UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS JULIÂN DA TRINDADE PONTES EFEITO DO CORTISOL SOBRE O DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS OVARIANOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS FORTALEZA - CEARÁ 2015

2 2 JULIÂN DA TRINDADE PONTES EFEITO DO CORTISOL SOBRE O DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS OVARIANOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes. Orientador: Prof. Dr. Claudio Cabral Campello. FORTALEZA CEARÁ 2015

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4 4 JULIÂN DA TRINDADE PONTES EFEITO DO CORTISOL SOBRE O DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS OVARIANOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. Aprovado em :15/12/2015. BANCA EXAMINADORA

5 5 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, nosso Pai celestial, pelo dom da vida, por suas misericórdias que a cada manhã se renovam e seu imensurável amor. A cada manhã que nos levantamos é a oportunidade ideal para louvar e adorar o nome do Senhor, porque o nosso Deus merece o nosso perfeito louvor e a nossa melhor adoração. Se não fosse por Ele não existiríamos, por isso é bom nos lembrarmos d Ele, porque d Ele e por Ele, para Ele são todas as coisas (ROMANOS 11.36). À Universidade Estadual do Ceará (UECE) e ao Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) por minha formação e capacitação profissional. Agradeço em especial a minha querida esposa Pâmela Katrine da Silva Nogueira que foi a base mais sólida que eu poderia ter, que me proporcionou todo apoio e ombro amigo para que eu continuasse forte nesses dois anos de mestrado. Ao meu pai Juarêz, e a minha mãe Adeliana, professora dedicada que me proporcionou o melhor ensino que alguém pode dar o viver de uma vida honesta e digna. Agradeço a minha esposa Pâmela, esposa dedicada que o Senhor preparou para ser a minha eterna namorada, pelo seu imenso amor, apoio e incentivos e por cuidar de mim todos os dias. Aos meus irmãos Andréa e Jonatas, pelo amor em família. Agradeço à minha Família, pelo apoio em todos esses anos de vida, pela educação que com muito amor me deram ensinamentos na vida acadêmica e na vida pessoal. Agradeço ao Prof. Dr. Rodrigo Tenório Padilha, pelo incentivo em busca de uma melhor qualificação profissional e por indicar o LAMOFOPA para realizar este mestrado. A Prof. Dra. Déborah Padilha e a Dra. Valdevane Araújo pelo apoio durante a realização deste mestrado. À Carolina Maside Mielgo, por toda sua contribuição, incentivo, entusiasmo e amizade durante a finalização deste trabalho! À professora Maria Helena Tavares Matos e ao Biofov pela contribuição na realização deste trabalho. Aos funcionários do PPGCV, em especial a Adriana, ao Sr. João e ao Cesár que desde o início me acolheram com carinho.

6 6 Ao meu orientador, professor Cláudio Cabral, por quem tenho tamanha admiração, obrigada por toda a paciência, confiança e ensinamentos transmitidos. Ao prof. José Ricardo de Figueiredo e à profa. Ana Paula Ribeiro Rodrigues, por todo auxílio e incentivo profissional, pela confiança depositada em mim. Aos membros da banca Dra. Deborah de Melo Magalhães Padilha, Dra. Carolina Maside Mielgo e Dra. Jamily Bezerra Bruno, pelo auxílio na finalização desse trabalho e por gentilmente terem aceitado ao convite de participar da minha banca examinadora. Ao grupo de estudo bíblico formado por irmãos em Cristo pós-graduando do Lamofopa. A toda equipe do Lamofopa, e aos que aqui não foram citados que contribuíram direta ou indiretamente para que essa dissertação fosse feita, por toda a amizade e carinho.

7 7 RESUMO O objetivo deste estudo foi identificar a expressão do receptor de glicocorticóides em folículos ovarianos caprino e o efeito do cortisol em diferentes concentrações no cultivo in vitro de folículos pré-antrais inclusos em tecido ovariano caprino. Fragmentos ovarianos foram cultivados por 7 dias na ausência ou presenta de cortisol a diferentes concentrações (0, 1, 5 e 10 ng/ml). Após o cultivo, a identificação da expressão do receptor de glucocorticoids (NR3C1) em tecido ovariano mediante analises inmunohistoquímicos assim como a morfologia, viabilidade, ativação e diâmetro folicular e oocitário foram analisados. Em oócitos, NR3C1 foi fortemente expresso em folículos primordiais e antrais. Foi observado um aumento progressivo na marcação para NR3C1 em células da granulosa desde folículos primordiais a antrais, independentemente do tratamento e tempo do cultivo. Após cultivo, houve uma redução significativa no percentual de sobrevivência de folículos pré-antrais normais no tratamento com 10 ng/ml de cortisol em relação aos demais tratamentos. Além disso, o diâmetro folicular e oocitário diminuíram significativamente em todos os tratamentos (cortisol 0, 1, 5 e 10 ng/ml) quando comparados com o controle fresco sem diferenças entre os tratamentos. No entanto, os percentuais de ativação foram significativamente superiores quando os folículos foram expostos ao cortisol (1, 5 e 10 ng/ml). Em conclusão, pode-se observar a presença do NR3C1 no oócito e nas células da granulosa em todas as categorias foliculares, com um papel mais importante nos estádios mais avançados da foliculogênese. O cultivo in vitro demonstrou que, uma alta concentração do cortisol (10 ng/ml), exerce um efeito deletério na sobrevivência folicular, reduzindo o percentual de morfologia normal e o diâmetro folicular e oocitário. Palavras-chave: Caprino, estresse, cortisol,nr3c1, folículos pré-antrais

8 8 ABSTRACT The aim of this study was to identify the glucocorticoid receptor expression in goat ovarian follicles and the effect of the cortisol in different concentrations on in vitro culture of preantral follicles included in goat ovarian tissue (in situ). Ovarian fragments were cultured for 7 days in the absence or presence of different concentrations of cortisol (1, 5 and 10 ng/ml). After the culture, the expression of the glucocorticoids receptor (NR3C1) was analysed in ovarian tissue by inmunohistoquimico analysis. Moreover, the endpoints morphology, viability, activation and follicular and oocyte diameter were also analyzed. The NR3C1 was strongly expressed in oocytes of antral and primary follicle. A progressive increase in labeling for NR3C1 in granulosa cells from primordial follicles to antral was seen regardless of the treatment and the culture period. After the culture, it was observed a significant (P <0.05) reduction in the percentage of survival of normal preantral follicles in the treatment with 10 ng/ml cortisol when compared to the other treatments. Moreover, follicular and oocyte diameter significantly (P <0.05) decreased in all treatments (cortisol 0, 1, 5 and 10 ng/ml) when compared to the fresh controls. However, there was no differences between treatments. After 7 days of culture, the activation rate increased (P <0.05) when the follicles were exposed to cortisol (1, 5 and 10 ng/ml). In conclusion, it was observed the presence of NR3C1 in the oocyte and granulosa cells in all folicular categories with a more important role in the late stages of folliculogenesis. The in vitro culture showed that high concentrations of cortisol (10 ng/ml) exerts a deleterious effect on follicular survival, reducing the percentage of normal morphology and follicular and oocyte diameter. Keywords: Caprine, stress, cortisol, NR3C1, preantral follicles.

9 9 LISTA DE FIGURAS Figura 1- Ilustração do ovário mamífero e suas estruturas... Figura 2- Caracterização dos folículos ovarinos... Figura 3- Principais avanços obtidos com a utilização de oócitos oriundos de folículos pré-antrais de mamíferos cultivados in vitro

10 10 LISTA DE ABREVIATURAS ACTH ATP BSA CAPES CE CG CGP CNPq CO 2 COCs CRH Corticotropina) CT CYP17 CYP19A1 DAB DNA Dr. Dra. EGF ERK Adrenocorticotropic Hormone (Hormônio Adrenocorticotrófico) Adenosia Trifosfato Bovine Serum Albumin (Albumina Sérica Bovina) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Ceará Células da Granulosa Célula da Granulosa Primordial Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Dióxido de Carbono Cumulus-oocyte complex (Complexo cululus-oocito) Corticotropin Releasing Hormone (Hormônio Liberador de Células da Teca Cytocrome P alpha hydroxylase (Aromatase) Diaminobenzina Desoxynucleic Acid (Ácido Desoxirribonucleico) Doutor Doutora Epidermal Growth Factor (Fator de Crescimento Epidermal) Extracellular Signal-regulate Kinases (Kinases Regulada por Sinais Extracelulares)

11 11 E 2 FSH FAVET FIG. GBC Estradiol Follicle Stimulated Hormone (Hormônio Folículo Estimulante) Faculdade de Veterinária Figura Globulin Binding Corticosteroid (Globulina Ligadora de Corticosteróide) GnRH Gonadotropin-releasing Hormone (Hormônio Liberador de Gonadotropina) GR H HC HPA HSP IgG IHC IVM LAMOFOPA LH MAPK Glucocorticóide Receptor (Receptor de Glicocorticoids) Horas Histologia Clássica Hipothalamic-pituitary-adrenal (Hipotálamo-Pituitário-Adrenal) Heta Shock Portein (Porteína de Choque Térmico) Imunoglobolina G Immunohistochemistry (Imunohistoquímica) In vitro Maturation (Maturação in vitro) Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais : Luteinizing Hormone (Hormônio Luteinizante) Mitogen-activated Protein Kinases (Kinases Ativados por Mitógeno) MEM MET Mg Minimal Essential Medium (Meio Essencial Mínimo) Microscopia Eletrônica de Transmissão Miligramas

12 12 MOIFOPA Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré- antrais mrna MII NA NR3C1 Messenger ribonucleic acid (Ácido ribonucléico mensageiro) Metaphase II (Metáfase II) Not Applicable (Não Aplicável) Nuclear Receptor Subfamily 3, Group C, Member 1 (Receptor Nuclear Subfamília-3, Grupo C, Membro -1) PBS ph RNAm RT-PCR Phospate Buffered Saline (Tampão Fosfato-salino) Potencial de Hidrogênio Ribonucleic Acid Messenger (Ácido Ribonucleico mensageiro) Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Transcrição Reversa Reação em Cadeia da Polimerase) Vol. ZP Volume Zona Pelúcida % Porcentagem 3βHSD 2D 3D 3β hydroxysteroid dehydrogenase Bidimensional Tridimensional GDF-9 TCM Tissue Cultered Medium (Meio de Cultivo de Tecido) p. página PPGCV PVN Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias Paraventricular Nucleos of Hipothalamus (Núcleo Paraventricular

