APOPTOSE EM PLACENTA DE GESTANTES COM SUSPEITA DE INFECÇÃO POR Streptococcus agalactiae. Anhanguera-Uniderp.

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1 APOPTOSE EM PLACENTA DE GESTANTES COM SUSPEITA DE INFECÇÃO POR Streptococcus agalactiae 1,2 Paulo Zanin; 2 Marcia Maria Silva, 2 Mariana Mauro; 2 Doroty M. Dourado 1 Curso de Medicina, 2 Laboratório de Toxinologia e Plantas Medicinais. Universidade Anhanguera-Uniderp. Paulozanin@hotmail.com Resumo A apoptose tem papel crítico nos diferentes estágios de desenvolvimento placentário, incluindo a invasão intersticial e endovascular e a tolerância imunológica materna a diferentes microorganismos invasores, sendo que qualquer desbalanço neste desequilíbrio pode causar danos sérios à mãe e ao feto. Este trabalho tem como objetivo avaliar a ocorrência de apoptose em placentas de mulheres com suspeita de infecção por Streptococcus sp. Todas as amostras de placenta foram submetidas ao processamento histológico, corados em HE e analisados em microscópio óptico. Para isto foram colhidas 13 amostras de placenta em que foi extraído o DNA genômico para PCR que utilizou aproximadamente 100ng de DNA para diagnóstico de EGB. A média de idade foi 36,6 anos, todos os partos a termo. 11 gestantes realizaram o pré-natal corretamente e 2 não o fizeram. 5 gestantes apresentaram fator de risco para sepse neonatal, sendo as 7 restantes formaram o grupo controle. As 13 gestantes foram negativas para estreptococos e não foram encontrados processos inflamatórios e áreas de necrose nos hilos placentários e sem evidencias de núcleos apoptóticos. Palavras-chave: infecção; neonatal; EGB; morfologia; diagnóstico molecular; PCR. Introdução Uma das mais intrigantes características do corpo humano é sua capacidade de, em situações normais, manter um número de células relativamente estável, sendo vários os mecanismos envolvidos nesse processo. Um dos principais mecanismos é a apoptose, que representa o processo no qual a célula é induzida à autodestruição devido a uma programação genômica intrínseca ou até mesmo a fatores externos. Desta maneira o corpo consegue manter um equilíbrio entre a produção e morte de novas células, tendo papel crucial principalmente na implantação placentária e na organogênese (MEÇA, 2010). O objetivo da apoptose na placenta seria o de diminuir a espessura do tecido trofoblástico, de maneira a garantir melhor oxigenação fetal. Estudos também demonstraram que com o avanço gestacional, os níveis apoptóticos placentários aumentam possivelmente preparando a estrutura placentária para a dequitação que indica o processo natural de senescência placentária. (NEALE, MOR, 2005). Entretanto, os mecanismos que regulam este processo estão sujeitos à alterações externas, dentre elas, a presença de microorganismos. Atualmente uma série de patologias associadas à gestação estão sendo investigadas quanto aos níveis de apoptose placentários. Notou-se recentemente que pacientes com préeclâmpsia apresentaram maior atividade de apoptose trofoblástica placentária quando comparadas ao grupo controle. (ALLAIRE, 2000). Portanto, os níveis apoptóticos placentários estão diretamente ligados ao bem estar fetal e à boa evolução gestacional, sendo necessária uma melhor investigação dos fatores que possam desencadear mudanças deletérias neste processo. Dentre estes fatores, destacamos a presença de microorganismos que poderiam também através de resposta imune ou demais vias, influenciar nos níveis apoptóticos placentários. Dentre os microrganismos, aquele em que mais voltaremos nossa atenção será o Streptococcus agalactiae, pois dados epidemiológicos mundiais sugerem que a colonização retovaginal ocorre entre 10 e 30% de todas as gestantes, sendo responsáveis por 1.8 infecções neonatais por 1000 nascidos vivos ao ano (CLAEYS et al, 2010), e também devido a sua grande associação com os casos de sepse neonatal. Este microorganismo, assim como as demais espécies do mesmo gênero, são cocos Gram-

