UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA Período: Agosto de 2014 agosto de 2015 ( ) PARCIAL (x ) FINAL RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa: DIAGNÓSTICO DAS ENFERMIDADES DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL (SNC) DE HERBÍVOROS DA REGIÃO NORTE DO BRASIL E COMPARAÇÃO DA TÉCNICA DE IMUNOHISTOQUÍMICA COM AS TÉCNICAS OFICIAIS DE DIAGNÓSTICO DE RAIVA. Nome do Orientador: GABRIELA RIET CORREA RIVERO Titulação do Orientador: Doutora Faculdade: Faculdade de Medicina Veterinária Instituto/Núcleo: campus Castanhal Laboratório: Laboratório de Anatomia Patológica Título do Plano de Trabalho: Diagnóstico das principais enfermidades que afetam o sistema nervoso central de herbívoros com sinais neurológicos, que apresentam resultado negativo para raiva. Nome do Bolsista: Natalia Maxine Ferreira Pinheiro Sarmento Tipo de Bolsa: (X) PIBIC/ CNPq ( ) PIBIC/CNPq AF ( )PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador ( ) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/UFPA AF ( ) PIBIC/ INTERIOR ( )PIBIC/PARD 1

2 ( ) PIBIC/PADRC ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PIBIC/ PIAD ( ) PIBIC/PIBIT INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA: A raiva é uma zoonose de distribuição mundial, listada pela Organização Mundial para a Saúde Animal como de notificação obrigatória. No Brasil, estima-se que a raiva seja responsável pela morte de a (Rodrigues da Silva et al. 2000; Heinemann et al. 2002) bovinos anualmente, causando perdas anuais estimadas em 15 milhões de dólares (Heinemann et al. 2002). O apoio laboratorial é imprescindível para o diagnóstico da raiva. A Organização Mundial da Saúde preconiza a técnica de imunofluorescência direta (IFD) como o teste de diagnóstico para a identificação do vírus da raiva em tecidos frescos ou congelados, sendo este um teste altamente sensível, acurado e relativamente rápido (Kunert Filho, 2011; Xavier, 2005; Zimmer et al. 1990). O isolamento do vírus por inoculação intracerebral em camundongos (IIC) é também recomendado para a confirmação do diagnóstico pela IFD. No estado do Pará há dois laboratórios de referencia para o diagnóstico de raiva: o Laboratório Nacional Agropecuário (LANAGRO) e o Instituto Evandro Chagas. Esses laboratórios recebem amostras encaminhadas pela Agencia Agropecuária do Pará (ADEPARÁ) e por veterinários autônomos e utilizam as técnicas recomendadas pela Organização Mundial de Saúde (OMS) para o diagnóstico: imunofluorescência direta (IFD) e inoculação intracecebral em camundongos. Em todos os casos em que os animais apresentam sinais neurológicos, as amostras do sistema nervoso central devem ser encaminhadas a esses laboratórios para o diagnóstico de raiva. Entretanto, grande parte das amostras enviadas resultam negativas para raiva. No ano de 2011, por exemplo, das 61 amostras de SNC de herbívoros com sinais neurológicos enviadas pela ADEPARÁ ao LANAGRO para diagnóstico de raiva, 10 foram positiva e as demais foram negativas. Em 2012, foram enviadas 69 amostras, das quais apenas 11 foram positivas. O grande número de amostras negativo indica a ocorrência de outras enfermidades que afetam o sistema nervoso central de herbívoros, ressaltando a importância do estudo dessas enfermidades. O diagnóstico dessas enfermidades irá contribuir com agentes de defesa agropecuária e veterinários atuante na região no reconhecimento das principais doenças que afetam o sistema nervoso central de herbívoros, possibilitando a adoção de medidas de controle e profilaxia adequados. OBJETIVO: 2