13 13 do Hipotálamo) P 34cdc2 Cyclin-dependent Kinase 1 (Ciclina Dependente de Kinase 1) P<0.05 Probabilidade de Erro Menor do que 5% SAS SEM StAR Statistical Analysis System (Sistema de Análise Estatística) Standard Erros of Means (Erro Padrão da Média) Steroidogenic Acute Regularoty protein (Proteína Reguladora Aguda da Esteroidogenese) UECE α-mem Universidade Estadual do Ceará Alpha Minimal Essential Medium (Meio Essencial Mínimo Alpha) µg Microgramas µl Micolitros µm Micrômetro µm Micromolar ~ Aproximadamente < Menor = Igual > Maior ± Mais ou Menos Maior ou igual

14 14. Sumário 1 INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA OVÁRIO MAMÍFERO OOGÊNESE E FOLICULOGÊNESE POPULAÇÃO E ATRESIA FOLICULAR ESTEROIDOGÊNESE FOLICULAR CORTISOL CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS SISTEMAS DE CULTIVO IMPORTÂNCIA DO MEIO DE CULTIVO TÉCNICAS PARA AVALIAÇÃO DO CULTIVO IN VITRO CAPÍTULO I PAPEL DO CORTISOL NA FOLICULOGÊNESE OVARIANA JUSTIFICATIVA HIPÓTESE CIENTÍFICA OBJETIVOS OBJETIVOS GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS CAPÍTULO II - IMMUNOLOCALIZATION FOR GLUCOCORTICOID RECEPTOR AND EFFECT OF CORTISOL ON IN VITRO DEVELOPMENT OF CAPRINE PREANTRAL FOLLICLES CONCLUSÃO.65 9 PERSPECTIVA...66 REFERÊNCIAS

15 15 1 INTRODUÇÃO As técnicas de reprodução assistida passaram a ser uma prerrogativa fundamental para o aumento da eficiência reprodutiva em animais de produção. Nesta categoria animal, especialmente os ruminantes domésticos como a espécie caprina, a utilização de biotécnicas reprodutivas estão sendo utilizadas com sucesso para contornar os baixos índices de reprodução. Esses baixos índices são reflexos de um manejo inadequado que, por sua vez, expõe cada vez mais os animais a situações de estresse elevando os níveis de cortisol comprometendo a função reprodutiva (CHAVES et al., 2013). Uma alternativa para avaliar os possíveis efeitos que o cortisol causa nos ovários é a MOIFOPA (manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais), biotécnica bastante utilizada para o estudo da foliculogênese, identificando os mecanismos pelos quais diferentes substâncias atuam no ovário mamífero (FIGUEREDO et al., 2008). Na reprodução, uma gama de fatores atua no desempenho reprodutivo, como o estado nutricional, genética do animal e a produção hormonal, entre os hormônios destaca-se o cortisol. Geralmente caracterizado como o hormônio do estresse, o cortisol é produzido na zona fasciculada no córtex da glândula adrenal e desempenha um papel importante em diversos processos fisiológicos como o sistema imunológico, metabólico e reprodução (MICAHEL et al., 2003). No sistema reprodutivo, a produção excessiva de cortisol afeta diretamente o eixo hipotalâmico-hipofisário inibindo a secreção do hormônio liberador de gonadotrofinas - GnRH, como consequência disto, ocorre um bloqueio na liberação de hormônios hipofisário, hormônio folículo estimulante FSH e hormônio luteinizante - LH) (MACFARLANE et al., 2000; BREEN et al., 2005) e, diretamente nos ovários, o cortisol inibe a secreção de hormônios produzidos localmente pelos folículos com o estradiol - E 2 (BREEN et al., 2005), comprometendo a qualidade do desenvolvimento folicular. Dado a importância deste estudo, para uma melhor compreensão da sua relevância, a seguir serão abordados os aspectos relacionados à estrutura do ovário, oogênese e foliculogênese, população e atresia folicular, MOIFOPA, cultivo in vitro de folículos pré- antrais e cortisol.

16 16 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 OVÁRIO MAMÍFERO O ovário é o principal órgão do sistema reprodutor feminino, o qual é constituído de duas regiões distintas: a medular e a cortical. Na maioria das espécies a região medular localiza-se mais internamente no ovário, sendo composta de tecido conjuntivo, nervos, artérias e veias, responsáveis pela sustentação e nutrição deste órgão (SILVA, 2005). O córtex ovariano por sua vez, é a porção mais externa do ovário, considerado a porção funcional, sendo composta por células germinativas (oócitos) e somáticas (células da granulosa - CG, da teca CT e do estroma), as quais interagem e organizam a formação dos folículos ovarianos (MCGEE; HSUEH, 2000). Em decorrência da ovulação, o folículo ovariano sofre transformação na sua estrutura dando origem ao corpo lúteo, estrutura também presente no córtex. O ovário desempenha duas importantes funções fisiológicas, a saber: gametogênica e endócrina. A função gametogênica está relacionada à produção de oócitos maturos (ovulação) aptos a serem fecundados (BARNETT et al., 2006) enquanto que a função endócrina esta relacionada a produção de hormônios, fatores de crescimento e peptídeos (HIRSHFIELD, 1991). A interação destas duas funções é essencial para a manutenção da fertilidade. Figura 1: Ilustração do ovário mamífero e suas estruturas. Adaptado de

17 OOGÊNESE E FOLICULOGÊNESE Segundo VAN DEN HURK; ZHAO, (2005) a oogênese consiste na formação e diferenciação das células germinativas primordiais (CGP) culminando com a formação do oócito haploide fecundado. A foliculogênese por sua vez, pode ser compreendida pelo processo de formação e desenvolvimento (crescimento e maturação) folicular, o qual se inicia na vida intrauterina/pré-natal em ruminantes e primatas (BEZERRA et al., 1998). Este processo é decorrente da diferenciação das células germinativas primordiais (CGP) e formação dos folículos primordiais culminando com o estágio de folículos préovulatórios (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). O folículo ovariano é a unidade morfológica e funcional do ovário de mamíferos, é responsável por proporcionar um ambiente ideal capaz de assegurar a viabilidade, nutrição e desenvolvimento (crescimento e maturação) no oócito nele incluso (CORTVRINDT; SMITZ, 2001) e produzir hormônios e peptídeos (ADASH, 1994). No interior dos folículos ovarianos encontra-se um oócito imaturo circundado por células somáticas (granulosas e tecais), estes folículos podem ser classificados em pré-antrais ou não cavitários (primordiais, transição, primários e secundários) e antrais ou cavitários (terciários ou pré-ovulatórios) de acordo com o grau de evolução. (FIGUEIREDO et al., 2008). Figura 2: Caracterização dos folículos ovarinos: Folículos pré-antrais (1-3). Folículo primordial (1). Folículo primário (2). Folículo secundário (3). Folículos terciário (4). Folículos pré-ovulatório (5).

18 18 Os folículos primordiais representam o pool de reserva dos folículos ovarianos, sendo que estes folículos representam 95% da população folicular do ovário. No interior dos folículos primordiais encontra-se um oócito imaturo em estado de quiescência circundado por uma camada de células da pré-granulosa deforma pavimentosa (JUENGEL et al., 2002). As características morfológicas que marcam o início do crescimento de folículos primordiais são: aumento do diâmetro oocitário, proliferação das células da granulosa e transformação do formato destas células de pavimentoso para cúbico. Durante esta fase, os folículos que apresentam células da granulosa de ambos os formatos pavimentoso e cúbico são denominados intermediários ou de transição (BARNETT et al., 2006). A fase de transição de transição de folículo primordial para folículo primário caracteriza a ativação folicular e, alguns estudos tem demostrados que é uma fase pouco dependente de gonadotrofinas, sendo sua regulação mediada por fatores intraovarianos (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005). Os folículos primários são o primeiro estádio de crescimento após a saída do pool de reserva, são morfologicamente caracterizados pela presença de uma única camada completa de células da granulosa de forma cúbica em torno do oócito (SILVA, 2005). Neste estádio de desenvolvimento há o aparecimento da Zona Pelúcida (ZP), a qual é formada por três glicoproteínas denominadas ZP1, ZP2 e ZP3 produzidas pelo próprio oócito, com função de protegê-lo. Este evento é uma característica notável neste estádio de desenvolvimento (RANHIN et al., 2001). Os folículos secundários são caracterizados pelo aumento do oócito e proliferação das células da granulosa, as quais formam duas ou mais camadas completas de células com formato cúbico. Neste estádio também surgem as primeiras células da teca (SILVA et al., 2004). As células da granulosa apresentam uma extensiva rede de comunicações denominadas junções do tipo Gap. Essas junções do tipo Gap são canais membranários que promovem a interação entre o oócito e as células da granulosa. As junções do tipo Gap são compostas por proteínas denominadas Conexinas, ocorrem em locais de próxima aposição celular, são estruturas de comunicação intercelular que permitem a passagem de nutrientes, íons inorgânicos, segundos mensageiros e pequenos metabólitos entre as células até chegar ao oócito que esta em constante crescimento (KIDDER; MHAWI, 2002). Sabe-se que a interação entre o oócito e as células da granulosa via junções do tipo Gap, é essencial para o crescimento do oócito, maturação citoplasmática, comunicação intercelular, e inclusive para a liberação de fatores como o

