Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification System INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO PRODUTO AS1155.

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1 Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification System INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO PRODUTO AS1155. Atenção manusear os cartuchos com cuidado; as extremidades do selo podem ser cortantes Woods Hollow Rd. Madison, WI USA Dispositivo médico para diagnóstico In Vitro MDSS GmbH Schiffgraben Hannover, Alemanha INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO PRODUTO AS1155 IMPRESSO NOS EUA. 4/13

2 Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification System Toda a literatura técnica está disponível na Internet em: Visite o website para verificar se está a utilizar a versão mais actual deste Manual Técnico. Se tiver quaisquer dúvidas sobre a utilização deste sistema, contacte a Assistência Técnica da Promega Utilização prevista Limitações de utilização do produto Componentes do produto, Condições de armazenamento e Legenda dos símbolos Configuração do hardware e do firmware do instrumento Maxwell 16 Instrument Recolha e armazenamento de amostras antes da purificação Purificação de ácido nucleico viral total a partir de plasma ou soro...5 A. Preparação da solução de lise...6 B. Preparação de amostras para cartuchos Maxwell 16 LEV Cartridges...6 C. Ciclo do instrumento Maxwell 16 IVD Instrument Armazenar o ácido nucleico eluído Bibliografia Resolução de problemas...10 Este produto cumpre os requisitos essenciais da Directiva 98/79/CE da UE relativa a dispositivos médicos de diagnóstico in vitro. O Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification System destina-se a ser utilizado apenas nos seguintes países: Alemanha, Áustria, Bélgica, Dinamarca, Espanha, Finlândia, França, Grécia, Irlanda, Itália, Luxemburgo, Holanda, Noruega, Portugal, Reino Unido, Suécia e Suíça. 1. Utilização prevista O Maxwell 16 System, que é constituído pelo Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification System (a,b,c) e pelo Maxwell 16 Instrument configurado com o hardware de baixo volume de eluição (LEV - Low Elution Volume), é utilizado para purificação automatizada de ácido nucleico total viral de 1 16 amostras de plasma ou soro humano. O ácido nucleico total purificado é eluído em 50 µl de tampão de eluição, sendo adequado para utilização na análise directa e a jusante utilizando métodos de amplificação padrão. Estes métodos incluem uma variedade de testes de PCR (reacção de polimerização em cadeia) ou reacção de polimerase em cadeia por transcriptase inversa para efeitos de diagnóstico humano in vitro. O Maxwell 16 System não foi concebido para ser utilizado como parte de um teste de diagnóstico in vitro específico. 4/13 Página 1

3 1. Utilização prevista (continuação) O Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification System destina-se exclusivamente a utilização profissional. Os resultados do diagnóstico obtidos através da utilização de ácido nucleico purificado total com este sistema terão de ser interpretados em conjunto com outros dados clínicos ou laboratoriais. 2. Limitações de utilização do produto O Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification System não foi concebido para ser utilizado com amostras clínicas obtidas de sangue total, tecidos ou fluidos corporais que não soro e plasma humanos. Não foi concebido para ser utilizado com amostras não humanas, nem para isolamento de ácido nucleico de outros organismos não virais. O desempenho do Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification System foi avaliado em 300 µl de amostras de soro ou plasma humano utilizando amostras modelo de citomegalovirus (CVM), vírus de ADN ou ARN e vírus de hepatite C inactivos (HCV). O utilizador é responsável por estabelecer as características de desempenho necessárias às aplicações de diagnóstico a jusante. Poderá optar por adicionar controlos internos exógenos (IC) à amostra ou lisato. Determinados controlos de ácido nucleico inferiores a 100 bp poderão não ser purificados de forma eficaz utilizando o sistema. O utilizador é responsável por estabelecer o desempenho de todos os IC (controlos internos). Será necessário incluir os controlos apropriados em todas as aplicações de diagnóstico a jusante que utilizem ácido nucleico purificado com o Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification System. A conformidade com a Directiva 98/79/CE da UE relativa a dispositivos médicos para diagnóstico in vitro e só se aplica à utilização do instrumento Maxwell 16 IVD Instrument (N.º Cat. AS3050) no modo clínico, com o Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification System (N.º Cat. AS1155). Página 2 4/13