2 positivos, anaeróbios facultativos. (KONEMAN et al., 2008). A sepse neonatal é aquela que apresenta o quadro clínico que se manifesta por duas ou mais das seguintes condições clínicas: Hipo ou hipertermia; Taquipnéia; Taquicardia; sendo então subdividida em tardia e precoce de acordo com o início dos sinais. A sepse precoce é aquela que se instala até o quarto dia de vida. É provável que os patógenos responsáveis pela sepse ascendam através do trato genital e atravessam a barreira placentária (LAJOS et al, 2008). A infecções neonatais precoces ocorrem durante a primeira semana de vida e são as mais prevalentes (80% dos casos), enquanto que a tardia (após a primeira semana de vida) corresponde ao restante dos casos (SCHUCHAT, 1998). Materiais e métodos Amostras: Até o momento treze amostras foram selecionadas na sala de parto do Hospital Santa Casa de Campo Grande/MS, de maneira a preencher casos com critérios positivos para estreptococos e controles negativos. Os dados clínicos de cada paciente selecionada foram também. Critérios de inclusão: Gestantes, maiores ou menores de idade, que aceitaram as condições do termo de consentimento da pesquisa e o assinaram, e que preencheram os critérios de suspeita para infecção por Estreptococo do Grupo B. Critério de exclusão: Gestantes que não aceitaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Biologia molecular: Para a extração de DNA da placenta foi utilizado o método descrito por Grimberg et al. (1989) com algumas modificações realizadas no Laboratório de Toxinologia e Plantas Medicinais da Universidade Anhanguera-Uniderp para tecidos a fresco ou congelados. O rendimento de DNA é cerca de µg por g de placenta. Quantificação do DNA total: Foram utilizados 5 µl do DNA total obtido e diluídos em 95 µl de água Millipore estéril filtrada e essa diluição (1:20) foi utilizada para quantificação. Após a determinação da concentração, 1,0 µl (aproximadamente 500 ng) da amostra foi submetido ao PCR. Reação em cadeia da polimerase (PCR): Após ser extraído e quantificado o DNA, foi realizada a PCR. Foi adicionado uma mistura (pré-mix) de dntps (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), primers (iniciadores) específicos para o EGB e a enzima Taq DNA polimerase em uma solução tampão. Os resultados foram analisados através de eletroforese em gel de poliacrilamida com Syber Green e transiluminados com ultravioleta ou Gel de acrilamida a 30% corado em prata. Histopatologia: As amostras de placenta foram fixadas em formol tamponado 10%, processadas para inclusão em bloco de parafina e os cortes histológicos obtidos foram corados com Hematoxilina Eosina (HE) para se quantificar a resposta inflamatória, as áreas de necrose e também a apoptose nos hilos placentários. Morfometria: A quantificação das células em apoptose foi feita manualmente em imagens digitalizadas obtidas dos campos histológicos em microscópio de luz com objetiva planapocromática de 40 vezes. A morfometria das imagens digitalizadas foi feita em analisador de imagens. Resultados e Discussão Até o presente momento, 13 gestantes foram incluídas neste estudo após terem lido e assinado o termo de consentimento livre e esclarecido. A média de idade foi de 31,6 anos, sendo 21 anos a gestante mais jovem e 41 anos a gestante mais velha. As pacientes encontravam-se em média na 38º semana gestacional, sendo todos os partos a termo. 11 gestantes (84,6%) realizaram corretamente os exames do pré-natal, participando do número mínimo de consultas preconizado pelo Ministério da Saúde, sendo que apenas duas (15,4%) não realizaram corretamente.