19 19 GDF-9 e BMP originários do oócito, que tem ação anti-apoptótica sobre as células da granulosa (HUSSEIN et al., 2005). Os folículos antrais são formados a partir de uma intensa proliferação e organização em várias camadas das células da granulosa resulta no crescimento dos folículos, como consequência um aumento da atividade metabólica por estes tipos celulares culmina com a produção em grandes quantidades de substâncias, que se acumulam entre as células da granulosa caracterizando a formação de uma cavidade repleta de líquido denominada antro folicular (DRIANCOURT, 2001). O fluido folicular que preenche esta cavidade contém água, eletrólitos, proteínas séricas e alta concentração de hormônios esteróides secretados pelas células da granulosa (BARNETT et al., 2006). 2.3 POPULAÇÃO FOLICULAR E ATRESIA A população de folículos ovarianos vária de entre espécies e entre indivíduos em função de inúmeros fatores como: raça (CAHILL; MARIANA; MAULÉON, 1979), idade (ERICKSON, 1966; RÜSSE, 1983), produção hormonal (PETERS, 1976), genética (ERICKSON, 1966) e status reprodutivo e nutricional (ERICKSON; REYNOLDS; MURPHREE, 1976; SCARAMUZZI et al., 1993). É sabido que o total de folículos presentes no ovário é definido na vida intrauterina em ruminantes (KNIGHT; GLISTER, 2006) e poucos dias após o nascimento em roedores (OJEDA et al., 2000), sendo de em bovinos (SILVA-SANTOS et al., 2011), em ovinos (AMORIM et al., 2000), em caprinos (LUCCI et al., 1999) e aproximadamente na mulher (ERICKSON, 1986). Apesar do grande população folicular presente no ovário mamífero, é sabido que aproximadamente 99,9% dos folículos são eliminados pelo processo fisiológico conhecido como atresia folicular, diminuindo assim o potencial reprodutivo das fêmeas. A atresia ocorre por um processo de morte celular programada conhecido por apoptose (TSAFIRI; BRAW, 1984). O destino final dos folículos ovarianos, sendo ovulação ou atresia, é dependente de um balanço entre diferentes fatores endócrinos, parácrinos e autócrinos que promovem a sobrevivência e aqueles que induzem a apoptose (HSU; HSUEH, 2000). Diante disso, visando evitar a enorme perda folicular que ocorre naturalmente in vivo pela atresia, nas últimas décadas têm sido desenvolvidos vários sistemas de cultivo

20 20 in vitro de folículos pré-antrais e antrais que possibilitam o estudo dos fatores que controlam a atresia e o crescimento folicular. 2.4 ESTEROIDOGÊNESE FOLICULAR A produção de hormônios esteróides no ovário é importante para assegurar o desenvolvimento normal do folículo. Sendo assim, o controle da produção hormonal pelo ovário é orquestrado pela interação entre folículos e oócitos com a hipófise, nos quais os hormônios de origem ovariana exercem uma retro-alimentação negativa ou positiva sobre a produção e secreção de gonadotrofinas pela hipófise. A ação dos esteroides nas suas células-alvo ocorre através receptores nucleares específicos, as quais já foram localizados nos ovários (estroma, CG e CT) ovinos (JUENGEL et al., 2006) A biossíntese de esteróides é iniciada a partir do colesterol, sendo o precursor desses hormônios. Deste modo, as células foliculares especializaram-se em sintetizar o colesterol, uma vez que estas células expressam as enzimas do complexo enzimático P450. A proteína StAR é responsável pelo transporte do colesterol da membrana externa da mitocôndria para a interna, onde se localiza a enzima desmolase, participante da conversão do colesterol em pregnenolona (GIOMETTI et al., 2009). A pregnonelona sob ação da enzima 3β hidroxidesidrogenase é convertida em progesterona que pode servir de substrato para a produção de androstenediona via enzima 17,20-liase ou apresentar ação biológica (VALDEZ et al., 2005; MIZRACHI E AUCHUS, 2009). A androstenediona quando não é destinada a exercer sua função, pode ser convertida em testosterona pela enzima 17β- redutase, que por sua vez, converter-se em dihidrotestosterona pela enzima 5α-redutase ou penetrar nas células da granulosa ou estradiol pela enzima aromatase (DRUMMOND E FINDLAY, 1999; YARAK et al., 2005; STOCCO, 2008). O estradiol também pode ser produzido por uma segunda via, na qual a androstenediona sofre aromatização nas células da granulosa e é convertida em estrona, e esta em estradiol, pela enzima 17β-redutase (YARAK et al., 2005). O estradiol E 2 juntamente com o estriol e estrona compõem os hormônios estrogênios sendo o mais potente deles. Os folículos começam a sintetizar estradiol nos estádios de pré-antrais avançados (Drummond e Findlay, 1999). E a ação desses

21 21 hormônios são mediadas são mediadas nos tecidos específicos por, pelo menos, dois tipos de receptores (ER) denominados ERα e ERβ (Tomic et al., 2007). Altos níveis de estradiol normalmente acarretam uma redução na secreção de FSH nas células da granulosa em momentos próximos a ovulação, sendo então relacionados à redução da fertilidade. Devido o inicio do processo de ovulação, inicia-se a luteinização das células induzindo a produção de progesterona. A progesterona, por sua vez, é secretada pelas células da granulosa e teca e células estroma ovariano, além de células luteais. Duas forma de receptores de progesterona são descritos, a PRA e PRB (GAVA et al., 2004). Existe ainda, a hipótese de a progesterona exerce uma ação luteotrópica local, estimulando a sua própria produção e liberação (ROTHCHILD et al., 1991). Desta forma, estradiol e progesterona são importantes hormônios reguladores da foliculogênese, que atuam de forma isolada ou conjunta com outras hormônios atuando diretamente nas células via receptores. 2.5 CORTISOL O cortisol é produzido na zona fasciculada no córtex da glândula adrenal. Pertencente à classe dos hormônios esteróides, os glicocorticoides, com o principal representante o cortisol, diferem dos outros hormônios esteróides por apresentarem receptores específicos. A biodisponibilidade do cortisol na corrente sanguínea se dá através da associação com proteínas plasmáticas (ROSNER, 1991). Sendo que 96% deste hormônio encontra-se ligado a glubulinas ligadoras de corticosteróides (CGB) ou Transcortina e a albumina e dessa forma o cortisol encontra-se inativo. Apenas 4% do cortisol encontra-se na forma livre (desassociado de proteínas) caracterizando-o como biologicamente ativo (MICHAEL, 2003). As ações do cortisol são mediadas através do receptor de glicocorticoides (glucocorticoids receptor - GR) presente no interior das células. O GR pertencente à superfamília de receptores nucleares NR3C1 e já foram detectados na maioria dos tecidos (ADCOCK, 2000), inclusive em tecido ovariano de camundongas (ILLERA et al., 2005). É sabido que a biodisponibilidade do cortisol depende da ação da enzima 11β-hidroxiesteróide desidrogenase (11β-HSD) tipo 1 e 2, que tornam o cortisol ativo ou inativo no interior das células. Quando ligado ao seu receptor, o cortisol é translocado para o núcleo onde atua como fator de transcrição.

22 22 Em níveis basais, o cortisol é essencial para preservar a homeostasia e o equilíbrio interno de funções como o sistema imunológico, metabólico e reprodutivo (ANDERSEN, 2002). No entanto, o aumento nos níveis plasmáticos desse hormônio é oriundo de condições estressantes. Em animais estressados, a função reprodutiva é comprometida, uma vez que o aumento dos níveis de cortisol inibe a secreção de GnRH no hipotálamo, bem como a liberação de FSH, além de reduzir a frequência do pulso LH, bem como uma diminuição no pico pré-ovulatório de LH em ovelhas (MACFARLANE et al., 2000; BREEN et al., 2005). A nível folicular, o cortisol pode inibir a secreção de estradiol, isso contribuirá para interrupção do desenvolvimento folicular e ovulação (BREEN et al., 2005). No tocante a morfologia folicular, em animais estressados ocorre uma redução no diâmetro de folículos dominantes acarretando danos a sua estrutura, porém alguns folículos podem completar seu desenvolvimento chegando a ovular oócitos subférteis (LUCY et al., 2001). Portanto, o cortisol é um importante hormônio ligado ao estresse e sua influência na reprodução tem sido pesquisada, no entanto os efeitos que esse hormônio faz na reprodução ainda não são totalmente conhecidos, podendo atuar em vários níveis do sistema reprodutivo. 2.6 CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS O cultivo in vitro de folículos pré-antrais, também conhecido como Ovário Artificial, é uma importante etapa da MOIFOPA que vem sendo largamente empregada com o intuito de avaliar o efeito de diferentes substâncias, em diferentes concentrações e em diferentes fases do desenvolvimento folicular, desde a ativação até a produção de oócitos maturados (FIGUEIREDO et al., 2011). Sendo assim, o cultivo in vitro destaca-se como uma importante técnica para elucidar mecanismos que controlam a foliculogênese e atresia folicular. A MOIFOPA consiste no isolamento ou regate de folículos pré-antrais do ambiente ovariano, seguido da conservação por curto (resfriamento) ou longo período (congelamento) e/ou cultivo folicular, visando-se a estocagem, bem como o crescimento, maturação e fecundação in vitro dos oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (FIGUEIREDO et al., 2008). Atualmente, esta biotécnica tem contribuído para elucidar a foliculogênese inicial, no entanto, para alcançar o objetivo final com a produção de crias vivas é necessário garantir crescimento folicular,

23 23 maturação oocitária adequada e posterior fecundação dos oócitos pré-antrais através de um sistema de cultivo eficiente. Com uma perspectiva futura desta técnica, a MOIFOPA poderá contribuir para a multiplicação de animais de alto valor zootécnico ou em via de extinção através do fornecimento de um grande número de oócitos provenientes de um mesmo animal, os quais poderão ser destinados aos programas de produção in vitro de embriões ou clonagem e posterior transferência de embriões (FIGUEIREDO et al., 2008). Figura 3: Principais avanços obtidos com a utilização de oócitos oriundos de folículos pré-antrais de mamíferos cultivados in vitro. (Chaves et al., 2010) 2.7 SISTEMAS DE CULTIVO Para alcançar sucesso no cultivo in vitro de folículos é necessário o uso de métodos que permitam o isolamento folicular adequado sem que haja danos na estrutura folicular. Além disso, o sistema de cultivo adotado tem como objetivo promover um crescimento in vitro adequado que possibilite a manutenção da viabilidade de folículos pré-antrais e a obtenção de oócitos aptos à fertilização, diversos sistemas de cultivo têm sido desenvolvidos para atender a esse objetivo (VAN DEN HURK et al., 2000). Atualmente dois sistemas de cultivos são comumente empregados em estudos no cultivo in vitro de folículos pré-antrais, no entanto a escolha do sistema de cultivo é determinada de acordo com os objetivos a serem estudados.

