EFEITO ANTIMICROBIANO E ANTIOXIDANTE DE NANOBIOFILMES ATIVOS

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1 EFEITO ANTIMICROBIANO E ANTIOXIDANTE DE NANOBIOFILMES ATIVOS LUCAS BALDO LUVIZARO 1, FLÁVIA DÉBORA DA SILVA 1, PEDRO HENRIQUE CAMPELO FELIX 2, SORAIA VILELA BORGES3, ROBERTA HILSDORF PICCOLI 3 1 Graduando, Departamento de Ciências dos Alimentos/Universidade Federal de Lavras 2 Doutorando, Departamento de Ciências dos Alimentos/Universidade Federal de Lavras 3 Professora, Departamento de Ciências dos Alimentos/Universidade Federal de Lavras RESUMO: Embalagens de alimentos são utilizadas para permitir a comercialização do produto em condições seguras, livre de agentes deteriorantes. O objetivo deste trabalho foi elaborar uma embalagem ativa de isolado proteico de soro de leite, incorporadas com óleo essencial de canela e nanofibra de celulose, e avaliar seu efeito sobre as bactérias L.Innocua e E.Coli e também seu efeito antioxidante. As análises foram realizadas em duas etapas. Primeiramente foram realizadas as análises microbiológicas (CMI) e antioxidantes (DPPH) do óleo essencial. Na segunda etapa, avaliaram-se a atividade antimicrobiana dos filmes desenvolvidos empregando-se a metodologia de Difusão em Disco e a atividade antioxidante dos filmes (DPPH). Os resultados indicaram que o filme elaborado tem grande potencial para aplicação em alimentos em função do seu efeito antioxidante e antimicrobiano. Palavras-chave: Óleo essencial de canela, nanofibra de celulose e isolado protéico de soro de leite. INTRODUÇÃO O impacto ambiental causado por polímeros convencionais é muito grande e podemos observar um aumento no uso de embalagens plásticas. Isto pode ser ilustrado quando em 2008, o consumo chegou a aproximadamente 200 milhões de toneladas com tendência de aumento anual de 5% (SIRACUSA et al., 2008; ZÁRATE-RAMÍREZ et al, 2011). Uma das soluções encontradas, particularmente na área de embalagens de alimentos, foi o desenvolvimento de filmes a partir de polímeros biodegradáveis que possam substituir os materiais sintéticos. Dentre os materiais pesquisados, os biopolímeros naturais, como os polissacarídeos e as proteínas, se apresentam mais promissores, em razão de serem abundantes, renováveis, econômicos, e capazes de formar uma matriz contínua (Gontard & Guilbert, 1996). O uso de nanofibra de celulose tem inúmeras vantagens, destacando-se sua natureza biodegradável, renovável, de baixa densidade, elevada área superficial e quando aplicada a embalagens melhora as propriedades mecânicas e de barreira, além de auxiliar na difusão dos agentes ativos incorporados nas embalagens (ALEMDAR e SAIN, 2006). A conservação dos alimentos é um assunto bastante discutido por pesquisadores e o grande desafio é manter o alimento mais estável possível, mantendo assim suas características físicas, químicas e biológicas (BOTRE et al.,2007). O emprego de embalagens para conservação de alimentos significou um importante avanço para aumento da sua disponibilidade aos consumidores pelo consequente aumento da sua vida útil. Óleos essenciais são substâncias naturais que atualmente ganham destaque como agentes antimicrobianos associados às embalagens para alimentos (BOTRE et al., 2010; STIEVEN et al., 2009). Segundo Koketsu et al. (1997), tem-se no óleo essencial de Cinnamomum zeylanicum (canela) a presença do aldeído cinâmico (55%), seguido do eugenol (12%). Diante do exposto, objetivou-se com este trabalho o desenvolvimento de nanobiofilme de isolado proteico de soro de leite (IPS) incorporado com óleo essencial de canela e nanofibra, que desperta grande interesse para as indústrias de alimentos, devido às vantagens que os diferenciam das embalagens convencionais, isto devido ao uso de

