METODOLOGIA PARA DETERMINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ETILENO E RESPIRAÇÃO DE FRUTOS

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1 METODOLOGIA PARA DETERMINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ETILENO E RESPIRAÇÃO DE FRUTOS GASPERIN, Adriano Roque de 1 ; BOTH, Vanderlei 2 ; BRACKMANN, Auri 3. 1 Acadêmico do curso de Agronomia da UFSM. adrianogasperin@gmail.com 2 Eng. Agr, mestrando do PPGA da UFSM. vanderleiboth@yahoo.com.br 3 Eng. Agr., Dr. em Ciências Agrárias, Professor Adjunto do Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Santa Maria. brackman@ccr.ufsm.br RESUMO O objetivo deste trabalho foi verificar a interferência de diferentes níveis de CO 2 na produção de etileno e respiração de frutos de maçã Royal Gala e avaliar a interferência do nível de CO 2 na influência do método utilizado para determinação destes parâmetros. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com três repetições com os seguintes tratamentos: [1] Sem injeção de CO 2 e presença de envelopes contendo cal, para absorção do CO 2 produzido pela respiração; [2] Sem CO 2 e sem cal; [3] Com injeção de 0,5% de CO 2 ; [4] Com injeção de 1,0% de CO 2 ; [5] Com injeção de 1,5% de CO 2 ; [6] Com injeção de 2,0% de CO 2 ; [7] Com injeção de 2,5% de CO 2 ; [8] Com injeção de 3,0% de CO 2. As análises foram realizadas aos 2, 4 e 6 dias de exposição dos frutos a 20ºC. Segundo os resultados a respiração é drasticamente reduzida com o aumento do CO 2 nos recipientes, podendo esta avaliação ser subestimada se os recipientes permanecerem fechados por muito tempo antes das determinações, enquanto que a produção de etileno não sofre interferência dos diferentes níveis de CO 2. Palavras-chave: Pós-colheita; armazenamento; níveis de CO 2 ; fisiologia. 1. INTRODUÇÃO Durante a fase pós-colheita de frutos a produção de etileno e respiração são importantes no processo de maturação e senescência dos mesmos. Tanto a respiração quanto a produção de etileno podem ser inibidas ou estimuladas por níveis elevados de CO 2. Sendo que a respiração pode ocorrer na presença (respiração aeróbica) ou ausência (respiração anaeróbica) de O 2. Segundo Kubo et al. (1990), em 1

2 condições aeróbicas, um nível elevado de CO 2 pode estimular, inibir, ou não afetar o metabolismo respiratório dos frutos após a colheita, dependendo da espécie e do nível de CO 2. A inibição da respiração pelo CO 2 pode ser devido à redução da atividade ou síntese de várias enzimas do metabolismo respiratório (LANGE E KADER, 1997), em função da mudança do ph intracelular (BOWN, 1985), redução do fluxo da glicólise (KERBEL et al., 1988) e do ciclo de Krebs (SHIPWAY & BRAMLAGE, 1973). Segundo Kubo et al. (1990), a ação e síntese de etileno em hortaliças também sofrem influência de altos níveis de CO 2. A ação inibidora do CO 2 na ação do etileno pode se dar de maneira direta, ou seja, atuando como inibidor competitivo da ligação do etileno com o receptor (BURG E BURG, 1967) ou indireta devido a mudanças do ph intracelular que inibe a ligação do etileno com o receptor (ROTHAN E NICOLAS, 1994). O CO 2 em alta concentração também pode inibir a síntese do etileno devido à interferência sobre a ACC oxidase (ROTHAN E NICOLAS, 1994). Segundo (DONG et al., 1992), embora altos níveis de CO 2 possam inibir a produção de etileno, o CO 2 também é necessário para a ativação da ACC oxidase e, assim, converter ACC em etileno. Uma forma de avaliar a qualidade dos frutos na pós-armazenagem é por meio da determinação da produção de etileno e respiração, que são realizados por cromatografia gasosa e analisador de CO 2 respectivamente. Porém, para se obter amostras desses gases pode-se colocar os frutos em recipientes hermeticamente fechados por determinado tempo e posteriormente retira-se amostras gasosas para quantificação de etileno e circula-se o ar do recipiente através de um analisador de gases (O 2 e CO 2 ) para a determinação de CO 2. Pelo fato de os recipientes permanecerem fechados e sem renovação do ar, dependendo do tempo, cultivar e estádio de maturação dos frutos pode ocorrer um acúmulo significativo de CO 2 e etileno nos recipientes, que pode afetar a síntese de etileno e a respiração destes frutos. Em outro método utilizado, descrito por Brackmann (1990), um fluxo de ar contínuo de 11,3 L h -1 passa pelos recipientes onde estão os frutos, impedindo o acúmulo de CO 2 e etileno durante o período de determinação desses gases. A respiração é quantificada pela diferença da concentração de CO 2 proveniente do ar que sai dos recipientes, daquela que entra nos recipientes. A quantificação da produção de etileno é realizada por meio de cromatografia gasosa, de uma amostra que é retirada do ar que sai dos recipientes. O inconveniente deste método é a necessidade de equipamentos mais sofisticados, como uma mesa com fluxo de ar por onde é circulado continuamente o ar em cada amostra de frutos. O objetivo deste trabalho foi verificar a interferência de diferentes níveis de CO 2 na produção de etileno e respiração de frutos de maçã Royal Gala e avaliar a eficiência deste 2