24 24 O sistema de cultivo in situ é caracterizado pelo cultivo de folículos pré-antrais inclusos no próprio tecido ovariano, utilizando pequenos fragmentos do córtex ovariano ou ainda utilizando o ovário inteiro. Este sistema torna-se bastante prático uma vez que permite a manutenção da integridade tridimensional natural dos folículos, bem como a interação destes com as células do estroma ovariano. No modelo isolado os folículos podem ser cultivados de maneira bidimensional, aderidos diretamente à placa de cultivo ou a uma monocamada de substrato e ainda na forma tridimensional (DEMEESTERE et al., 2005). Este sistema de cultivo possibilita acompanhar de forma individual os folículos durante o cultivo, favorecendo a perfusão do meio e o fornecimento de nutrientes. Existe ainda o sistema de cultivo em dois passos, neste modelo é efetuado inicialmente o cultivo dos folículos no córtex ovariano (in situ), maximizando a ativação folicular e o crescimento dos folículos primordiais até o estádio de secundários e em sequência o isolamento e o cultivo dos folículos secundários isolados (TELFER et al.,2008). Utilizando o modelo de cultivo em dois passos, possibilitou avanços obtidos no cultivo in vitro de folículos pré-antrais, com resultados satisfatórios obtidos na espécie murina, com a obtenção de crias viáveis a partir do cultivo de oócitos oriundos de folículos pré-antrais (O BRIEN et al., 2003). No entanto, nas espécies domésticas, as taxas de maturação e produção de embriões oriundos do cultivo in vitro de folículos pré-antrais ainda são variáveis. Em caprinos, por exemplo, foram obtidos apenas três embriões após a fertilização in vitro de oócitos oriundos de folículos pré-antrais cultivados in vitro (SARAIVA et al., 2010; MAGALHÃES et al., 2011). 2.8 IMPORTÂNCIA DO MEIO DE CULTIVO O sucesso no desenvolvimento, crescimento e maturação folicular in vitro depende de vários fatores, com destaque para a composição do meio no qual serão cultivados os folículos. Diferentes meios comerciais podem influenciar o cultivo in vitro de folículos ovarianos, estimulando a sobrevivência e o crescimento folicular (LIMA et al., 2012). Dentre os meios podemos destacar o meio essencial mínimo (MEM) e suas modificações (α-mem, MEM Glutamax, etc.), o meio de cultivo de tecido (TCM 199), além de outros meios como o McCOy s, Waymouth, Leibowitz e Menezo B2 (ROCHA, 2013). A maioria dos meios de cultivo de base é suplementada com tampões, antibióticos, antioxidantes e fontes protéicas (FIGUEIREDO et al., 2008). Outras

25 25 substâncias também são adicionadas ao meio de cultivo como: insulina, transferrina, selênio, hormônio folículo estimulante (MAGALHÃES et al., 2009), proteína morfogenética óssea-7 (ARAÚJO et al., 2011) e albumina sérica bovina (RODRIGUES et al., 2010). Sendo assim, avaliar o efeito de diversas substâncias, por exemplo, o cortisol o desenvolvimento folicular poderá contribuir para elucidação da foliculogênese. 2.9 TÉCNICAS PARA AVALIAÇÃO DO CULTIVO IN VITRO Atualmente existem várias técnicas disponíveis que permitem a avaliação da qualidade folicular. As principais técnicas utilizadas permitem observar a ativação folicular, mudanças na morfologia do folículo e oócito e produção de hormônios e esteroides pelo folículo durante o crescimento in vitro. Para cada parâmetro a ser avaliado existe uma técnica específica, porém a associação de mais de uma técnica permite observar de forma mais precisa a qualidade folicular (MATOS et al., 2007). As principais técnicas utilizadas para detectar alteração ou degeneração folicular são: Histologia Clássica (HC) e Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET). A Histologia Clássica (HC) permite verificar mudanças na morfologia do citoplasma e do núcleo, mais especificamente permite verificar o número e a mudança no formato das células da granulosa através da ativação folicular e avaliar a integridade do oócito e das células da granulosa. A Histologia Clássica é uma técnica quantitativa, pois possibilita avaliar um grande número de folículos (MATOS et al., 2004), porém, não é possível avaliar a integridade das organelas citoplasmáticas ou atividade enzimática dos folículos ovarianos (GOSDEN, 2000). No tocante a integridade das organelas citoplasmáticas ou avaliar a atividade enzimática dos folículos ovarianos utiliza-se a Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) uma técnica qualitativa que permite a avaliação de mudanças ultra-estruturais corridas durante a atresia folicular, sendo destacada sua importância após conservação in vitro de folículos pré-antrais caprinos e ovinos, mostrando que folículos considerados normais, após a avaliação histológica, podem apresentar alterações degenerativas na sua ultraestrutura (MATOS et al., 2004; SANTOS et al., 2006). Existem outras técnicas que permitem a avaliação da viabilidade folicular e apoptose com o uso de microscopia de fluorescência e corantes vitais. Esta técnica

26 26 utiliza marcadores fluorescentes que, ao serem excitados com radiação de baixo comprimento de onda, absorvem energia e emitem luz de comprimento de onda maior (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Por ser uma técnica rápida, confiável e prática para avaliação da viabilidade folicular antes ou após estudos de cultivo in vitro (CORTVRINDT; SMITZ, 2001; LOPES et al., 2009), a microscopia de fluorescência vem sendo comumente adotada para análise de folículos pré-antrais e oócitos após a maturação in vitro (MIV) (ROSSETTO et al., 2009; BRUNO et al., 2009; CELESTINO et al., 2011; MAGALHÃES-PADILHA et al., 2012). A calceína acetoximetil (calceína- AM), o etídio homodímero-1 (EthD-1) e o Hoescht são os corantes mais utilizados na microscopia de fluorescência. Outras técnicas que vêm sendo bastante utilizadas são as técnicas de biologia molecular, que podem ser realizadas antes, durante e após o cultivo in vitro de folículos pré-antrais, com o intuito de identificar e quantificar o local de atuação e produção de cada substância (ligante e receptor) envolvidas nas diferentes etapas do desenvolvimento folicular. Uma técnica bastante utilizada é a Reação de Transcriptase Reversa em Cadeia de Polimerase em tempo real (qrt-pcr) (KREUZER; MASSEY, 2002) que permite uma análise da quantificação relativa da expressão gênica em determinado tecido ou amostra biológica, utilizando um sistema fluorescente em plataforma capaz de detectar a luz oriunda da reação de amplificação de um determinado gene no momento real da amplificação (BUSTIN, 2002). Através desta técnica e da RT-PCR convencional, tornou-se possível identificar diferentes substâncias, como hormônios e fatores de crescimento, presentes em folículos ovarianos caprinos (CELESTINO et al., 2011; FROTA et al., 2011; ALMEIDA et al., 2012; MAGALHÃES et al., 2012). Além das técnicas citadas, a dosagem hormonal também é uma ferramenta que auxilia na avaliação do cultivo in vitro. Hormônios esteroides, tais como progesterona, e estradiol podem ser mensurados em meio de descarte, ou seja, meios retirados durante as trocas, podendo ou não, serem avaliados utilizando radioimunoensaio ou ensaio imunoenzimático (enzime-linked immunosorbent assay- ELISA).

27 27 Capitulo I PAPEL DO CORTISOL NA FOLICULOGÊNESE NOS MAMÍFEROS

28 28 Resumo Os glicocorticóides são hormônios essenciais para a manutenção do equilíbrio de funções vitais para o organismo como a função imunológica e especialmente a reprodutiva. O cortisol é o principal glicocorticoide produzido na glândula adrenal, sua produção e liberação segue o ritmo circadiano, resultando em níveis basais. Porém frente a situações de estresse que provoca um aumento acentuado nas concentrações de cortisol, desta forma o excesso desse hormônio é prejudicial para todas as funções do organismo. Em tecidos alvos, o cortisol é ativado pela enzima 11βHSD e desta forma, se liga ao receptor de glicocorticóide presente no citoplasma das células. Após a ligação com o receptor, o cortisol é translocado para o núcleo onde atua como fator de transcrição. Alguns indícios sugerem que o receptor de glicocorticóide esta presente no ovário, uma vez que esse que o cortisol foi identificado no fluido folicular, bem como a sua associação com a maturação oocitária, resultado da presença de maiores concentrações de cortisol com a maturação de oócitos em humanos. Porém, grandes concentrações de cortisol podem interromper o desenvolvimento folicular, principalmente a esteroidogênese folicular, suprimindo a produção de hormônios esteróides pelos folículos. Além disso, A longa exposição ao estresse pode interromper a função reprodutiva. Desta forma, visto a importância deste hormônio para o organismo, principalmente o sistema reprodutivo, são necessários mais estudos visando elucidar o papel do cortisol na função reprodutiva.

29 29 INTRODUÇÃO Na reprodução, uma gama de fatores atua no desempenho reprodutivo, como o estado nutricional, genética do animal e a produção hormonal, entre os hormônios destaca-se o cortisol. Geralmente caracterizado como o hormônio do estresse o cortisol é produzido na zona fasciculada no córtex da glândula adrenal e desempenha um papel importante em diversos processos fisiológicos como o sistema imunológico, metabólico e reprodução (MICAHEL et al., 2003). No sistema reprodutivo, a produção excessiva de cortisol afeta diretamente o eixo hipotalâmico-hipofisário inibindo a secreção d hormônio liberador de gonadotrofinas - GnRH, como consequência disto, ocorre um bloqueio na liberação de hormônios hipofisário, hormônio folículo estimulante FSH e hormônio luteinizante - LH (MACFARLANE et al., 2000; BREEN et al., 2005) e diretamente nos ovários, o cortisol inibe a secreção de hormônios produzidos localmente pelos folículos com o estradiol - E 2 (BREEN et al., 2005) comprometendo a qualidade do desenvolvimento folicular. A detecção de níveis de cortisol no fluído folicular (FATEH, 1989; ACOSTA, 2005) e a presença de receptores de glicocorticoides em células ovarianas de camundongas (ILLERA et al., 2005) são indicativo da participação deste hormônio no processo da foliculogênese ovariana. Com base nas informações apresentadas, a presente revisão objetivou abordar de maneira geral alguns aspectos relacionando a influencia dos glicocorticóides, em especial o cortisol, caracterizando sua síntese, receptores, mecanismo de ação e enfatizando sua ação no sistema reprodutivo feminino. CORTISOL O cortisol (C 21 H 30 O 5 ) é o principal hormônio representante da classe dos hormônios glicocorticóides, este hormônio é sintetizado na zona fasciculada no córtex da glândula suprarrenal. Após a produção do cortisol, sua liberação na corrente sanguínea é regida sob controle neuroendócrino através do eixo hipotalâmicohipofisário-adrenal (HPA) e sua disponibilidade se dá através da ligação com proteínas plasmáticas, dentre elas as globulinas ligadoras de corticosteróides (CGB) ou Transcortina, a albumina e por último, pode ser encontrado na forma livre, a qual é considerada a fração biologicamente ativa (ESCHER et al., 1997; ANDERSEN, 2003). Em células alvos a ação dos glicocorticóides é mediada pelo receptor de

