PREDIÇÃO ESTRUTURAL DE SULFITE REDUCTASE [NADPH] HEMOPROTEIN BETA- COMPONENT DE Nitrosomonas eutropha C91
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- Jónatas de Sá Benevides
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1 PREDIÇÃO ESTRUTURAL DE SULFITE REDUCTASE [NADPH] HEMOPROTEIN BETA- COMPONENT DE Nitrosomonas eutropha C91 B.A.S. de SOUZA 1 ; F.B.S. de SOUZA 1 ; N.A.N. de ALENCAR 2 ; C.N. ALVES 2 e D.do S.B. BRASIL 1 1 Universidade Federal do Pará, Laboratório de Informática 2 Universidade Federal do Pará, Laboratório de Planejamento e Desenvolvimento de Fármacos davibb@ufpa.br Diversas classes de nitrossomonas podem oxidar anaerobicamente o amôniaco usando NO2 que esta em equilíbrio químico com N2O4 como um oxidante, reduzindo simultaneamente o nitrito de N2O e N2, porém N. eutropha N904 é capaz de realizar esta oxidação de forma mais notável. Além de N. eutropha N904 realizar a oxidação de amônia, pode também crescer anaerobicamente por desnitrificação em culturas contínuas em piruvato, H2 e nitrito, a única cultura sem amoníaco no metabolismo de suporte do crescimento demonstrado até agora para bactérias oxidante de amônia. A proteína Sulfite Reductase [NADPH] Hemoprotein Beta- Component participa do complexo de sulfito redutase que catalisa a redução de seis elétrons de sulfito em sulfureto. Esta é uma das várias atividades necessárias para a biossíntese de L-cisteína a partir de sulfato. A L-cisteína pe um aminoácido importante para saúde dos cabelos, unhas e da queratina da pele. Auxilia na formação de colágeno, promovendo assim a textura do cabelo, a elasticidade da pele e unhas saudáveis. Fabricada pelo método de redução eletrolítica, utilizando a L-cisteína como material de partida, têm-se a L- cisteína anidra precursora da co-enzima A, condroifina, taurina e glutationa um dos mais poderosos antioxidantes do organismo. A homologia da proteína foi realizada utilizando o servidor SWISS MODEL através do qual pôde-se propor a estrutura da proteína-alvo (target) partindo de sua sequência primária obtida por STEIN et al. (2007) e de estruturas homólogas tridimensionais. O segundo passo foi determinar os moldes (templates) que estivessem diretamente relacionados ao alvo através de uma maior identidade e similaridade entre eles, esse alinhamento foi realizado no servidor PDB (Protein Data Bank), obteve-se como melhor molde a proteína sulfite redutase hemoprotein com 48%. 108
2 1. INTRODUÇÃO As nitrossomonas são um dos cinco gêneros de bactérias amoníaco oxidantes e estas espécies possuem formato de bastonete, cujas células são elipsoidais com membranas intracitoplasmáticas alongadas, dispostas como vesículas achatadas no citoplasma periférico (WINOGRADSKY, 1982; WATSON, 1974). Estes microorganismos são quimiolitotróficos e obtém energia para o seu crescimento através da oxidação aeróbica ou anaeróbica da amônia. Os principais produtos na presença de gás oxigênio são N2 e NO e na ausência deste o nitrito (REES & NASON, 1966; SCHMIDT & BOOK, 1997). Diversas classes de nitrossomonas podem oxidar anaerobicamente o amôniaco usando NO2 que esta em equilíbrio químico com N2O4 como um oxidante, reduzindo simultaneamente o nitrito de N2O e N2, porém N. eutropha N904 é capaz de realizar esta oxidação de forma mais notável (SCHMIDT & BOCK, 1997). Além de N. eutropha N904 realizar a oxidação de amônia, pode também crescer anaerobicamente por desnitrificação em culturas contínuas em piruvato, H2 e nitrito, a única cultura sem amoníaco no metabolismo de suporte do crescimento demonstrado até agora para bactérias oxidante de amônia (BOCK, 