4 3. Componentes do produto, Condições de armazenamento e Legenda dos símbolos Produto Tamanho N.º Cat Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification System 48 preparações AS1155 Cada sistema contém reagentes suficientes para 48 purificações. Inclui: 48 Cartuchos Maxwell 16 LEV Cartridges (MCC) 20 ml de Tampão de lise 2 1 ml Solução de proteinase K (PK) 20 ml de água isenta de nucleases 50 Êmbolos de LEV 50 Tubos de eluição (0,5 ml) Condições de armazenamento: Guarde os componentes à temperatura ambiente (15 30 C). Veja a data de validade indicada na etiqueta do produto. Não utilize o produto após expiração da data de validade. Informações de segurança: Os cartuchos Maxwell 16 LEV Cartridges contêm etanol e isopropanol, que são substâncias inflamáveis, bem como cloridrato de guanidina e ureia, que são substâncias tóxicas e irritantes. Quando trabalhar com estas substâncias, utilize sempre luvas e siga os procedimentos de segurança padrão. Para obter informações de segurança adicionais, consulte a Ficha de dados de segurança dos materiais, disponível em: Os cartuchos Maxwell 16 LEV Cartridges foram concebidos para serem utilizados com substâncias potencialmente infecciosas. Os utilizadores têm de usar protecção adequada (ou seja, luvas e óculos de protecção) ao manusearem substâncias infecciosas. Devem igualmente seguir as directrizes institucionais relativas ao manuseamento e eliminação de todas as substâncias infecciosas utilizadas com este sistema.! Nota: Devido à toxicidade dos químicos utilizados no processo de purificação e a prevalência de RNase, recomendamos a utilização de luvas na preparação das amostras e dos cartuchos. MDSS GmbH Schiffgraben Hannover, Alemanha 4/13 Página 3

5 Legenda dos símbolos Símbolo Explicação Símbolo Explicação Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Representante autorizado Armazenar a15 30 C Woods Hollow Rd. Madison, WI USA Fabricante! Importante Nocivo. Irritante. <n> Contém quantidade suficiente para n testes Conformidade Europeia Aviso. Risco biológico. Aviso. Risco de lesão. Número de catálogo Número de lote Não reutilizar 4. Configuração do hardware e do firmware do instrumento Maxwell 16 Instrument Para utilizar o Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification System o instrumento Maxwell 16 IVD Instrument tem de ser configurado com hardware de LEV. Se o instrumento Maxwell 16 Instrument incluir hardware de SEV (Standard Elution Volume), terá de ser reconfigurado utilizando o Maxwell 16 LEV Hardware Kit (N.º Cat. AS1250). A reconfiguração do instrumento é fácil e simples. Consulte o manual Maxwell 16 IVD Instrument Technical Manual #TM315 para obter instruções. Página 4 4/13