30 30 glicocorticóides (GR) um membro da superfamília dos receptores nucleares (NR3C1) (GRIEKSPOOR et al., 2007) Os glicocorticóides são hormônios esteróides essenciais para manter a homeostasia, comumente envolvidos no controle de numerosas funções fisiológicas vitais, tanto através da regulação do metabolismo celular genômico e do ciclo celular, bem como através de efeitos não genômicos sobre o metabolismo das células e sinalização (SCHONEVELD et al., 2004; OGIAS et al., 2009; BORSKI, 2000). Entre essas funções, a saber, o metabolismo, ações anti-inflamatórias e imunossupressoras e o sistema reprodutivo. Níveis endógenos de cortisol são controlados pela ativação do eixo HPA, enquanto que níveis intracelulares deste hormônio além de estarem sob controle deste eixo também são controlados pelas enzimas 11-β hidroxiesteróide desidrogenase (11βHSD) que ativa (11βHSD1) ou inativa (11βHSD2). LOCAL DE PRODUÇÂO Sendo um dos principais hormônios que regem funções fisiológicas vitais, a síntese de cortisol pela glândula adrenal esta sob controle do eixo hipotálamo-hipófiseadrenal que depois de ativado tem como produto final a produção de cortisol. Devido ao intenso metabolismo, o organismo torna-se carente deste hormônio. A síntese de cortisol ocorre naturalmente de acordo com a necessidade do organismo ou em decorrência a distúrbios envolvendo os sistemas que controlam sua produção. Em um estado de homeostase, o organismo produz inúmeras substâncias em níveis adequados para manter a capacidade de se adaptar ao meio. Em níveis adequados as catecolaminas ativam neurônios parvocelulares situados no núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN). Estes neurônios estão relacionados no controle da atividade simpática e cardiovascular, bem como, na liberação de hormônios que atuam na hipófise anterior. Posteriormente a ativação dos neurônios do núcleo paraventricular no hipotálamo, ocorre à produção do hormônio liberador de corticotropina (CRH). Este por sua vez, controla a atividade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal pela ação na hipófise anterior controlando a liberação do hormônio adrenocorticotrófico (adrenocorticotropic hormone-acth) produzido pelas células corticotróficas da hipófise anterior. Ao ser liberado o ACTH chega via corrente sanguínea na glândula adrenal e atua sobre a região cortical iniciando a síntese e liberação de glicocorticóides em especial o cortisol, estimulando também o aumento dessa região mantendo a integridade da mesma.

31 31 No interior do córtex adrenal na zona fasciculada a síntese de cortisol assim como todos os hormônios esteróides inicia com uma molécula precursora de colesterol é convertido em diferentes esteróides. O primeiro passo da esteroidogênese ocorre dentro da mitocôndria quando o colesterol presente no interior das células da zona fasciculada é transportado para interior da membrana mitocondrial pela proteína StAR (steroidogenic acute regulatory proteis-star), o colesterol é convertido a pregnonelona pela enzima P450 de clivagem de cadeia lateral (side-chain cleavage P450 - P450scc) uma enzima mitocondrial membro da superfamília de enzimas citocromo P450 de gene CYP11A1. A seguir a enzima 17α-hidroxilase (CYP17A1) atua sobre a pregnonelona desta vez fora da mitocôndria, no retículo endoplasmático, convertendo-a em 17αhidroxipregnonelona que por sua vez é degradada em 17-hidroxiprogesterona em resposta a ação da 3β-hidroxiesteróide desidrogenase (3β-HSD). Seguindo a via esteroidogênica da síntese de cortisol, a formação de 11-Deoxicortisol é resultado da ação da enzima 21-hidroxilase (CYP21) e por último, como resultado final a enzima 11β-hidroxilase (CYP11B1) presente nas células da zona fasciculada atua promovendo a hidroxilação do carbono na posição 11 (C11) do composto 11-Deoxicortisol formando cortisol. Figura 1: Síntese de cortisol.

32 32 RECEPTOR DE GLICOCORTICÓIDES Os glicocorticóides diferenciam-se dos demais hormônios esteróides por apresentarem receptores específicos que são encontrados em quase todos tecidos. Nas células alvos existem numerosos sítios de ligação dos glicocorticóides que variam de a por célula (ADCOCK, 2000), possibilitando ampla ação em diversas funções fisiológicas. Estes hormônios unem-se a seus receptores presentes no citosol. Após a entrada na célula sem a necessidade de um receptor transmembranário, características dos hormônios lipossolúveis. Os glicocorticóides posteriormente são translocados para o núcleo, onde atuam como fatores de transcrição. Os receptores de glicocorticoides são proteínas intracelulares pertencente à superfamília de receptores nucleares, mais especificamente denominados receptor nuclear da superfamília 3, grupo C, membro 1 (nuclear receptor 3, group C, member 1 NR3C1). Esta classe compreende três domínios funcionais: um domínio N-terminal, um domínio de ligação ao DNA e um domínio de ligação com o ligante C-terminal (OAKLEY AND CIDLOWSKI, 2011). No citoplasma, na ausência do ligante, o receptor de glicocorticóides está associado a proteínas de choque-térmico (heat-chock protein HSP), característica atribuída aos receptores de hormônios esteróides (AGARWAL AND MIRSHASHI, 1999). As HSP estão comumente presente no citoplasma não apenas associadas ao receptor de glicocorticóides, como também a outras proteínas. Um complexo proteico é formado quando o receptor de glicocorticóides é associado às proteínas HSP-90 e HSP70 (PRATT et al., 1993; ADCOCK, 2000) e imunofilinas que participam da sinalização dos glicocorticóides (DAVIES et al., 2002). As proteínas de choque térmico atuam retendo o receptor de glicocorticóides no citoplasma, além de manter a capacidade ligação com o hormônio. Após a ligação do cortisol no seu receptor, um complexo receptor-ligante é formado e transloca-se para o núcleo onde se liga a elementos de resposta ao hormônio na região promotor de gene alvo para atuar como um fator de transcrição. 11β-HIDROXISTEROIDE DESIDROGENASE O acesso do cortisol biologicamente ativo no receptor de glicocorticóides nas células alvo é regulado por duas enzimas desidrogenases, 11β-Hidroxisteróide Desidrogenase tipo 1 e tipo 2. A ativação do cortisol é regulada pela enzima tipo 1 (11β-

33 33 HSD1), uma enzima de baixa afinidade para o cortisol que predominantemente atuar como uma redutase dependente de NADPH catalisando a conversão de cortisona (uma forma inativa do cortisol) em cortisol. Em contraste, a enzima tipo 2 (11βHSD2) atua inativando cortisol convertendo-o em cortisona por ter uma atividade NAD+ dependente de alta afinidade para o cortisol (AGARWAL et al., 1994; ALBISTON et al., 1994). A enzima 11β-HSD1 é altamente expressa no fígado, pulmão, tecido adiposo, SNC e principalmente nos ovários, também nesses locais há uma expressão significante dos receptores de glicocorticóides (SECKL AND WALKER, 2001). Em quanto que a enzima 11β-HSD2 é expressa em tecidos alvos de aldosterona como cólon, nefrons distal e glândulas sudoríparas. No entanto ambos os mrnas das duas enzimas 11β- HSD1 e 11β-HSD2 foram identificados no ovário bovino (TETSUKA et al., 2003), e a sua expressão e atividade têm sido associados com o desenvolvimento e maturação folicular (TETSUKA et al., 2010; THURSTON et al., 2007). Após a ligação com o hormônio, ocorre uma alteração conformacional no receptor de glicocorticóides que induz à dissociação do receptor de glicocorticóides com as proteínas de choque-térmico, formando um complexo hormônio-receptor. Após a formação do complexo hormônio-receptor, este é translocado para o núcleo. Uma vez no núcleo, ocorre a dimerização do GR antes da sua ligação com o DNA (MARCEL et al., 2003) seguido da ligação a elementos responsivos a glicocorticoides (GRES) estimulando a expressão de genes alvos. AÇÃO DO CORTISOL NA FOLICULOGÊNESE Altas concentrações de glicocorticóides, especialmente o cortisol configuram a perda da homeostasia pelo organismo, deste modo, um quadro de estresse é caracterizado. Geralmente associado como hormônio do estresse, no tocante a reprodução o cortisol tem a capacidade de atuar de três formas: 1 hipotálamo, 2 hipófise ou diretamente nas gônadas (ANDERSEN, 2003), porém, independente da via de atuação, o cortisol exerce efeitos diretos na foliculogênese o que pode levar a supressão da atividade gonadal, bem como a esterilidade e perda do estimulo sexual. Na ausência de condições ideais para a reprodução, a influência do estresse reflete no baixo desempenho reprodutivo em animais de reprodução. Pequenos ruminantes como caprinos e ovinos representam uma fonte de lucro para o Nordeste brasileiro, devido a grande concentração desses animais nessa região (IBGE, 2010),

34 34 porém são mais facilmente afetados pelos efeitos deletérios que o estresse pode causar oriundo de inúmeras fontes como alimentação e manejo inadequado e altas temperaturas (CHAVES et al., 2013; OZAWA, et al., 2005). Levando em consideração que o processo de reprodução dos animais domésticos está sobre controle do eixo hipotalâmico-hipofisário-gonadal, para obter sucesso é necessário que os mecanismos envolvidos nesse eixo estejam em completa sincronia nos eventos relacionados. Nesse sentido, é necessário desenvolver mais estudos sobre como o cortisol oriundo do estresse pode interferir a função reprodutiva. Diversos estudos tem demonstrado que o cortisol implica em várias funções ovarianas como, maturação, esteroidogênese e diferenciação das células da granulosa (GONZÁLES et al., 2010; BREEN et al., 2005 ovinos, ANDERSEN et al., humanos). O aumento das concentrações desse hormônio em situações de estresse durante fases críticas do ciclo estral pode interferir nos estímulos hormonais indutores do comportamento sexual e da ovulação (PAPARGARIS et al., 2011). Efeito dos glicocorticoides na esteroidogênese Durante o estresse, ocorre a ativação do eixo hipotalâmico-hipofisário-adrenal, esta ativação desencadeia mudanças em quase todo o sistema endócrino, como resultados podemos observar que em ovinos altos níveis de cortisol inibem a secreção pulsátil do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) pelo hipotálamo (MACFARLANE et L., 2000), consequentemente, quantidades reduzidas de GnRH exercem pouco efeito na hipófise, reduzindo a secreção do hormônio folículo estimulante (FSH) que aliado ao efeito inibidor cortisol na hipófise torna insuficiente a quantidade de FSH para promover o recrutamento dos folículos durante a fase folicular. Uma vez que se instala o estresse há pouca oferta de FSH, assim, existe uma menor mobilização de folículos em crescimento durante a nova onda folicular. Há estes folículos dar-se-á a característica de pouco produtores de estradiol, uma vez que o próprio cortisol inibe a produção de estradiol pelos folículos em crescimento contribuindo para a interrupção do desenvolvimento folicular (BREEN et al., 2005). A produção reduzida de estradiol torna-se insuficiente para o surgimento do LH, foi demostrado que o cortisol inibe o feedback positivo do estradiol sobre a indução do pico de LH (WAGENMAKER et al., 2009). Em adição, o comportamento sexual é