3 método, utilizado para determinação destes parâmetros. 3. METODOLOGIA O experimento foi conduzido no Núcleo de Pesquisa em Pós-Colheita (NPP) do Departamento de Fitotecnia da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). O material experimental constou de maçãs da cultivar Royal Gala, oriundos de um pomar comercial de Vacaria, RS. Os frutos permaneceram por 45 dias armazenados na temperatura de 0,5ºC antes da realização das análises. As amostras foram pesadas e colocadas em recipientes de vidro com volume de 5 litros, à temperatura de 20ºC durante 6 dias. As medições (produção de etileno e respiração) foram feitas as 2, 4 e 6 dias de armazenamento a 20ºC. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com três repetições com os seguintes tratamentos: [1] Sem injeção de CO 2 e presença de envelopes contendo cal, para absorção do CO 2 produzido pela respiração; [2] Sem CO 2 e sem cal; [3] Com injeção de 0,5% de CO 2 ; [4] Com injeção de 1,0% de CO 2 ; [5] Com injeção de 1,5% de CO 2 ; [6] Com injeção de 2,0% de CO 2 ; [7] Com injeção de 2,5% de CO 2 ; [8] Com injeção de 3,0% de CO 2. Após colocar a cal nos recipientes do tratamento [1], todos os vidros foram fechados hermeticamente com uma tampa contendo dois septos de borracha, por onde foi retirada a amostra para determinação da produção de etileno e circulado o ar para a determinação da respiração. A cal foi utilizada para eliminar o CO 2 formado pelos frutos, de modo que sua concentração permanecesse muito baixa. Após o fechamento dos recipientes, injetou-se CO 2 nos mesmos até a concentração estipulada para cada tratamentos. Para tanto utilizou-se CO 2 proveniente de um cilindro de alta pressão, que foi injetado com uma seringa, pelo septo de borracha, no interior de cada recipiente. O volume de CO 2 necessário para atingir a concentração desejada foi previamente calculada em função do espaço livre de cada recipiente. Após a injeção do CO 2, o ar do recipiente foi circulado em um analisador de gases para comprovar se realmente a concentração de CO 2 presente no recipiente era aquela desejada para o tratamento em questão. Os recipientes permaneceram fechados por 1,5 horas antes da determinação da produção de etileno e respiração, para que ocorresse acúmulo de CO 2 e etileno, em função do metabolismo dos frutos. Após as determinações os recipientes foram abertos até a próxima determinação (dois dias depois). A determinação da produção do etileno foi realizada por cromatografia gasosa, sendo realizado duas medições para cada recipiente, perfazendo um total mínimo de 6 valores para cada tratamento. Para isto foram retiradas dos recipientes, com o auxílio de 3