3 Do total de gestantes, 5 (38,4%) foram classificadas como portadoras de algum fator de risco para o desenvolvimento da sepse neonatal (trabalho de parto prematuro, ruptura de membranas superior a 18 horas antes do parto, colonização materna por agentes relacionados à sepse neonatal, febre materna superior a 38 ºC durante ou imediatamente após o trabalho de Parto, recém nascido de baixo peso (<2500 g), corioamnionite, gestações anteriores com infecção neonatal), sendo que o restante das pacientes, totalizando 8 (61,6%), não apresentaram nenhum fator de risco. Este estudo revelou que 5 pacientes (38,4%) possuíam infecções do trato urinário (ITU) durante o estudo ou tratado em algum momento da gestação, sendo as 8 pacientes (61,6%) restantes não diagnosticadas com ITU. Neste caso, as paciente ITU-positivas tiveram uma gestação média de 38,4 semanas gestacionais, (mediana 38 semanas e moda 37 semanas). em comparação, as pacientes ITU-negativas tiveram gestação média de 38,25 semanas, (mediana 38,5 semanas e moda 39 semanas). A gesta ITU-negativa mais precoce foi de 37 semanas, mesmo valor encontrado também para as pacientes ITU-positivas. Os valores diferem quanto a gestação mais longa, sendo em 39 semanas para as pacientes não portadoras de infecção e de 41 semanas para o grupo de gestantes diagnosticadas com infecção. Os resultados obtidos quanto às taxas de mulheres com ITU durante a gestação se aproximaram com os valores dos estudos de Al-Haddad (2005) e Shahira (2007), onde os valores encontrados foram entre 30 32% para portadoras de infecção e 68-70% para não portadoras, diferindo do estudo de Delzell Jr (2000) onde as ITU foram encontradas em aproximadamente 3 a 12% das gestantes. Nosso estudo demonstrou que não houve diferença significativa entre a idade gestacional no momento do parto com a infecção do trato urinário como encontrado no estudo de Schieve (1994) com mais de 25 mil pacientes. Entretanto, os dados encontrados foram compatíveis com outros estudos como no caso do realizado por Rivero et al (2002). A associação entre idade gestacional inferior a 37 semanas e baixos níveis de anticorpos anti- EGB concorda com a maior vulnerabilidade destes neonatos á infecção pelo streptococcus agalactiae. Yancey et al. (1996) demonstraram haver risco maior de sepse por EGB quanto menor a idade gestacional. Benitz et al. (1999), em revisão de literatura, apontaram a prematuridade como importante fator e risco para sepse por EGB. As 13 amostras colhidas no Hospital Santa Casa CG/MS e processadas pela reação em cadeia da polimerase para caracterização da presença de S. agalatiae todas foram negativas para estreptococos. Os fragmentos de placenta das 13 pacientes foram processados, incluídas em parafina, cortados e corados com hematoxilina-eosina (HE), sendo submetidos à análise microscópica para detecção de alterações morfológicas. Observou-se que nas 13 amostras não foram encontrados processos inflamatórios e áreas de necrose nos hilos placentários, além disso, nas lâminas coradas em HE não foram evidenciadas núcleos apoptóticos. Sabe-se que quando a mãe está colonizada, o recémnascido tem 50% de chance de nascer colonizado. Destes 50% colonizados, 2% apresentarão doença invasiva, ou seja, sepse precoce, pneumonia e/ou meningite (BAKER; EDWARDS, 1995). Recém-nascidos de mães colonizadas têm um risco 29 vezes maior de desenvolver sepse precoce quando comparados a recém-nascidos de mães com culturas pré-natais negativas (BOYER; GOTOFF, 1986). Conclusão Conclui-se que a média de idade das gestantes foi de 36,6 anos sendo todos os partos realizados a termo. 11 gestantes realizaram o pré-natal corretamente e 2 não o fizeram. 5 gestantes apresentaram fator de risco para sepse neonatal, sendo que as 7 restantes formaram o grupo controle. As 13 gestantes foram negativas para estreptococos e não foram encontrados processos inflamatórios e áreas de necrose nos hilos placentários e sem evidencias de núcleos apoptóticos. 5 gestantes apresentaram fator de risco para sepse neonatal (trabalho de parto prematuro, ruptura de membranas superior a 18 horas antes do parto, colonização materna por agentes relacionados à sepse neonatal, febre materna superior a 38 ºC durante ou imediatamente após o trabalho de Parto, recém nascido de