35 35 prejudicado através da inibição das ações do estradiol para estimular o estro não havendo receptividade sexual na ovelha (PAPARGARIS et al., 2011). Efeito dos glicocorticoides na foliculogênese e maturação A maturação oocitária tem por objetivo a produção de um oócito meioticamente competente, apto a ser fertilizado. Nas espécies mamíferas a maturação é decorrente de um crescimento em condições adequadas do oócito no folículo ovariano, porém este processo é extremamente sensível podendo resultar em falhas na maturação por ocasião de alterações fisiológicas (MAO et al., 2014). No âmbito da maturação in vitro, alguns estudos têm se concentrado na utilização de substâncias que possam aumentar as taxas de maturação in vitro, por exemplo, fatores de crescimento e hormônios (ARAÚJO et al., 2010; MAGALHÃES et al., 2009). Desde a década de 1980, alguns estudos se propuseram a investigar os efeitos que os glicocorticóides podem causar na maturação oocitária, bem como a relação destes hormônios com este evento final da foliculogênese. Um estudo pioneiro em mulheres foi observado que após a aspiração folicular para a obtenção de oócitos para fertilização in vitro, após a obtenção de oócitos maturados a concentração de cortisol no fluido folicular foi duas vezes maior em relação ao fluido folicular de folículos contendo oócitos imaturos, sugerindo uma correlação positiva entre o cortisol e a maturação oocitária (FATEH, 1989). Semelhantemente, HARLOW, (1997) observou que durante o surgimento da onda pré-ovulatória de LH há um aumento na concentração de cortisol, deste modo o cortisol pode exercer um papel fisiológico na maturação e ovulação. Os mecanismos pelo qual o cortisol pode atuar na maturação ainda não são claros, porém algumas hipóteses são levantadas como uma possível forma de ação deste hormônio. Durante a retomada da meiose é necessário um fornecimento de energia através da beta-oxidação de ácidos graxos livres presente nas células do cúmulos, assim sendo, os lipídios são uma grande fonte de energia para a maturação (VALSANGKAR et al., 2013). Mulheres em tratamento para fertilização in vitro, o cortisol promoveu a mobilização de moléculas de lipídios presente em células do cúmulos como fonte de energia, uma vez que este hormônio tem propriedades lipofílicas em outros tecidos (CARMAN, 2012). Nesse estudo foi observada uma correlação positiva entre os níveis

36 36 de cortisol no fluido folicular com a maturação oocitária, portanto o cortisol no fluido folicular pode promover o fornecimento de energia necessária para a retomada da meiose através da beta-oxidação de ácidos graxos livres (SIMERMAN et al., 2015). Estudos anteriores sugeriram que altos níveis de cortisol podem atuar em outros mecanismos no controle da maturação Na maturação de oócitos suínos, cortisol e a dexametasona inibiram a retomada da meiose (YANG et al, 1999). Durante a retomada da meiose o fator promotor da maturação (MPF) é ativado através da desfosforilação da tirosina p34 cdc2 e síntese da ciclina B (NURSE, 1990). Deste modo, foi observado a influência desses glicocorticóides na expressão da p34 cdc2 e ciclina B1 durante a maturação. Verificou-se que a exposição a 1 µg/ml de dexametasona reduziu i nível da ciclina B1, mas não teve efeito na p34 cdc2. A exposição a dexametasona também reduziu o complexo p34 cdc2 -ciclina B1, sugerindo que a ação dos glicocorticóides na maturação pode ser atribuída a diminuição deste complexo. Sobre um possível efeito dos glicocorticoides em outras vias de sinalização, na maturação de oócitos ovinos, cortisol e dexametasona diminuíram o percentual de oócitos maturados através da inibição da ativação das cinases reguladas por sinais extracelulares (ERKS), ERK-1 e ERK-2 na presença de altas concentrações (GONZÁLES et al., 2010). ERK-1 e 2 são membros da família das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), as MAPKs são importantes reguladores da maturação do oócito associada à organização dos microtúbulos e condensação da cromatina (FAN and SUN, 2004). Para testar a hipótese de que os glicocorticoides afetam a maturação oocitária, GONZÁLES (2010), utilizou oócitos de ovelhas para avaliar o efeito in vitro do cortisol e dexametasona na via MAP kinase durante a maturação oocitária. Ambos os glicocorticoides inibiram a ativação das ERK-1 e 2 durante o período de maturação, resultando na diminuição do percentual de oócitos maturados in vitro na presença de altas concentrações, sugerindo que níveis fisiológicos de glicocorticoides não acometem danos à maturação do oócito. Em conclusão, nota-se a importância do cortisol para diversos sistemas do organismo incluindo a reprodução. Em níveis fisiológicos, este hormônio contribui para equilíbrio natural do organismo preservando a homeostasia, especialmente na função reprodutiva, o cortisol pode participar do processo de maturação oocitária. No entanto, o aumento das concentrações de cortisol ocasionado por um estímulo estressante, acarreta

37 37 danos na função reprodutiva, principalmente na esteroidogênese folicular e o desenvolvimento do folículo, além disso, ocorrendo estresse por um longo período o cortisol pode até suprimir a função reprodutiva. REFERÊNCIAS ACOSTA, T.J.; TETSUKA, M.; MATSUI, M.; SHIMIZU, T.; BERISHA, B.; SCHAMS, D.; MIYAMOTO, A. In vivo evidence that local cortisol production increases in the preovulatory follicle of the cow. J Reprod Dev v. 51, p , 2005 ADCOCK, I.M. Molecular Mechanisms of Glucocorticosteroid Actions. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. vol. 13, p AGARWAL, A.K.; MONDER, C.; ECKSTEIN, B.; WHITE, P.C. Cloning and expression of rat cdna encoding corticosteroid 11-dehydrogenase. Journal of Biological Chemistry AGARWAL, A.K.; MUNE, T.; MONDER, C.; WHITE, P.C. NAD+- dependent isoform of 11-hydroxysteroid dehydrogenase. Journal of Biological Chemistry ALBISTON, AL.; OBEYESEKERE, V.R.; SMITH, R.E.; KROZOWSKI, Z.S. Cloning and tissue distribution of the human 11-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 enzyme. Molecular and Cellular Endocrinology. v. 105, p.11:17, 1994 ANDERSEN, C.Y. Possible new mechanism of cortisol action in female reproductive organs: physiological implications of the free hormone hypothesis. J. Endocrinol. v P VALDEVANE R. ARAÚJO, V.R.; SILVA, C.M.G.; MAGALHÃES, D.M.; SILVA, G.M.; BÁO, S;N.; SILVA, J.R.V.; FIGUEIREDO, J.R.; RODRIGUES, A.P.R. Effect of Bone Morphogenetic Protein-7 (BMP-7) on in vitro survival of caprine preantral follicles. Pesq. Vet. Bras. v. 30. p. 305:310, 2010

38 38 BORSKI, R.J. Nongenomic membrane actions of glucocorticoids in vertebrates. Trends Endocrinol Metab. v. 11, p.427:36, 2000 BREEN, K.M.; BILLINGS, H.J.; WAGENMAKER, E.R.; WESSINGER, E.W.; KARSCH, F.J. Endocrine basis for disruptive effect of cortisol on preovulatory events. Endocrinology, v. 146, n. 4, p , CHEN, W.Y.; YANG, J.G.; LI, P.S. Effect of dexamethasone on the expression of p34cdc2 and cyclin B1 in pig oocytes in vitro. Molecular Reproduction and Development. v. 56, p.74:79, 2000 DAVIES, T.H.; NING, Y.M.; SÁNCHEZ, E.R. A new fi rst step in activation of steroid receptors: hormone-induced switching of fkbp51 and fkbp52 immunophilinso. The Journal of Biological Chemistry. v. 277, p. 4597:4600, 2002 ESCHER G.; GALLI, E. VISHWANATH, B.S.; FREY, B.; FELIX, F.J. Tumor necrosis factor alpha and interleukin i beta enhance the cortisol/cortisone suttle. Journal of Experimental Medicine. v. 186, p. 189:198, 1997 FAN, H.Y.; SUN, Q.Y. Involvement of mitogen-activated protein kinase cascade during oocyte maturation and fertilization in mammals. Biology of Reproduction v.70, p.535;:47, 2004 FATEH, M; BEN-RAFAEL, Z; BENADIVA, C.A; MASTROIANNI, L. JR; FLICKINGER, G.L. Cortisol levels in human follicular fluid. Fertil Steril. Vol. 51. P GONZÁLEZ, R; RUIZ-LEÓN, Y; GOMENDIO, M; ROLDAN, E.R.S. The effect of glucocorticoids on ERK-1/2 phosphorylation during maturation of lamb oocytes and their subsequent fertilization and cleavage ability in vitro. Reproductive Toxicology. V 29, p , GRIEKSPOOR, A.; ZWART, W.; NEEFJES, J.; MICHALIDES, R. Visualizing the action of steroid hormone receptors in living cells. Nucl. Recept. Signal. v. 5, p