4 uma seringa, amostras de gás de 1mL e injetadas em um cromatógrafo a gás, marca Varian modelo Star 3400CX, equipado com um detector de ionização por chama (FID) e coluna Porapak N80/100. As temperaturas da coluna, injetor e detector foram de 90, 140 e 200 C, respectivamente. Com as concentrações de etileno determinadas nestes recipientes foi calculada a produção de etileno por meio da fórmula: PE = [V- (P/ D)] * E / (P *T) = μl C 2 H 4 kg -1 h -1, onde: PE = produção de etileno (μl de C 2 H 4 kg -1 h -1 ); V = volume do recipiente (L); P = massa da amostra de frutos (kg de massa fresca); D = densidade dos frutos (g cm - 3 ); E = μl L -1 de etileno; T = tempo de fechamento dos recipientes (h). A concentração média de CO 2 presente nos recipientes no momento das determinações foi calculada pela soma da concentração inicial (ou após a injeção de CO 2 ) com a concentração no momento da determinação, dividido por dois. A respiração dos frutos foi determinada pela quantificação do CO 2 produzido. O ar dos mesmos recipientes utilizado para a determinação do etileno foi circulado através de um analisador eletrônico de CO 2, marca KB7. A partir da concentração de CO 2 presente nos recipientes (subtraindo-se o valor do CO 2 injetado inicialmente), do espaço livre do recipiente, do peso do fruto e do tempo de fechamento, foi calculada a respiração em ml CO 2 kg -1 h RESULTADOS E DISCUSSÕES Nos frascos sem injeção de CO 2 e presença de envelopes contendo cal não foi observada presença de CO 2 nas determinações. Esse resultado era esperado, uma vez que a cal presente nos recipientes absorve o CO 2 produzido pela respiração dos frutos. Esse procedimento foi adotado para verificar a produção de etileno nos recipientes com ausência de CO 2. O gráfico 1 mostra a interferência das concentrações médias de CO 2 na respiração dos frutos aos 2, 4 e 6 dias a 20ºC. Pela análise dos resultados é possível verificar que a respiração decresce à medida que aumenta a concentração de CO 2 até ser praticamente inibida próximo a concentração média de 3,00% de CO 2. A redução gradual da respiração causada pelo aumento de CO 2 pode estar relacionada à atividade reduzida ou síntese de certas enzimas envolvidas no processo respiratório (KERBEL et al., 1988), como a succinato desidrogenase do ciclo de Krebs. No entanto, a respiração nula próxima a concentrações médias de 3,00% de CO 2 além de estar relacionada à diminuição da respiração em função da inibição de enzimas envolvidas no processo respiratório, possivelmente também está relacionada a uma absorção de CO 2 pelos frutos. O fato de ter sido injetado altas concentrações de CO 2 nos recipientes cria um gradiente de concentração deste gás entre o interior dos frutos e o ambiente em volta dos mesmos (maior concentração fora e menor 4

5 dentro dos frutos). Isso faz com que essa diferença de gradiente estimule a difusão de CO 2 para o interior dos frutos, ocupando os espaços intercelulares e se solubilizando no suco celular. Gráfico 01 - respiracão de frutos de maçã Royal Gala em diferentes concentrações médias de CO2. Ao contrário de respiração, a produção de etileno não sofreu influência significativa dos níveis de CO 2 utilizados (Gráfico 2). É possível observar que, apesar da diferença nos valores entre os dias das determinações, causado pelo maior metabolismo dos frutos à medida que aumenta o tempo de exposição a 20ºC, o comportamento para todos os dias de avaliação foi semelhante, ou seja, praticamente não houve alteração na produção de etileno com a exposição à diferentes concentrações de CO 2. No entanto, na análise dos quatro dias de exposição a 20ºC é possível observar que a ausência de CO 2 no ambiente afeta a produção de etileno. Isso se deve ao fato de que o CO 2 é necessário para ativar a enzima ACC oxidase (DONG et al., 1992), que atua na última etapa da rota de formação de etileno (conversão da ACC à ETILENO). Entretanto esse fato não foi observado para os demais dias de avaliação. Na literatura é possível encontrar alguns trabalhos de pesquisa que buscam relacionar a interferência do CO 2 na produção de etileno. Burg & Burg (1967) propuseram que o CO 2 é um inibidor do etileno por competir pelos sítios de ligação do etileno. Outros experimentos sugerem que a inibição das ligações do etileno podem ser indiretas ou devido a efeitos secundários como a alteração do ph (SISLER & WOOD, 1988). O aumento da concentração de CO 2 reduz o ph do citosol, que influencia no aumento da atividade da ACC oxidase, aumentando significativamente a biossíntese de etileno (MIZUTANI et al. 1995), entretanto, concentrações muito elevadas de CO 2 inibem a síntese da enzima ACC sintase (GORNY & KADER, 1996, 1997). Rhothan & Nicolas (1994) demonstraram que a redução na taxa de produção de etileno em presença de CO 2 pode ser devido a um efeito sobre a 5