6 5. Recolha e armazenamento de amostras antes da purificação Recomenda-se a observância de precauções relativas a patogéneos no sangue no manuseamento de amostras derivadas de humanos. A colheita de sangue deverá ser feita em tubos Vacutainer com anticoagulante EDTA ou ACD. Evite a utilização de heparina, uma vez que pode inibir amplificações a jusante. As recomendações gerais a seguir apresentadas destinam-se à preparação e armazenamento de amostras de plasma e soro (1,2). Separe o plasma das células no prazo de 1 hora após a colheita do sangue com centrifugação a g durante 20 minutos a 25 C e, em seguida, decante para um tubo limpo. Separe o soro do sangue coagulado, centrifugando a g durante 10 minutos a 25 C e, em seguida, decante para um tubo limpo. Guarde as amostras de plasma e soro a 2 8 C durante um máximo de 24 horas, ou congele as amostras que não sejam processadas no prazo de 24 horas a -20 C durante um máximo de 5 dias. Evite a realização de ciclos congelação-descongelação repetidos e não guarde as amostras num congelador sem gelo. As condições específicas de colheita e armazenamento podem variar, dependendo do vírus isolado. Estas informações estão incluídas na informação técnica relativas ao sistema de análise a jusante. Os vírus ARN são susceptíveis de degradação em qualquer fase da colheita e processamento da amostra Mantenha o ambiente isento de RNase durante todas as fases do procedimento.! 6. Purificação de ácido nucleico viral total a partir de plasma ou soro Mantenha o ambiente isento de RNase durante o processamento. Utilize sempre pontas de pipeta isentas de RNase e resistentes a aerossóis. Troque de luvas frequentemente, de forma a reduzir a possibilidade de contaminação por RNase. O processo de isolamento inclui a lise da amostra na presença do tampão de lise e da Proteinase K a 56 C, numa placa térmica ou banho de água. Este tratamento remove a camada de proteína viral e inactiva RNases na amostra. As amostras são então transferidas para o poço da amostra do cartucho Maxwell 16 LEV Cartridge, sendo o restante processamento totalmente automatizado. As partículas paramagnéticas são misturadas com a amostra para ligação óptima do ácido nucleico e subsequentemente lavadas em várias soluções tampão. A eluição é realizada em água isenta de nucleases. Materiais que devem ser fornecidos pelo utilizador tubos de microcentrifugação de 1,5 ml ou 2 ml, isentos de nucleases tubo para a solução de lise placa térmica ou banho de água a 56 C tubos de 0, 5 ml, isentos de nucleases pontas de pipeta resistentes a aerossóis, esterilizadas, isentas de RNase 4/13 Página 5

7 6.A. Preparação da solução de lise! Se o tampão de lise se apresentar turvo ou contiver precipitados, aqueça a C até clarear o tampão de lise. Prepare uma solução de lise fresca para cada lote de amostras, conforme descrito na Tabela 1. Recomendamos a preparação de cerca de 20 % adicional de solução de lise para compensar potenciais perdas durante a pipetagem. Tabela 1. Preparação da solução de lise para amostras de 300 µl de plasma ou soro. Reagente Volume para uma amostra Volume para 16 amostras 1 Tampão de lise µl µl Solução de proteinase K 30 µl 570 µl 1Os volumes indicados para o tampão de lise e solução de proteinase K para 16 amostras incluem aproximadamente 20 % de volume extra. 2Se for utilizado um controlo interno, este pode ser adicionado à solução de lise. Os controlos internos não são fornecidos com este kit. 6.B. Preparação de amostras para cartuchos Maxwell 16 LEV Cartridges As amostras de plasma ou soro podem ser frescas ou congeladas. Descongele as amostras congeladas à temperatura ambiente ou em gelo e misture por rotação durante 10 segundos, antes de usar. Identifique os tubos da microcentrifugação utilizados para lise das amostras. Pode utilizar a opção de identificação com código de barras. 1. Pipete cada amostra de plasma ou soro para dentro de um tubo de microcentrifugação de 1,5 ml ou 2 ml com tampa. 2. Adicione solução de lise preparada conforme descrito na Secção 6.A. Para amostras de 300 µl, adicione 330 µl de solução de lise. 3. Feche os tubos e agite por rotação durante 10 segundos. 4. Para amostras de plasma, prossiga com o passo 5. Para amostras de soro, incube à temperatura ambiente (15-30 C) durante 10 minutos e, em seguida, prossiga com o passo Incube a 56 C numa placa térmica ou banho de água, durante 10 minutos. Durante a incubação, prossiga com o Passo 6 para preparar os cartuchos. Nota: As amostras contendo vírus, tais como o vírus da hepatite B, requerem incubação a 80 C para recuperação óptima do ácido nucleico devido à estrutura secundária do genoma viral. 6. Troque de luvas antes de manusear os cartuchos, êmbolos de LEV e tubos de eluição. Coloque os cartuchos a serem utilizados no suporte de cartuchos Maxwell 16 LEV Cartridge Rack (N.º Cat. AS1251). Coloque cada cartucho no suporte com a face da etiqueta voltada na direcção contrária à do tubo de eluição. Pressione para baixo o cartucho de forma a encaixá-lo na respectiva posição no suporte. Remova cuidadosamente o selo, de forma retirar toda a película plástica da parte superior do cartucho. Certifique-se de que remove a totalidade da película aderente vedante e eventuais resíduos de adesivo, antes de colocar os cartuchos no instrumento. Página 6 4/13