4 baixo peso (<2500 g), corioamnionite, gestações anteriores com infecção neonatal), sendo que as 7 restantes formaram o grupo controle. As 13 amostras de placentas apresentam critérios negativos para alterações morfológicas quando coradas em HE e analisadas ao microscópio óptico. A incidência materna de ITU está em 38,4% das pacientes, sendo as idades gestacionais médias das gestantes ITU-positivas e ITU-negativas são 38,4 e 38,25 semanas gestacionais respectivamente. Fontes Consultadas AL-HADDAD, A. M.; Urinary tract infection among pregnant women in Al-Mukalla district, Yemen. Easter Mediterranean Health Journal. v.11, n.3 p , 2005 ALLAIRE, A. D.; BALLENGER, K. A.; WELLS, S. R.; et al. Placental Apoptosis in Preeclampsia. Obstetrics & Gynecology. v. 96(2), p , BAKER, C.J.; EDWARDS, M. S. Group B streptococcal infections. In: REMINGTON, J.; KLEIN, J. O. (eds). Infectious diseases of the fetus and newborn infant. 4th ed., Philadelphia: WB Saunders; p BENITZ, W.E.; GOULD, J.B.; DRUZIN, M.L. Antimicrobial prevention of early-onset group B streptococcal sepsis (estimates of risk reduction based on a critical literature review). Pediatrics. v. 106, n. 6, p. 1-13, BOYER, K.M.; GOTOFF, S.P.; Prevention of early-onset neonatal group B streptococcal disease with selective intrapartum chemoprophylaxis. New England Journal of Medicine. v. 314, n. 26, p CLAEYS, G.; SAERENS, B.; VERSTRAELEN, H.; et al. Comparison of different sampling techniques and of different culture methods for detection of group B streptococcus carriage in pregnant women. Journal of BMC Infectious Diseases. v. 10, p. 1-8, DELZELL JR, J. R.; LEFEVRE, M.L.; Urinary tract infections during pregnancy. American Family Physicians. v.61, p , GRIMBERG, J. et al. A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood. nucleic acids research. v. 17, p , KONEMAN, E. W.; ALLEN, S. D.; JANDA, W. M. et al. Diagnóstico Microbiológico. 6ª Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, LAJOS, G. J. et al. Colonização bacteriana do canal cervical em gestantes com trabalho de parto prematuro ou ruptura prematura de membranas. Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia. Rio de Janeiro, v. 30(8), p , MEÇA, K. K. O. L; APOPTOASE NA MATURAÇÃO DA PLACENTA BOVINA. 53p. Tese de doutorado em Patologia Geral. Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, NEALE, D. M.; MOR, G. The role of Fas mediated apoptosis in preeclampsia. Journal of Perinatology. v. 33, p , RIVERO, M.; SCHAAB, A.; HRYCUK, G. et al. La infección Urinaria Durante El Embarazo Se Asocia Con Pobres Resultados Perinatales. Revista Médica del Nordeste. v. 3, p , SCHIEVE, L. A.; HANDLRES,A.;HERSHOW, R. et al. Urinary tract infection during pregnancy: its association with maternal morbidity and perinatal outcome. American Journal of Public Health. v. 84 n. 3 p SCHUCHAT, A.; STOLL, B,J.; Maternal carriage of group B streptococci in developing countries. Journal of pedriatric Infectology diseases. v.17 v.6 p , SHAHIRA, D. R.; HANNAN, M.; EL-TOKHY, N. Urinary Tract Infection and Adverse Outcome of Pregnancy. Revista Egypt Public Health Associations. v. 82, n.3, p , YANCEY, M.K.; DUFF, P.; KUBILIS, P. et al. Risk factors for neonatal sepsis. Journal of Obstetrics and Gynecoly., v.87, p , 1996.

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