6 enzima ACC oxidase. Em peras, a produção de etileno foi estimulada em 1% de CO 2 e inibida de 5 a 20% (CHAVES-FRANCO & KADER, 1993). Provavelmente, no presente trabalho, não se obteve redução da produção de etileno com os diferentes níveis de CO 2 por todas as condições testadas estarem abaixo do limite de 5% referido pelos autores acima. Na prática, isso significa que se os recipientes permanecerem fechados por um tempo tal que não ultrapassem 5% de CO 2, não haverá prejuízo na avaliação da produção de etileno. Gráfico 02 - Produção de etileno em frutos de maçã Royal Gala em diferentes concentrações médias de CO2 aos 2, 4 e 6 dias a 20 C. 5. CONCLUSÃO A alta concentração de CO 2 nos recipientes afeta drasticamente a produção de CO 2 dos frutos, que pode ser em função da diminuição da respiração pela inibição de enzimas envolvidas no processo respiratório, a absorção de CO 2 pelo fruto ou por ambos os fatores. Dessa forma, se os recipientes permaneceram fechados por muito tempo antes da determinação da respiração, pode-se estar subestimando os valores reais. A produção de etileno não é afetada pelas diferentes concentrações de CO 2 utilizadas no presente trabalho. REFERÊNCIAS BRACKMANN, A. Einflub von Lagerung unter Kontrollierter Atmosphäre (CA) und Äthylenbehandlungen auf verschiedene Merkmale der Fruchtreife unter besonderer 6

7 Berücksichtigung der Aromabildung bei Äpfeln p. Tese (Doutorado em Ciências Agrárias) - Universidade de Hohenheim, Hohenheim BOWN, AW. CO2 and intracellular ph. Plant, Cell and Environment, v.8, p , BURG, S. P.; BURG, E. A. Molecular requirements for the biological activity of ethylene. Plant Physiology, v.42, p , CHAVES-FRANCO, S. H.; KADER, A. A. Effects of CO 2 on ethylene biosynthesis in Bartlett pears. Postharvest Biology and Technology, v.3, p , DONG, J. G.; FERNÁNDEZ-MACULET, J. C.; YANG, S. F. Purification and characterization of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase from apple fruit. National Academy of Sciences, USA 89, p , GORNY, J.R.; KADER, A.A. Controlled-atmosphere suppression of ACC synthase and ACC oxidase in Golden Delicious apples during long-term cold storage. Journal of the American Society for Horticultural Science, v.121, p , GORNY, J.R.; KADER, A.A. Low oxygen and elevated carbon dioxide atmospheres inhibit ethylene biosynthesis in preclimacteric and climacteric apple fruit. Journal of the American Society for Horticultural Science, v.122, p , KERBEL, E. L.; KADER, A. A.; ROMANI, R. J. Effects of elevated CO 2 concentration on glycolysis in intact Bartlet pear fruit. Plant Physiology, v.86, p , KUBO, Y, Inaba A, Nakamura R. Respiration and C2H4 production in various harvested crops held in CO2-enriched atmospheres. Journal of the American Society for Horticultural Science, v.115, p , LANGE, DL, Kader AA. Elevated carbon dioxide exposure alters intracellular ph and energy charge in avocado fruit tissue. Journal of the American Society for Horticultural Science, v.122, p ,

8 MIZUTANI, F.; DONG, J. G.; YANG, S. Effect of ph on CO 2 - activated 1- aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase activity from apple fruit. Phytochemistry, v. 39, n. 4, p , RHOTHAN, C.; NICOLAS, J. High CO 2 Physiologia Plantarum, v.92, p.1-8, levels reduce ethylene production in kiwifruits. SHIPWAY, M.R., BRAMLAGE, W.J. Effect of carbon dioxide on activity of apple mitochondria. Plant Physiology, v. 51, p , SISLER, E. C.; WOOD, C. Interaction of ethylene and CO 2. Physiologia Plantarum, v.73, p ,