijo Minas Frescal. Uma menor redução na contagem de bolores e leveduras do que a observada neste trabalho foi obtida por Galet et al. (2009) em estudo na embalagem de salada mista, estes autores utilizaram filme de PP/EVOH incorporado com óleo essencial de orégano 7,5 % (p/p). Os autores observaram uma redução de 0.7 ciclo logarítmico na contagem de bolores e leveduras em salada mista após estocagem sob refrigeração por 8 dias. 4

5 As contagens de coliformes totais e de bactérias psicrotróficas apresentaram pequena diferença entre o filme controle e o filme incorporado com orégano ao final do armazenamento (Figuras 3B e 3C). As reduções nas contagens promovidas pelo filme com orégano corresponderam a apenas 0.2 ciclos log para coliformes totais e 0.4 ciclos log para bactérias psicrotróficas, demonstrando uma menor eficiência na inibição desses grupos de bactérias. Um estudo realizado por Botre et al. (2010) utilizando também um filme de base celulósica incorporado com óleo essencial de orégano 50 %, só que em pizza pronta, igualmente não conseguiu inibir o crescimento de bactérias psicrotróficas durante armazenamento a 7 C por 15 dias. Embora, o óleo essencial de orégano possua ação antimicrobiana in vitro comprovada, são necessárias concentrações maiores para alcançar a mesma eficiência quando aplicado em filmes para embalar alimentos. Além dos fatores intrínsecos dos alimentos (teor de nutrientes, água, antioxidantes, ph, conservantes), os fatores extrínsecos (temperatura, atmosfera gasosa, umidade), a microbiota do alimento, o tempo de contato e o tipo de matriz para incorporação do óleo e produção do filme também influenciam a sensibilidade dos microrganismos (Espitia et al., 2012; Otero et al., 2014). 4. CONCLUSÃO O filme incorporado com óleo essencial de orégano apresentou efeito antimicrobiano in vitro, sobre S. aureus. A avaliação do filme de acetato de celulose incorporado com óleo essencial de orégano possui um potencial de aplicação na conservação de queijo Minas Frescal, visto que reduziu o crescimento dos micro-organismos testados. A melhor efetividade em relação aos aspectos microbiológicos foi a redução de S. aureus em relação à microbiota presente no tratamento controle, ao final dos 8 dias de estocagem a 7 C. São necessários, principalmente, estudos sensoriais para verificar a sua utilização. 5. AGRADECIMENTOS Agradecimentos à CAPES, CNPq e FAPEMIG pelo apoio financeiro. 6. REFERÊNCIAS Anvisa Agência Nacional de Vigilância Sanitária. (2009). Normas de Desempenho para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana: 15 º Suplemento Informativo. 25 (2). Appendini, P. & Hotchkiss, J. H. (2002). Review of antimicrobial food packaging. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 3 (2), Botre, D. A., Soares, N. F. F., Espitia, P. J. P., Sousa, S. & Renhe, I. R. T. (2010). Avaliação de filme incorporado com óleo essencial de orégano para conservação de pizza pronta. Revista Ceres, 57 (3), Brasil. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. (2003). Instrução Normativa nº 62, de 26 de agosto de Oficializa os Métodos Analíticos Oficiais para Análises Microbiológicas para Controle de Produtos de Origem Animal e Água. Brasília, DF: MAPA, Burt, S., Vlielander, R., Haagsman, P. H. & Veldhuizen, J. A. E. (2005). Increase in activity of essential oil components carvacrol and thymol against Escherichia coli O157:H7 by addition of food stabilizers. Journal of Food Protection, 68, Cerqueira, D. A., Rodrigues Filho, G., Carvalho, R. A. & Valente, A. J. M. (2010). Caracterização de acetato de celulose obtido a partir do bagaço de cana-de-açúcar por 1H-RMN. Polímeros, 20, (2),