39 39 HARLOW, C.R.; JENKINS, J.M.; WINSTON, R.M. Increased follicular fluid total and free cortisol levels during the luteinizing hormone surge. Fertil Steril. v. 68(1), p.48: HUANG, T.J.; LI, P.S. Dexamethasone inhibits luteinizing hormone-induced synthesis of steroidogenic acute regulatory protein in cultured rat preovulatory follicles. Biology of Reproduction v. 64, p.163:170, ILLERA,J.C.; G. SILVÁN, C.; MARTÍNEZ, M.; BLASS, A.; PEÑA, L. The effect of dexamethasone on disruption of ovarian steroid levels and receptors in female rats. J. Physiol. Biochem., 61 (3), , MACFARLANE, M. S.; BREEN, K. M.; SAKURAI, H.; ADAMS, B. M.; ADAMS, T. E. Effect of duration of infusion of stress-like concentrations of cortisol on follicular development and the preovulatory surge of LH in sheep. Animal Reproduction Science, v. 63, p , MAGALHÃES, D.M.; ARAÚJO, V.R.; LIMA-VERDE, I.B.; MATOS, M.H.T.; SILVA, R.C.; LUCCI, C.M.; BÁO, S.N.; CAMPELLO, C.C.; FIGUEIREDO, J.R. Different FollicleStimulating Hormone (FSH) sources influence caprine preantral follicle viability and development in vitro. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci. 5, MAO, L.; LOU, H.; LOU, Y.; WANG, N.; JIN, F. Behaviour of cytoplasmic organelles and cytoskeleton during oocyte maturation. Reprod Biomed Online. 28: MICHAEL, A.E.; THURSTON, L.M.; RAE, M.T. Glucocorticoid metabolism and reproduction: a tale of two enzymes. Reproduction. v. 126, p.425:441, 2003 NURSE, P. (1990). Universal control mechanism regulating onset of M-phase. Nature, 344: OAKLEY, R.H.; CIDLOWSKI, J.A. Cellular Processing of the Glucocorticoid Receptor Gene and Protein: New Mechanisms for Generating Tissue-specific Actions of Glucocorticoids. J Biol Chem. v. 286, p. 3177:3184, 2011

40 40 ONARD, J.L.M.; SCHONEVELD, INGRID, C. GAEMERS, WOUTER H. LAMERS. Mechanisms of glucocorticoid signalling. Biochimica et Biophysica Acta. v. 1680, p. 114:128, 2004 OZAWA, M.; TABAYASHI, D.; LATIEF, T.A.; SHIMIZU, T.; OSHIMA, I; KANAI, Y. Alterations in follicular dynamics and steroidogenic abilities induced by heat stress during follicular recruitment in goats. Reproduction. v. 129, p. 621:630, 2005 PAPARGARIS, M.M; RIVALLAND, E.T.A; HEMSWORTH, P. H; MORRISEY, A. D; TILBROOK, A. J. Acute and chronic stress-like levels of cortisol inhibit the oestradiol stimulus to induce sexual receptivity but have no effect on sexual attractivity or proceptivity in female sheep. Hormones and Behavior. V. 60. N.4. p PRATT, W.B. The role of heat shock proteins in regulating the function, folding, and trafficking of the glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 268: , ROSNER W. Plasma steroid-binding proteins. Endocrinol Metab Clin North Am. 20(4): , 1991 SCHONEVELD, O.J.; GAEMERS, I.C.; LAMERS, W.H. Mechanisms of glucocorticoid signalling. Biochim Biophys Acta. v. 1680, p.114:128, 2004 SECKL, J.R.; WALKER, B.R Minireview: 11b-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1 A Tissue-Specific Amplifier of Glucocorticoid Action. Endocrinology. v. 142, p. 1371;1376, 2001 SIMERMAN, A.A.; HILL, D.L.; GROGAN, T.R.; ELASHOFF, D.; CLARCK, N.J.; GOLDSTEIN, E.H.; MANRRIQUEZ, A.N.; CAZENBALK, G.D.; DUMESIC, D.A. Intrafolliclar cortisol levels inversely correlate with cumulus cell lipid content as a possible energy source during oocyte meiotic resumption in women undergoing ovarian stimulation for in vitro fertilization. Fertility and Sterility. v. 103, p , 2015 TETSUKA, M.; YAMAMOTO, S.; HAYASHIDA, N.; HAYASHI, K.G.; HAYASHI, M.; ACOSTA, T.J.; MIYAMOTO, A. Expression of 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenases in bovine follicle and corpus luteum. J Endocrinol. v. 177, p , 2010

41 41 THURSTON, L.M.; ABAYASEKARA, D.R.; MICHAEL, AE. 11 Betahydroxysteroid dehydrogenase expression and activities in bovine granulosa cells and corpora lutea implicate corticosteroids in bovine ovarian physiology. J Endocrinol. v. 193, p. 299:310, 2007 TOMLINSON, J.W.; STEWART, P.M. Cortisol metabolism and the role of 11- hydroxysteroid dehydrogenase. Best Practice and Research Clinical Endocrinology and Metabolism. v. 15, p.61;78, 2001 VALSANGKAR, D.; STEPHEN, M.D. A Requirement for Fatty Acid Oxidation in the Hormone-Induced Meiotic Maturation of Mouse Oocytes. BIOLOGY OF REPRODUCTION. v. 89, 43.p. 1:9, 2013 WAGENMAKER, E.R; BREEN, K.M.; OAKLEY, A.E.; TILBROOK, A.J.; KARSCH, F.J. Psychosocial stress inhibits amplitude of gonadotropin-releasing hormone pulses independent of cortisol action on the type II glucocorticoid receptor. Endocrinology. v. 150, p

42 42 4 JUSTIFICATIVA a. Escolha da espécie: A caprinocultura tem grande importância no contexto da pecuária brasileira. A região Nordeste ganha destaque com a expansão da caprinocultura concentrando mais de 90% do plantel nacional, consolidando-se como a maior região produtora de carnes, subprodutos e animais de alto valor zootécnico oriundos dessa espécie. A espécie caprina apresenta melhor tolerância a nas regiões semi-áridas como o Nordeste, porém o manejo reprodutivo inadequado aliado a temperaturas elevadas refletem em um baixo desempenho reprodutivo dessa espécie. b. Relevância do protocolo: Estudos in vitro avaliando o efeito dos glicocorticóides, naturais e sintéticos possibilitaram identificar os mecanismos pelos quais cortisol e dexametasona atuam durante a maturação oocitária de folículos crescidos in vivo, elucidando o efeito dos glicocorticoides durante a maturação no final da foliculogênese. Entretanto, na foliculogênese pré-antral, folículos primários e secundários, não existe relato de como os glicocorticoides atuam durante o desenvolvimento. Deste modo, o cultivo in vitro do córtex ovariano em diferentes concentrações de cortisol poderá fornecer informações importante de como esse hormônio atua nessa fase da foliculogênese. c. Originalidade do trabalho: Até o presente momento não existe relato da ação dos glicocorticóides na foliculogênese pré-antral de caprinos. Portanto, a originalidade deste trabalho foi à investigação dos efeitos do cortisol durante o desenvolvimento de folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro visando elucidar como esse hormônio atua na foliculogênese.

43 43 5 HIPÓTESES O cortisol atua na função ovariana mediante o receptor de glicocorticóides presente nos folículos ovariano em todas as categorias foliculares, além disso, esse hormônio afeta o desenvolvimento e a viabilidade de folículos pré-antrais de uma forma concentração-dependente.

44 44 6 OBJETIVOS 6.1 OBJETIVO GERAL Identificar a imunolocalização do receptor dos glicocorticoides NR3C1 assim como avaliar o efeito do hormônio cortisol sobre o desenvolvimento in vitro de folículos ovarianos pré-antrais inclusos em tecido ovariano caprino. 6.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Avaliar a expressão da proteína do receptor de glicocorticoides, NR3C1 em folículos ovarianos incluso no tecido ovariano caprino; - Verificar efeito do hormônio cortisol em diferentes concentrações (0, 1, 5 e 10 ng/ml) na ativação, morfologia e a viabilidade folicular bem como no diâmetro folicular e oocitário de folículos ovariano caprino cultivados por 7 dias.

45 45 Capitulo II IMMUNOLOCALIZATION FOR GLUCOCORTICOID RECEPTOR AND EFFECT OF CORTISOL ON IN VITRO DEVELOPMENT OF CAPRINE PREANTRAL FOLLICLES PONTES, J.T. 1,*; MASIDE, C. 1 ; LIMA, L.F. 1 ; MAGALHÃES-PADILHA, D.M. 2 ; MATOS, M.H.T. 3 ; FIGUEIREDO, J.R. 1 ; CAMPELLO, C.C. 1 1 Laboratory of Manipulation of Oocytes Enclosed in Preantral Follicles (LAMOFOPA), Faculty, State University of Ceará, Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza, , CE, Brazil. 2 Postgraduate biotechnology, Potiguar University / Laureate International Universities, Av. Senador Salgado Filho, 1610, Lagoa Nova, Natal, , CE, Brazil 3 Nucleus of Biotechnology Applied to Ovarian Follicle Development, Federal University of San Francisco Valley, Petrolina, PE, Brazil *Correspondence should be addressed to: Faculty of Veterinary Medicine. Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV). Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA). Universidade Estadual do Ceará (UECE) Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi. Fortaleza CE Brasil. CEP: Tel.: ; Fax: address: julian.lamofopa@gmail.com

46 46 Abstract The aim of this study was to evaluate the immunolocalization for glucocorticoid receptor (NR3C1) in goat ovarian follicles and the effect of cortisol on in vitro development of caprine preantral follicles. Ovarian fragments were cultured for 7 days under different cortisol concentrations (0, 1, 5 and 10 ng/ml). Before and after culture, the protein expression of NR3C1 was analyzed in ovarian tissue by immunohistochemical analysis. Moreover, the end points follicular morphology, viability, activation as well as follicular and oocyte diameter were also analyzed. The NR3C1 was strongly expressed in oocytes of primary and antral follicles. A progressive increase of immunostaining for NR3C1 in granulosa cells from primordial to antral follicles was observed regardless of the treatment. After culture, it was observed a reduction in the rate of normal preantral follicles rate in the 10 ng/ml cortisol treatment when compared to the other treatments (P <0.05). Moreover, follicular and oocyte diameter significantly decreased in all treatments (cortisol 0, 1, 5 and 10 ng/ml) compared to the fresh control. After culture, the activation rate increased when the follicles were exposed to 1, 5 and 10 ng/ml cortisol compared to the fresh control (P <0.05). In conclusion, it was observed the presence of NR3C1 in the oocyte and granulosa cells in all follicular categories. The in vitro culture showed that high cortisol concentrations (10 ng/ml) exerts a deleterious effect on follicular survival, reducing the percentage of normal follicles as well as follicular and oocyte diameter. Keywords: Caprine, stress, cortisol, NR3C1, preantral follicles.