8 Notas: 1. Se estiver a processar um número inferior a 16 amostras, centre os cartuchos na plataforma. 2. Os pingos de reagente ou de amostra retidos em qualquer parte do suporte de cartuchos Maxwell 16 LEV Cartridge Rack deverão ser limpos com uma solução de água e detergente, seguida de um spray ou toalhete bactericida e, em seguida, água. Não utilize lixívia em nenhum componente do instrumento. 7. Coloque um êmbolo de LEV no poço n.º 8 de cada cartucho. O poço n.º 8 é o que está mais próximo do tubo de eluição. 8. Coloque tubos de eluição de 0,5 ml na parte anterior do suporte de cartuchos Maxwell 16 LEV Cartridge Rack. Adicione 50 µl de água isenta de nucleases a cada tubo de eluição. Notas: 1. Se a água isenta de nucleases permanecer na face lateral do tubo é possível que não seja conseguida a eluição óptima. 2. Utilize apenas os tubos de eluição de 0,5 ml fornecidos com o kit. Outros tubos poderão não funcionar com o instrumento Maxwell 16 Instrument. 9. Transfira o lisato da amostra para o poço n.º 1 do cartucho. O poço n.º 1 é o poço que fica mais próximo da etiqueta do cartucho e mais afastado do tubo de eluição. 4/13 Página 7

9 6.C. Ciclo do instrumento Maxwell 16 IVD Instrument Consulte o manual Maxwell 16 IVD Instrument Technical Manual #TM315 para obter informações detalhadas sobre como configurar e utilizar o instrumento Maxwell 16 IVD Instrument. 1. Ligue o instrumento Maxwell 16 IVD Instrument. O instrumento faz o arranque, apresenta a versão de firmware, executa uma auto-verificação e coloca todas as peças móveis na respectiva posição inicial. 2. Verifique se o ecrã inicial apresenta a indicação LEV e se o hardware de LEV se encontra presente. Prima Run/Stop para continuar. 3. Introduza o utilizador e o PIN, se esta opção estiver activada. 4. No ecrã Protocolo, seleccione Viral. 5. No ecrã seguinte, verifique se estão seleccionados o método e o utilizador correctos. Seleccione Run/Stop para continuar. 6. Abra a porta quando for solicitado no ecrã e, em seguida, seleccione Run/Stop. Aviso: Perigo de ponto de compressão. 7. Siga as instruções no ecrã relativas à introdução de informações de leitor de código de barras, se esta opção estiver activa. 8. Transfira o suporte de cartuchos Maxwell 16 LEV Cartridge Rack que contém os cartuchos preparados na plataforma do instrumento Maxwell 16 IVD Instrument. Certifique-se de que o suporte é colocado no instrumento Maxwell 16 IVD Instrument com os tubos de eluição próximo da porta. O suporte só encaixa no instrumento quando colocado com esta orientação. Se tiver dificuldade em encaixar o suporte na plataforma, verifique se o suporte tem a orientação correcta. Certifique-se de que o suporte está nivelado com a plataforma do instrumento. Nota: Segure o suporte de cartuchos Maxwell 16 LEV Cartridge Rack de ambos os lados de forma a evitar que os cartuchos saiam dos respectivos encaixes no suporte. 9. Verifique se as amostras foram adicionadas ao poço n.º 1 dos cartuchos, se os cartuchos no suporte estão carregados no instrumento, se estão presentes tubos de eluição com 50 µl de água isenta de nucleases e êmbolos de LEV no poço n.º Seleccione Run/Stop no ecrã Configuração LEV. A plataforma retrai. Feche a porta. Aviso: Perigo de ponto de compressão. 11. O instrumento Maxwell 16 IVD Instrument inicializa imediatamente o ciclo de purificação. O ecrã apresenta o tempo de ciclo restante, aproximado. Página 8 4/13