6 Espitia, P. J. P., Soares, N. F. F., Botti, L. C. M., Melo, N. R., Pereira, O. L. & Silva, W. A. (2012). Assessment of the efficiency of essential oils in the preservation of postharvest papaya in an antimicrobial packaging system. Brazilian Journal Food Technology, 15 (4), European Commission. (2009). Commission regulation (EC) No 450/2009 of 29 May 2009 on active and intelligent materials and articles intended to come into contact with food. Official Journal of the European Union, L135, Galet, V. M., Cerisuelo, J. P., Carballo, G. L., Aucejo, S., Gavara, Gómez-Estaca, J., López De Lacey, A., Gómez-Guillén, M. C., López-Caballero, M. E. & Montero, P. (2009). Antimicrobial activity of composite edible films based on fishgelatin and chitosan incorporated with clove essential oil. Journal of Aquatic Food Product Technology,18, Gouvêa, D. M., Mendonça, R. C. S., Soto, M. L. & Cruz, R. S. (2015). Acetate cellulose film with bacteriophages for potential antimicrobial use in food packaging. LWT - Food Science and Technology, 63, Han, J. H. (2005). Introduction to active food packaging technologies. In J. H. Han (Ed.), Innovations in food packaging (pp ). London: Academic Press. Hanani, Z. A., Beatty, E., Roos, Y. H., Morris, M. A., & Kerry, J. P. (2012). Manufacture and characterization of gelatin films derived from beef, pork and fish sources using twin screw extrusion. Journal of Food Engineering, 113, Imran, M., El-Fahmy, S., Revol-Junelles, A. & Desobry, S. (2010). Cellulose derivative based active coatings: Effects of nisin and plasticizer on physico-chemical and antimicrobial properties of hidroxypropyl methylcellulose films. Carbohydrate Polymers, 81 (2), Jouki, M., Yazdi, F. T., Mortazavi, S. A. & Koocheki, A. (2014). Quince seed mucilage films incorporated with oregano essential oil: Physical, thermal, barrier, antioxidant and antibacterial properties. Food Hydrocolloids, 36, López, P., Sánchez, C., Batlle, R. & Nerín, C. (2007). Development of flexible antimicrobialfilms using essential oils as active agents. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, Nerin, C. (2012). Essential oils in active packaging. In L. Valgimigli (Ed.), Essential oils as natural food additives: Composition, applications, antioxidant and antimicrobial properties (pp ). Nova Science Inc. Otero, V., Becerril, R., Santos, J. A., Rodríguez-Calleja, J. M., Nerín, C. & García-López, M. L. (2014). Evaluation of two antimicrobial packaging films against Escherichia coli O157:H7 strains in vitro and during storage of a Spanish ripened sheep cheese (Zamorano). Food Control, 42, Rocha, J. S., Buriti, F. C. A. & Saad, S. M. I. (2006). Condições de processamento e comercialização de queijo-de-minas frescal. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, 58 (2), Silveira, M. F. A. Filme antimicrobiano incorporado com ácido sórbico na conservação de massa de pastel. (2005). 64f. Tese (Doctor Scientiae em Ciência e Tecnologia de Alimentos) departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. Soares, N. F. F. (1998). Bitterness reduction in citrus juice through naringinase immobilized into polymer film. Ph D. Dissertation. Cornell University, New York: 130 p. Soares, N. F. F., Silva, P. S. & Silva, W. A. (2008). Desenvolvimento e avaliação de filme ativo incorporado com óleo essencial de orégano (Origanum vulgare L.) no crescimento de Listeria innocua em queijo Minas frescal. Revista do Instituto de Laticínios Cândido Tostes, 365 (63), Solomakos, N., Govaris, A., Koidis, P. & Botsoglou, N. (2008). The antimicrobial effect of thyme essential oil, nisin and their combination against Escherichia coli O157:H7 in minced beef during refrigerated storage. Meat Science, 80, Vonasek, E., Le, P. & Nitin, N. (2014). Encapsulation of bacteriophages in whey protein films for extended storage and release. Food Hydrocolloids, 37,