47 47 INTRODUCTION Goat production is economically and socially important activity with an increasing interest in milk, meat and skin production around the world. Although, goats are well adapted to many different environments, improper handling and feeding practices may produce stress reducing their productivity and profitability (18). Conditions of stress lead to an increase of cortisol inducing suppression of reproductive system function (15, 28) with subsequent economic impact on the livestock. Cortisol, commonly known as hormone stress, is produced in the adrenal gland and is responsible for the regulation of several physiological processes, including metabolism, immunological response, and female reproductive function. High level of cortisol in response to stress, acts directly or indirectly on the reproductive functionality resulting in low reproductive rates (11, 28). The rise of cortisol acts on the hypothalamic -pituitary suppressing GnRH secretion which in turn inhibits of FSH release and reduce the LH surge frequency in sheep (7,20). Furthermore, excessive cortisol levels can inhibit the estradiol secretion, inducing the disruption of the follicular development and ovulation (7). In physiological conditions, several studies have demonstrated the role of cortisol on the ovary during the oocyte maturation as well as granulosa cell differentiation and steroidogenesis (7, 13 sheep 3 - human). Moreover, this hormone is associated with oocyte maturation in human because human follicular fluid from matured oocytes had greater cortisol level than immature oocytes (12). In addition, cortisol increases lipid metabolism in pre-ovulatory follicle and promoting meiotic resumption in human (26).

48 48 Despite numerous studies reporting the role of cortisol in reproduction, it is unclear the effect of this hormone on the early folliculogenesis (primordial and primary follicles). In addition, at least for goats, there is no information on the localization of cortisol receptor in the ovarian follicles. Therefore, the aims of this study were to investigate the immunolocatization for cortisol receptor, NR3C1, and the effect of cortisol on the survival and activation of caprine preantral follicles cultured in vitro. MATERIAL AND METHODS Chemicals Unless mentioned otherwise, all chemicals used in the present study were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Source of ovaries Ovaries (n=10) from 5 adults, mixed-breed goats between 1 to 3 years old were collected at a local slaughterhouse. Immediately after slaughter, the ovaries were washed in 70% ethanol, followed by two washes in washing medium consisting of Minimum Essential Medium (MEM) buffered with 25mM HEPES (MEM-HEPES) supplemented with 100 µg/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Ovaries were transported to the laboratory within 1 hour in 50 ml tubes containing wash medium at 4 ºC (10). Immunohistochemical localization of glucocorticoid receptor (NR3C1) In the laboratory, before culture (fresh control) and after 7 days of culture, all of the ovarian fragments cultured with different concentration of cortisol (0, 1, 5, 10 ng/ml) were fixed in 4% paraformaldehyde for 12 h, dehydrated, and embedded in paraffin. For detections of NR3C1, immunohistochemistry was performed according to

49 49 the protocol described previously by Sales et al. (24). Briefly, sections of 5 µm from each block were obtained and mounted in poly- L-lysine slides and dried overnight at 37 ºC, deparaffinised in xylene and rehydrated in graded ethanol series, followed by antigen retrieval with citric acid buffered solution (ph 6.0) and Tween 20. After blocking solution endogenous peroxidase activity with 3% hydrogen peroxide and methanol for 10 min, the sections were incubated for 1 h with blocking solution (25 ml PBS containing 1.25% bovine serum albumin and 3% Triton X) at room temperature and overnight with rabbit polyclonal primary antibody (NR3C1) (1:800 Abcam Inc., USA) at 4 C. After repeated washing in PBS for 5 min, slides were incubated with secondary antibody Rabbit anti-rabbit IgG (1:500 Abcam Inc., USA) for 30 minutes at room temperature followed by washing in PBS for 5 minutes. Then the sections were incubated with horseradish peroxidase-conjugated avidin (ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). The positive reactions were visualized with 3,3 - diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) solution. Finally, the sections were counterstained with hematoxylin, dehydrated, and mounted in Depex. Replacing the primary antibody for IgG of the same species in which the primary antibody was produced performed negative controls. The preantral follicles were classified as primordial (oocyte surrounded by one layer of squamous granulosa cells), primary (oocyte surrounded by one layer of cuboidal granulosa cells), or secondary (oocyte surrounded by two or more layers of cuboidal granulosa cells). The presence of small antral follicles (presence of cavity filled with follicular fluid and well-developed layers of granulosa cells) was also noted. In the various follicular compartments (oocyte, granulosa or theca cells), the immunostaining was classified as absent ( ), weak (+), moderate (++) or strong (+++).

50 50 In vitro culture of goat preantral follicle In vitro culture of caprine follicles was performed according to the protocol described previously by Chaves et al. (10). Briefly, in the laboratory, the surrounding fatty tissues and ligaments were stripped from the ovaries. Ovarian cortical slices (3x3x1 mm) were cut from the ovarian surface using a surgical blade under sterile conditions and subsequently placed in holding medium consisting of MEM-HEPES with antibiotics (100 mg/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin). Subsequently, half the ovarian fragments were randomly fixed for histological analysis (fresh control or noncultured fragments). The remaining fragments were cultured individually in vitro in 24-well culture dishes (Corning, Corning, NY, USA) containing 1mL culture medium at 39 C in presence of 5% CO2 in air for 7 days. The basic culture medium consisted of α-mem (ph ) supplemented with 10 ng/ml insulin, 5.5 ng/ml transferrin, 5 ng/ml selenium, 2 mm glutamine, 2 mm hypoxanthine and 1.25 mg/ml bovine serum albumin This medium was called MEM+ and was supplemented with different cortisol (Hydrocortisone) concentrations (0, 1, 5 and 10 ng/ml). Before (fresh control) and after culture, the samples were fixed and destined for histological analysis. Fresh medium was prepared immediately before use. Every 2 days, the culture medium was replaced by fresh medium. Before (fresh control) and after in vitro culture for 7 days, ovarian fragments were processed as described below to evaluate the morphology of goat preantral follicles. Morphological analysis of goat preantral follicles Ovarian fragments from each treatment, including the fresh control or noncultured fragments, were fixed individually in 4% paraformaldehide for 12 h. Subsequently, fragments were dehydrated in a graded series of ethanol, clarified with

51 51 xylene and embedded in paraffin wax (8). Tissues were sectioned serially at a thickness of 7μm and sections were stained using standard protocols with periodic acid-schiff and haematoxylin (PAS staining system; Sigma). Sections were examined by light microscopy (Zeiss, Jena, Germany) at 400 magnification. Preantral follicles were counted and evaluated in the section where the oocyte nucleus was visible. According to the developmental stage, preantral follicles were classified as primordial (oocyte surrounded by one layer of flattened pre-granulosa cells) or developing, with the latter category further subdivided into intermediate (oocyte surrounded by one layer of flattened pregranulosa and cuboidal granulosa cells), primary (oocyte surrounded by one layer of cuboidal granulosa cells) or secondary (oocyte surrounded by two or more layers of cuboidal granulosa cells). Each follicle was evaluated according to the following morphological parameters: (1) integrity of oocyte and granulosa cells; (2) the presence or absence of pyknotic bodies; (3) ooplasmic retraction; and (4) the organisation of granulosa cells. Based on this evaluation, preantral follicles were classified as normal, when a morphologically normal oocyte with a non-pyknotic nucleus was surrounded by granulosa cells organised in discrete layers. Degenerated follicles were defined as those with a retracted oocyte, with a pyknotic nucleus and/or surrounded by disorganised granulosa cells, which were detached from the basement membrane. The tissue was performed by a single player using the same optical microscope (Nikon, Tokyo, Japan). Slide analysis was made blind reading (reviewing the slides without knowledge of treatment group). Primordial follicle activation and growth To evaluate primordial follicle activation and growth, only intact follicles with a visible oocyte nucleus were recorded and the proportion of primordial and developing

52 52 follicles was calculated for fresh control and for all treatments where the ovarian fragments were cultured for 7 days with different cortisol concentrations (0, 1, 5 and 10 ng/ml). In addition, for each follicle category, oocyte and follicle diameters were measured using an ocular micrometer and the average of the minor and major axes was reported as oocyte and follicle diameter, respectively. Statistical analisys Data were initially submitted to Shapiro-Wilk and Bartlett tests to verify normality of residues distribution and homoscedasticity, respectively. Confirmed both requirements underlying analysis of variance (ANOVA), it was performed according to a completely randomized design using General Linear Model Procedure (GLM) of SAS (2002) and Student-Newman-Keuls (SNK) test was applied to compare means when a significant effect of treatment (cortisol concentration) was present. Results were expressed as mean ± standard deviation and differences were considered significant when p <0.05. RESULTS Immunohistochemical localization of glucocorticoid receptor (NR3C1) in the caprine ovarian tissue The results from immunohistochemistry demonstrated the presence of the NR3C1 in all ovarian follicular categories in caprine, varying only the intensity and location. There was no difference in the intensity of immunoreaction NR3C1 among the treatments. However, when it was evaluated the follicular structures in preantral follicle, the oocyte of primordial follicles showed a moderate immunostaining in the cytoplasm and strong immunoreaction in the nucleus; a weak immunostaining in the oocyte (cytoplasm and nucleus) of primary follicles and a moderate immunostaining in the

53 53 oocytes of secondary follicles (cytoplasm and nucleus) was detected. Regarding to the granulosa cells, there was a progressive increase of immunostaning for NR3C1 in primordial, primary and secondary follicles, which were classified as absent, weak and moderate immunoreaction, respectively (Tab. 1). In antral follicles, there was a strong immunoreaction in the oocyte (cytoplasm and nucleus) as well in the granulosa cells. In theca cells, it was not detected the presence of NR3C1 in the secondary follicles, however, the antral follicles had a weak immunoreaction. Table. 1: Relative intensity of immunohistochemical staining for NR3C1 in caprine ovarian follicles. Follicular category Follicular structure Primordial Primary Secondary Antral Oocyte Granulosa Theca NA NA - + NA, not applicable. (-) absent; (+) weak; (++) moderate; (+++) strong immunoreaction.

54 54 A B C D E F G H I J Fig. 1: Immunohistochemical detection of NR3C1 in caprine follicles ovarian tissue. (A), primordial follicles. (B,C), higher magnification of area A. (D), secondary follicle. (E,F), higher magnification of area D. (G), antral follicle. (H,I), higher magnification of area G. (J), Negative control. Effect of cortisol on follicular survival, activation and growth A total of preantral follicles were analyzed. After seven days of culture, regardless of the presence or absence of cortisol, a reduction (P <0.05) in the percentage of normal follicles was observed when compared to the fresh control. Among the treatments, the 10ng/ml cortisol treatment showed the lowest (P <0.05) percentage of