1995; SCHMIDT et al., 2004). A proteína Sulfite Reductase [NADPH] Hemoprotein Beta- Component participa do complexo de sulfito redutase que catalisa a redução de seis elétrons de sulfito em sulfureto. Esta é uma das várias atividades necessárias para a biossíntese de L-cisteína a partir de sulfato (STEIN et al., 2007). A cisteína é sintetizada a partir de sulfureto de hidrogênio como fonte do elemento de S e de O-acetil-serina como precursor de carbono. Em bactérias prototróficas, fungos ou plantas sulfureto de hidrogênio é formado por sulfito redutase. A L-cisteína é um aminoácido importante para saúde dos cabelos, unhas e da queratina da pele. Auxilia na formação de colágeno, promovendo assim a textura do cabelo, a elasticidade da pele e unhas saudáveis. Fabricada pelo método de redução eletrolítica, utilizando a L-cisteína como material de partida, têm-se a L-cisteína anidra precursora da co-enzima A, condroifina, taurina e glutationa um dos mais poderosos antioxidantes do organismo (VIA FARMA, 2012). Este trabalho visa realizar a predição estrutural da proteína sulfite reductase [NADPH] hemoprotein beta- component presente na espécie Nitrosomonas eutropha C91, o que poderá contribuir no avanço da compreensão da função desta proteína na fisiologia da presente espécie. 109
3 2. PREDIÇÃO ESTRUTURAL DE SULFITE REDUCTASE [NADPH] HEMOPROTEIN BETA- COMPONENT DE Nitrosomonas eutropha C91 A homologia de Sulfite Reductase [NADPH] Hemoprotein Beta- Component de N. eutropha N904 foi realizada utilizando o servidor SWISS MODEL através do qual pôde-se propor a estrutura da proteína-alvo (target) partindo de sua sequência primária obtida por STEIN et al. (2007) e de estruturas homólogas tridimensionais. No servidor UNIPROT realizou-se a pesquisa de uma sequência de proteína sem PDB, obtendo-se a seguinte sequência conforme mostra a Figura 1. Figura 1- Sequência de peptídeos obtida para Sulfite Reductase [NADPH] Hemoprotein Beta- Component de N. eutropha N904 no servidor UNIPROT. >sp Q0AGU3 CYSI_NITEC Sulfite reductase [NADPH] hemoprotein beta-component OS=Nitrosomonas eutropha (strain C91) GN=cysI PE=3 SV=1 MADTLPPTDRSCDISQPLERLSPDEALKAGSEYLRGTIALGLLDRITSAVPGDDIKLMKFHGIYQQ DDRDVRDERRRQKLEPAFQFMIRVRLPGGICTTERWLKISELACAHGNETLRMTTRQTFQFHWV LKHNIVPVIRGLHEVLLDTVAACGDDSRGVMATVNPQFPALQAELAALAKTVSDHVIPKTRGYH EIWYGEERIASSEPEEPFYGRTYMPRKFKIGFVIPPNNDIDIYAQDLGYIAIAGKDGKIAGFNIAIGG GMGRTDKVPHTYPRTASVIGFITPDRLISVTEAVMGVQRDYGNRADRSRARFKYTIDDKGLDWI KLAIEDRAGLLEPARPYHFTSNADIYGWVESDDGYHHFTLFVENGRLNRDTLDKIARIAHVHKG HFRLTPNQNLMIANVATADKPKIDALLVGSGLIAFNEHSVLRLNSMACVAFPTCGLAMADSERY LPTLITKIEGILTRYNLQDEPITLRMTGCPNGCSRPFIAEIGLTGRAPGKYNLYLGGGFHGQRLNRL YRENIGEAAILEALDEVLRHYATERLPDEHFGDFTIRAGIIREVTEGRFSND O segundo passo foi determinar os moldes (templates) que estivessem diretamente relacionados ao alvo através de uma maior identidade e similaridade entre eles, esse alinhamento foi realizado no servidor PDB (Protein Data Bank), obteve-se como melhor molde a proteína sulfite redutase hemoprotein com 48% de identidade conforme a Figura
4 Figura 2. PDB 4G39. No servidor SWISS MODEL realizou-se a construção de modelos similares ao alvo Sulfite Reductase [NADPH] Hemoprotein Beta- Component a partir do alinhamento entre o target e o template, obteve-se o seguinte modelo proposto pelo servidor, conforme a Figura 3. Figura 3. Modelo proposto. 3. VALIDAÇÃO A avaliação estereoquímica do modelo foi feita através do gráfico de Ramachandran (RAMACHANDRAN; RAMAKRISHNAN; SASISEKHARAN, 1963). O número de resíduos localizados em regiões com ângulos favoráveis, dados em porcentagem, para o modelo foi considerado satisfatório, o modelo gerado do domínio catalítico apresentou 89,9% dos resíduos previstos dentro da região favorável. Esse resultado está apresentado na Figura 4. Esta é uma análise estatística dos número de aminoácidos em cada região e permissões, exceto para resíduos de prolina e glicina 111