10 Notas: 1. A pressão do botão Run/Stop ou a abertura da porta interrompem o ciclo. 2. Se o ciclo for interrompido antes da respectiva conclusão, o instrumento irá remover as partículas dos êmbolos por meio de lavagem e ejectar os êmbolos para o poço n.º 8 do cartucho. As amostras serão perdidas. 12. Uma vez concluído o ciclo de purificação automática, siga as instruções em ecrã relativas à transferência dos dados. Para obter instruções detalhadas, consulte o manual Maxwell 16 IVD Instrument Technical Manual #TM315 and Maxwell Sample Track Software Technical Manual #TM Siga as instruções em ecrã apresentadas no final do método para abrir a porta. Verifique se os êmbolos se encontram no poço n.º 8 do cartucho, no final do ciclo. Se os êmbolos não tiverem sido retirados do conjunto de haste magnética, pressione-os suavemente com a mão para os retirar. 14. Pressione Run/Stop para fazer deslizar a plataforma para fora do instrumento. Aviso: Perigo de ponto de compressão. 15. Retire o suporte de cartuchos Maxwell 16 LEV Cartridge Rack do instrumento. Retire os tubos de eluição contendo ácido nucleico viral e feche os tubos. 16. Centrifuge os tubos de eluição a x g durante 2 minutos. Transfira o sobrenadante para um tubo limpo (não fornecido). Evite a transferência de partículas paramagnéticas e quaisquer resíduos flutuantes. 17. Retire os cartuchos e êmbolos do suporte de cartuchos Maxwell 16 LEV Cartridge Rack, e deite fora como lixo de risco biológico. Não reutilize os cartuchos de reagente, êmbolos de LEV ou tubos de eluição. Certifique-se de que as amostras são retiradas do instrumento Maxwell 16 IVD Instrument antes do tratamento por UV, de modo a evitar danificar o ácido nucleico. 7. Armazenar o ácido nucleico eluído Caso as amostras não sejam processadas imediatamente, aguarde o ADN eluído em gelo, ou a 4 C até um máximo de 24 horas. Para um tempo de armazenamento superior, congele a -20 C ou -70 C. A estabilidade do ADN viral é inferior, devendo ser preferencialmente testada em ensaios a jusante, imediatamente após o isolamento. Em alternativa, guarde o ARN viral eluído a -70 C. Consulte as instruções para obter informações sobre aplicações a jusante relativas às recomendações de armazenamento e manuseamento de amostras específicas. 8. Bibliografia 1. Clinical Laboratory Standards Institute (2007). Handling, transport, and storage of specimens for molecular methods. Pode ser consultado online em: 2. Murray, P.R. et al. (2007) Manual of Clinical Microbiology, 9th Edition, ASM Press. 4/13 Página 9