3 - Realizar diagnóstico diferencial em fragmentos do SNC negativos para raiva. MATERIAIS E MÉTODOS: Serão avaliadas amostras de SNC (sistema Nervoso Central) de herbívoros, fornecidas pela Agência de Defesa Agropecuária do Estado do Pará (ADEPARA) e por Médicos Veterinários autônomos, que foram negativas para raiva nas técnicas de Imuno Fluorescência Direta (IFD) e Inoculação Intracerebral em Camundongos lactentes (IIC). Serão consideradas amostras recebidas no período de março de 2012 a agosto de As amostras serão processadas no laboratório de Patologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal do Pará, campus de Castanhal. Serão fixadas em formol a 10% e os cortes serão processados de forma rotineira para exame histopatológico, incluídas em parafina, cortados a 5 µm de espessura, aplicados sobre lâminas positivadas (ImmunoSlide- EasyPath), secadas verticalmente em temperatura ambiente, antes de serem aquecidas em estufa por 60ºC por 3 a 4 horas, corados pela hematoxilina e eosina (HE) avaliadas em microscópio óptico. As alterações histológicas observadas serão interpretadas e avaliadas juntamente com os dados epidemiológicos e clínico-patológicos obtidos dos Formulários de investigação inicial (FORMI-IN), enviados pela ADEPARÁ juntamente com as amostras, para estabelecimento do possível diagnóstico. RESULTADOS: Foram avaliadas 68 amostras de SNC, sendo 53 de bovinos, 13 de equinos e duas de bubalinos. Das amostras de bovinos 19 eram positivas para raiva pelas técnicas de IFD e/ou IIC, das de equinos 6 (50%) eram positivas e das de bubalino uma. Das amostras de bovinos negativas para raiva, quatro apresentavam lesões compatíveis com infecção por Herpesvírus Bovino tipo 5 (BVH-5), caracterizadas por necrose laminar de neurônios do córtex cerebral, encefalite não supurativa, meningite não supurativa e corpúsculos de inclusão intranucleares em astrócitos. Foi diagnosticado um caso de febre catarral maligna, sendo observado vasculite, caracterizada por infiltração linfoplasmocitária na adventícia e necrose fibrinóide da parede, no córtex cerebral e rete mirabile.; um de polioencefalomalácia, com lesões caracterizadas por caracterizadas por necrose laminar de neurônios do córtex cerebral (descrever melhor as lesões), e um de abscesso na hipófise. Em duas amostras foi observado encefalite não supurativa, não sendo possível estabelecer um diagnóstico etiológico. Em 23 amostras de bovinos não foram observadas alterações significativas. Dessas, em sete os dados analisados do FORM IN permitiram o diagnóstico sugestivo de botulismo, uma vez que se tratava de vacas em final de gestação ou recém paridas, com sinais clínicos caracterizados por 3

4 paralisia flácida e havia histórico de osteofagia e presença de carcaças nas pastagens. Duas amostras (3,6%) estavam impróprios para diagnóstico histopatológico devido a autólise acentuada. Das amostras de equinos negativas para raiva em uma (1) foi diagnosticado infecções por Trypanosoma evansi, baseado nos achados histopatológicos, caracterizados por uma encefalite linfoplasmocitária difusa, com presença de células Mott, e na imunohistoquímica positiva para o agente. Uma amostra apresentava lesões sugestivas de infecção por Sarcosystis neurona. Em quatro amostras não foram observadas alterações no SNC e duas estavam impróprias para diagnóstico devido a autólise acentuada. Nas amostras de bubalinos um era positiva para raiva, sendo observadas lesões semelhantes as dos bovinos. Em outra não havia lesões significativas no SNC. Em todos os casos, após a avaliação histopatológica, foi redigido laudo e encaminhado à ADEPARÁ. PUBLICAÇÕES: Está sendo redigido um artigo científico que será submetido ao periódico Pesquisa Veterinária Brasileira. CONCLUSÕES: Pode-se observar que mais de 70% das amostras de animais com síndrome neurológica encaminhadas eram negativas para raiva, ressaltando a importância de histopatologia e de outras técnicas para o diagnóstico das enfermidades que afetam o SNC. O diagnóstico de outras doenças do sistema nervoso central, como a infecção por HVB-5, a febre catarral maligna e a polioencefalomalácian em bovinos e a tripanossomíase e a infecção por Sarcosystis sp. em equinos, demostra a importância de se estabelecer o diagnóstico diferencial de raiva em animais com síndrome neurológica. Uma doença observada com freqüência nos bovinos deste estudo foi o botulismo. No entanto, ainda há entraves para o diagnóstico definitivo dessa enfermidade, uma vez que os testes utilizados para a detecção da toxina botulínica apresentam baixa eficiência. Neste trabalho o diagnóstico dessa enfermidade foi baseado na epidemiologia, nos sinais clínicos, caracterizados por paralisia flácida, semelhante ao observado na raiva, e na ausência de lesões no SNC. Isso demonstra a necessidade de se estabelecer novas técnicas que possam confirmar os casos sugestivos de botulismo. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: ACHKAR, S.M.; FERNANDES, E.R.; CARRIERI, M.L.; CASTRO, A.B.M.; BATISTA, A.M.; DUART, M.I.S.; KOTAIT, I.; Sensibilidade da técnica de Imuno-histoquímica em fragmentos do sistema nervoso central de bovinos e equinos naturalmente infectados pelo vírus da raiva. Pesquisa Veterinária brasileira. Vol. 30. p Março/