2 matriz polimérica de compostos orgânicos reforçadas com nanofibra de celulose e associados a óleo essencial para viabilizar a segurança do alimento, pois tem propriedades antibacterianas, antifúngicas e antioxidantes. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi realizado no laboratório de Embalagens e no Laboratório de Microbiologia de Alimentos do Departamento de Ciência dos Alimentos (UFLA). O óleo essencial de canela (Cinnamomum zeylanicum) foi adquirido da empresa FERQUIMA Indústria e Comercio Ltda. As cepas de Eschericia coli e Listeria innocua utilizadas pertencem à coleção de culturas do Laboratório de Microbiologia de Alimentos do Departamento de Ciência dos Alimentos (UFLA). O Isolado proteico de soro de leite (IPS), (80% de proteína), foi doado pela Doremus e o glicerol foi adquirido da empresa Sigma (Aldrich Brasil). O experimento foi realizado em triplicata e em três repetições. Determinação da concentração mínima inibitória (CMI) do óleo essencial de canela As culturas estoque de L. Innocua e E. Coli foram armazenadas e ativadas segundo Oliveira (2011) utilizando-se Tryptic Soy Broth (TSB) e TSB suplementado com 0,6 % de extrato de levedura (YE) para E.coli e L. innocua respectivamente. A padronização/suspenção das células foi feita em solução de NaCl a 0,85% onde a turbidez do inóculo foi ajustada com a da solução padrão de McFarland 0,5 (1 x 108 UFC ml -1 ). As CMI s do óleo essencial de canela foram determinadas empregando-se a técnica de micro diluição em caldo de acordo com a metodologia NCCLS (M7-A6) (NCCLS, 2003). As concentrações do óleo de canela utilizadas foram (%): 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,062; 0,031; 0,015 e 0,007. Cavidades com meios de cultivas e sem inóculo foram consideradas controle. Após o período de incubação foi realizada uma leitura visual em que a cavidade que turvou foi considerada com crescimento da bactéria. As menores concentrações que resultaram em completa inibição do crescimento bacteriano foram consideradas CMI. Atividade antioxidante do óleo essencial de canela A análise antioxidante do óleo essencial de canela foi realizada segundo o método de sequestro de radicais livres DPPH (1,1-difenil-2-pricrilidrazila). Foi preparada uma solução metanólica de DPPH na concentração de 40 µg ml -1. Os óleos essenciais foram diluídos em metanol nas concentrações (500; 300; 100; 50; 25; 10; 5 µg ml -1 ). Para a avaliação, foram adicionados em um tubo de ensaio 2,7 ml da solução-estoque de DPPH, seguido da adição de 0,3 ml da solução de óleo essencial. Paralelamente, foi preparado o branco, contendo todos os reagentes, com exceção do óleo essencial. Após 60 min, foram realizadas leituras em espectrofotômetro (SPECTROPHOTOMETER SP 2000UV) no comprimento de onda de 515 nm. A atividade antioxidante foi avaliada pela leitura da absorbância e calculada (Equação 1). (BYUN et al., 2010). Equação 1: Calculo da porcentagem de atividade antioxidante do óleo essencial de canela: Em que: DPPHam: Concentração de DPPH na concentração da amostra analisada; DPPHbran: Concentração de DPPH do branco.