5 (triângulo), pois estes devido a suas flexibilidades apresentam permissões diferente em relação aos demais. Figura 4 - Gráfico de RAMACHANDRAN obtido através do servidor SWISS-MODEL para validar o modelo 3D de Sulfite Reductase [NADPH] Hemoprotein Beta- Component. O gráfico de ANOLEA é usado para avaliar a qualidade do modelo, mostra a energia de interação de cada resíduo de uma cadeia de proteína podendo determinar assim zonas com elevada energia, geralmente relacionadas a erros estereoquímicos e choques ou interações indevidas. O gráfico de ANOLEA está em processo de validação. 112
6 Valor de RMSD calculado para o modelo foi de 0,125 Å. Esse resultado demonstra que o desvio médio na construção do modelo foi satisfatório, principalmente por ser uma proteína que apresenta muitas regiões de alça, sendo assim, a estrutura tridimensional proposta satisfaz as condições exigidas durante a evolução, considerando a estabilidade da estrutura das proteínas (ARNOLD et al., 2006). O DFIRE analisa as interações atômicas, provendo pseudo-energias para os modelos as quais indicam a sua qualidade. Este valor para a presente proteína foi de - 639, CONCLUSÃO O presente modelo encontra-se em processo final de validação para posteriormente ser depositado no banco de dados PDB (Protein Data Bank). Através da elaboração do modelo tridimensional da proteína Sulfite Reductase [NADPH] Hemoprotein Beta- Component será possível realizar estudos de ancoragem e dinâmica molecular permitindo o estudo das interações moleculares presentes nesta proteína e com outras substâncias. 113
7 5. REFERÊNCIAS ARNOLD, K., L. BORDOLI, J. KOPP, T. SCHWEDE "The SWISS-MODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling." Bioinformatics 22(2): BOCK, E. Nitrogen loss caused by denitrifying Nitrosomonas cells using ammonium or hydrogen as electron donors and nitrite as electron acceptor. Arch Microbiol 163: (1995). RAMACHANDRAN, G. N., C. RAMAKRISHNAN, V. SASISEKHARAN "Stereochemistry of polypeptide chain configurations." J Mol Biol 7: REES, M. & NASON, A. (1966). Incorporation of atmospheric oxygen into nitrite formed during ammonia oxidation by Nitrosomonas europaea. Biochim Biophys Acta 113, SCHMIDT, I., AND BOCK, E. Anaerobic ammonia oxidation with nitrogen dioxide by Nitrosomonas eutropha.arch Microbiol 167: (1997). SCHMIDT, I., VAN SPANNING, R.J.M., AND JETTEN, M.S.M. Denitrification and ammonia oxidation by Nitrosomonas europaea wild-type, and NirK- and NorB-deficient mutants.microbiology 150: (2004). STEIN L.Y., ARP D.J., BERUBE P.M., CHAIN P.S., HAUSER L., JETTEN M.S., KLOTZ M.G., LARIMER F.W., NORTON J.M., OP DEN CAMP H.J.M., SHIN M., WEI X. Whole-genome analysis of the ammonia-oxidizing bacterium, Nitrosomonas eutropha C91: implications for niche adaptation.environ. Microbiol. 9: (2007). In: Via Farma. Literatura técnica. L-cisteína anidra. Disponível em : < >. Acesso em 18 de maio de WATSON, S. W. (1974). Family I. Nitrobacteraceae Buchanan. In Manual oj Determinatitte Bacteriology, 8th edn, pp Edited by R. E. Buchanan & N. E. Gibbons. Baltimore: Williams & Wilkins. WINOGRADSKY, S. (1982). Contributions a la morphologie des organismes de la nitrification. Archives des Sciences Biologiques (St Petersbourg) 1,
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