5 ALMEIDA, F.B.P.; Revisão bibliográfica: A raiva e os casos em humanos no Brasil. Revisão bibliográfica (Especialização Lato sensu)- Universidade Castelo Branco-São Paulo BARBOSA T.F.S. et al.; Epidemiologia molecular do vírus da raiva no estado do Pará no período de 2000 a 2005: emergência e transmissão por morcegos hematófagos (Desmodus rotundus). Caderno de saúde coletiva. Vol.15. p BARROS S. L.; DRIEMEIER D.; DUTRA I. S.; LEMOS R. A. A.; Doenças do sistema nervoso de bovinos no Brasil; 1ª ed. p São Paulo-SP BRASIL, MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. Manual técnico: controle da raiva dos herbívoros: Revisão sobre raiva. Pag. 43 Brasília, BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE. Manual de diagnóstico laboratorial da raiva. Brasília BRASIL. Manual técnico: Controle da Raiva dos Herbívoros. Brasília, DF: MAPA / SDA /DSA: p. 102p, 2005b. BRASIL, MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. Disponível em Disponível em<http: / Acesso em 03/07/2013. DEUS G. T.; BECER M.; NAVARRO I. T.; Diagnóstico da raiva em morcegos não hematófagos na cidade de Campo Grande, Mato Grosso do Sul, centro oeste do Brasil: descrição de casos. Ciências agrarias. V 24. n. 1, p , jan/jun MARCOLONGO-PEREIRA C., SALLIS E.S.V., GRECCO F.B., RAFFI, M.B., SOARES M.P. & SCHILD A.L.; Raiva em bovinos na Região Sul do Rio Grande do Sul: epidemiologia e diagnóstico imuno-histoquímico. Pesquisa Veterinária Brasileira. V. 31. p TAKAOKA, N. Y. Raiva. In: MARCONDES, E.; VAZ, F. A. C.; RAMOS, J. L. A.; OKAY, Y. Pediatria basica: pediatria clinica geral. 9.ed. São Paulo: Sarvier, v.2, p

6 PEDROSO P.M.O. et al., Padronização da técnica de imuno-histoquímica para raiva em amostras de sistema nervoso central de bovinos fixados em formol e emblocados em parafina. Pesq. Vet. Bras. 28: PEDROSO P.M.O., COLODEL E.M., PESCADOR C.A., ARRUDA L.P., DRIEMEIR D.; Aspectos Clínicos e patológicos em bovinos afetados por raiva com especial referência ao mapeamento do antígeno rábico por Imunohistoquímica. Pesquisa Veterinária Brasileira. Vol.29. p Novembro/2009. SOUZA, W. Academia Brasileira de Ciências: Doenças negligênciadas, p ; Rio de Janeiro WOLDEHIWET Z.; Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clin. Chim. Acta 351: World Health Organization. Acesso em 03 de Julho de DIFICULDADES - Relacionar os principais fatores negativos que interferiram na execução do projeto. PARECER DO ORIENTADOR: a bolsista teve om desempenho na realização das atividades relativas ao projeto e nas demais atividades propostas. DATA: 10/08/2015 ASSINATURA DO ORIENTADOR ASSINATURA DO ALUNO 6

7 INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Em caso de aluno concluinte, informar o destino do mesmo após a graduação. Informar também em caso de alunos que seguem para pós-graduação, o nome do curso e da instituição. 7

8 FICHA DE AVALIAÇÃO DE RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA O AVALIADOR DEVE COMENTAR, DE FORMA RESUMIDA, OS SEGUINTES ASPECTOS DO RELATÓRIO : 1. O projeto vem se desenvolvendo segundo a proposta aprovada? Se ocorreram mudanças significativas, elas foram justificadas? 2. A metodologia está de acordo com o Plano de Trabalho? 3. Os resultados obtidos até o presente são relevantes e estão de acordo com os objetivos propostos? 4. O plano de atividades originou publicações com a participação do bolsista? Comentar sobre a qualidade e a quantidade da publicação. Caso não tenha sido gerada nenhuma, os resultados obtidos são recomendados para publicação? Em que tipo de veículo? 5. Comente outros aspectos que considera relevantes no relatório 6. Parecer Final: Aprovado ( ) Aprovado com restrições ( Reprovado ( ) ) (especificar se são mandatórias ou recomendações) 7. Qualidade do relatório apresentado: (nota 0 a 5) Atribuir conceito ao relatório do bolsista considerando a proposta de plano, o desenvolvimento das atividades, os resultados obtidos e a apresentação do relatório. Data : / /. Assinatura do(a) Avaliador(a) 8