3 Desenvolvimento dos nanobiofilmes ativos Os filmes de Isolado Proteico de Soro de Leite (IPS) foram preparados dissolvendose 7,5 g (m/v) de IPS, 30% glicerol (2 ml) com 1% de nanofibra (4,3 ml) em 55 ml e 70 ml de água destilada respectivamente, sendo ambos separadamente submetidos á agitação magnética durante 30min, em temperatura ambiente. Após agitação, as soluções foram vertidas uma na outra e manteve-se agitação magnética durante 10min em temperatura ambiente. Em seguida, o ph foi ajustado para 8 com NaOH 2N e a solução final submetida a homogeneizador ultrassônico (Sonifier Cell Disruptor Branson Model 450D, Manchester,UK) durante 10 min, com potência de 80 W/25 C. Posteriormente as soluções foram aquecidas a 90 C por 30 min em banho-maria, para desnaturação das proteínas, resfriada a temperatura ambiente e vertidas em placas de vidro (filme controle: 0% de óleo essencial). Para os nanobiofilmes ativos o óleo foi adicionado após o banho maria devido sua volatilidade. Após a adição do óleo essencial na solução filmogênica usou-se homogeneizador ULTRATURRAX (T 25, Ika-Werke, Alemanha) por 4 minutos (10000 rpm). O controle de espessura foi efetuado por volume aplicado no suporte, correspondendo a 110 ml. Em seguida, as soluções filmogênica com dimensões 18 x 30 cm, foram secos em temperatura ambiente durante 48 horas garantindo evaporação lenta do solvente e formação do filme, Zinoviadou, et al. (2009). Considerando os resultados das analise de CMI e que no filme precisa-se de uma concentração maior de óleo essencial para obter o efeito antimicrobiano, foram utilizadas as seguintes concentrações de óleo essencial de canela (Tabela 1). Tabela 1: Concentrações de óleo essencial de canela utilizada nos nanobiofilmes. Amostra Concentrações % (g/100g IPC) Filme Controle 0 Filme 1 5 Filme 2 10 Filme 3 30 Filme 4 45 Teste de difusão em disco Para avaliar o efeito antimicrobiano dos filmes incorporados com óleo essencial foi realizada a análise de Difusão em Disco (NCCLS, 2003), adaptada. Discos de 35 mm de diâmetro dos filmes contendo as diferentes concentrações de óleo essencial (0; 5; 10 ; 30 e 45%) foram depositadas em superfícies de Agar TSA (Tryptone Soya Ágar) inoculados com culturas de E. coli e TSA+YE com L. innocua na concentração de 10 6 UFC ml. As placas foram incubadas a 37 C por 24h. Os halos de inibição formados foram mensurados com auxílio de paquímetro Atividade antioxidante do nanobiofilmes ativos A avaliação do efeito antioxidante do nanobiofilme ativo foi realizada conforme metodologia anteriormente para análise do efeito antioxidante do óleo essencial. Os filmes foram cortados em pedaços pesando 0,1g e misturados com 2 ml de metanol 80%. Uma alíquota (0,1 ml) do extrato metanólico foi misturada com 3,9 ml de DPPH 0,1 mm em metanol 80%. A mistura foi vigorosamente agitada em Vortex por 1 min e deixada repousar no escuro por 30 min. Mediu-se absorbância a 517 nm usando um espectrômetro. O metanol 80% é utilizado como controle e misturado com DPPH 0,1 mm. Calculou-se a atividade sequestradora de radicais de acordo com a equação 2 (BYUN et al., 2010).