11 9. Resolução de problemas Para obter resposta a questões não abordadas neste manual, contacte o escritório ou distribuidor local da Promega. As informações de contacto estão disponíveis em: Sintomas Causas e observações Menor recuperação de ácido nucleico As amostras iniciais foram comprometidas. viral que o esperado (ou seja, para os Certifique-se de que as amostras foram colhidas, controlos internos fornecidos pelo cliente) enviadas e guardadas de acordo com as directrizes recomendadas. Para amostras de ARN viral, certifique-se de que são utilizadas condições isentas de RNase na preparação das amostras e na configuração do ensaio, incluindo tubos e pontas de pipeta isentas de RNase. O instrumento Maxwell 16 Instrument foi configurado para o método incorrecto. Certifique -se de que escolhe o método Viral correcto. O passo de processamento foi inferior a óptimo. Prepare tampão de lise e proteinase K imediatamente antes de usar e deite fora as soluções não usadas. Utilize apenas o tampão de lise fornecido com o kit. A mistura incompleta pode reduzir a lise. Misture por rotação a amostra com a solução de lise, conforme recomendado. Realize um tratamento de protease incompleto para remover cápsides virais. Verifique a temperatura da placa térmica ou banho de água e incube durante o tempo recomendado. Alguns vírus podem requerer temperaturas de incubação superiores. A adição de uma quantidade de amostra superior ao recomendado pode reduzir a recuperação do ácido nucleico. Verifique se foi adicionado um êmbolo de LEV ao cartucho. Certifique-se de que todos os cartuchos estão correctamente encaixados no suporte, antes de processar. Problemas relacionados com armazenamento pós-purificação. Retire os eluatos e guarde à temperatura recomendada, imediatamente após o ciclo no instrumento Maxwell 16 IVD Instrument. Não sujeite os eluatos a múltiplos ciclos de congelação-descongelação antes de ensaios a jusante. Os controlos internos de ácido nucleico numa quantidade inferior a 100 bp não podem ser purificados de forma eficiente com este sistema. O utilizador é responsável por estabelecer o desempenho de qualquer controlo interno. Página 10 4/13

12 Sintomas Fraca amplificação Contaminação cruzada Método viral não é opção no instrumento Falha de corrente durante um ciclo Causas e observações O transporte de partículas paramagnéticas pode causar interferência na reacção de amplificação. Retire as partículas do tubo de eluição por centrifugação. Foi adicionado o tampão de eluição incorrecto. Utilize apenas a água isenta de nucleases fornecida com o Maxwell 16 Viral Total Nucleic Acid Purification System. Utilize pontas de pipeta novas para cada amostra para evitar contaminação entre as amostras. Evite salpicar quando adicionar lisatos aos cartuchos. Os cartuchos podem ser removidos do suporte para adição das amostras, de forma a minimizar a contaminação dos cartuchos adjacentes. Relativamente ao instrumento Maxwell 16 MDx Instrument (N.º Cat. AS3050), verifique se o instrumento se encontra em modo LEV. Para recuperar amostras após falha de corrente, em primeiro lugar certifique-se de que as partículas se encontram num dos poços do cartucho e que não se encontram anexadas ao êmbolo. Se a falha de corrente tiver ocorrido num ponto em que as partículas magnéticas foram capturadas fora dos êmbolos, mova manualmente os êmbolos para cima e para baixo nos poços para lavar e remover as partículas e, em seguida, remova manualmente os êmbolos do instrumento e reinicie a purificação desde o início com novos êmbolos. (a) U.S. Pat. Nos. 7,329,488, 7,721,947 and 7,891,549 and other patents pending. 2009, 2012, 2013 Promega Corporation. Todos os direitos reservados. Maxwell é uma marca comercial registada da Promega Corporation. Vacutainer é uma marca comercial registada da Becton, Dickinson and Company. Os produtos podem estar cobertos por patentes pendentes ou por patentes emitidas ou podem ter algumas limitações. Visite o nosso website para obter mais informações. Todos os preços e especificações estão sujeitos a alterações sem aviso prévio. As características dos produtos estão sujeitas a alteração. Contacte a Assistência Técnica da Promega ou aceda ao catálogo da Promega online para obter as informações mais recentes acerca dos produtos da Promega. 4/13 Página 11

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