4 Equação 2: Calculo da porcentagem de atividade antioxidante do nanobiofilme. Onde: A_ Amostra e A_ Controle são as absorbâncias medidas. Análises estatísticas Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e a diferença entre as amostras foi avaliada segundo o teste de Tukey a 5% de significância através do software Statistica 7.0. RESULTADOS E DISCUSSÃO Concentração mínima inibitória do óleo essencial de canela As CMI s do óleo essencial de canela foram de 0,25% para L. innocua e de 0,125% para E. coli. Yu e Park (2003) também observaram efeito antimicrobiano do cinamaldeído, que é o principio ativo do óleo essencial de canela para os microrganismos estudados neste trabalho. Avaliando o efeito antibacteriano de 28 óleos essenciais sobre E. coli, L. innocua e outras, Oussalah et al.(2007), encontraram resultado positivo para os diversos óleos essências inclusive o de canela, devido sua composição. Atividade antioxidante do óleo essencial de canela O resultado da análise de DPPH do óleo essencial de canela foi de 99.9%, em que quanto maior a concentração do óleo essencial de canela menor foi leitura da absorbância e melhor sua atividade antioxidante. Teste de difusão em disco Os nanobiofilmes ativos apresentam resultados satisfatórios quanto à inibição dos microrganismos estudados, e apresentou diferença estatística em relação ao filme controle (Tabela 3). Os nanobiofilmes de baixas concentrações (5% O.E) apresentaram apenas a inibição por contato e os demais apresentaram formação de um halo de inibição. Os resultados obtidos corroboram com os resultados que Trajano et al. 2009, que apresentou inibição das bactérias com formação de halos de até 30 mm de diâmetro. Tabela 3: Atividade antimicrobiana dos nanobiofilmes incorporados com O.E de canela. Amostras Medida dos Halos (mm) I. Innocua E. Coli Filme controle 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a Filme 1 23,33 ± 20,20 a,b 35,00 ± 0,00 b Filme 2 39,00 ± 3,60 b 36,67 ± 2,88 b Filme 3 44,67 ± 10,01 b 40,00 ± 5,00 b Filme 4 46,33 ± 9,87 b 45,33 ± 9,50 b a,b Letras iguais em uma mesma coluna não apresentam diferença significativa (p>0,05) Atividade antioxidante dos nanofilmes ativos

5 A concentração de 5% de óleo essencial apresentou efeito antioxidante de aproximadamente 62% e apresentou diferença estatística em relação ao filme controle (Tabela 4). Tabela 4: Atividade antioxidante do filme incorporado com óleo essencial de canela pelo método de sequestro de radicais livres DPPH (1,1-difenil-2-pricrilidrazila). Concentração (%) Atividade (%) 0 21,71 ± 0,664 a 5 62,19 ± 1,392 b Letras diferentes em uma mesma coluna demostram diferença significativa (p<0,05) entre as médias. CONCLUSÃO O filme com 5% apresentou efeito antioxidante e efeito antimicrobiano por contato indicando que pode ser aplicado em alimentos para garantir a segurança e a qualidade dos produtos. REFERÊNCIAS BYUN, Y., KIM, Y. T., WHITESIDE, S. Characterization of an antioxidant polylactic acid (PLA) film prepared with a-tocopherol, BHT and polyethylene glycol using film cast extruder. Journal of Food Engineering, n. 100, p , BOTRE, D.A.; SOARES, N.F.F.; GERALDINE, R.M.; PEREIRA, R.M.; FONTES, E.A.F. Quality of minimally processed garlic (Allium sativum) coated with antimicrobial edible coating. Revista Ciência e Tecnologia de Alimentos. 27(1), 32-38, KOKETSU, M.; GONÇALVES, S. L.; GODOY, R.; LOPES, L. O.; DAISE & MORSBACH, N. Óleos essenciais de cascas e folhas de canela (Cinnamomum verum Presl) cultivada no Paraná. Ciências e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 17, n. 3, p , sept./dez OUSSALAH, M.; CAILLET, S.; SAUCIER, L.; LACROIX, M. Inhibitory effects of selected plant essential oils on the growth of four pathogenic bacteria: E. coli O157:H7, salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes. Food Control, Guildoford, v. 18, n. 5, p , May SIRACUSA, V.; ROCCULI, P.; ROMANI, S.; DALLA ROSA, M. Biodegradable polymers for food packaging: a review. Trends Food Science Technology 19(12), ,2008. TRAJANO, N. Antibacterial property of spice essential oils on food contaminating bacteria. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 29(3): , jul.-set YOSHIDA, C. M. P.; ANTUNES, A. J. Characterization of whey protein emulsion films. Brazilian Journal of Chemical Engineering, v. 21, n. 2, p , ZINOVIADOU, K. G.; KOUTSOUMANIS, K. P.; BILIADERIS, C. G. Physico-chemical properties of whey protein isolate films containing orégano oil and their antimicrobial action against spoilage flora of fresh beef. Meat Science. n. 82, p , AGRADECIMENTOS: FAPEMIG, CNPq, CAPES e PIBIC-UFLA. Autor a ser contatado: Lucas Baldo Luvizaro/ lucas_baldo14@hotmail.com