DIFFERENCES IN CANINE ERYTHROCYTE OSMOTIC FRAGILITY USING SODIUM FLUORIDE/EDTA (NAF/EDTANA2) AND EDTA (EDTA K2) TUBES RESUMO

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1 DIFERENÇAS NA FRAGILIDADE OSMÓTICA DE ERITRÓCITOS CANINOS UTILIZANDO TUBOS DE COLETA CONTENDO FLUORETO DE SÓDIO/EDTA (NAF/EDTANA 2 ) E SOMENTE EDTA (EDTA K 2 ) DIFFERENCES IN CANINE ERYTHROCYTE OSMOTIC FRAGILITY USING SODIUM FLUORIDE/EDTA (NAF/EDTANA2) AND EDTA (EDTA K2) TUBES Vanessa Sinnott Esteves 1, Camila Serina Lasta 1, Luciana de Almeida Lacerda 1, Simone Tostes de Oliveira 1, Viviane Pedralli 2, Félix Hilário Diaz González 1. RESUMO O objetivo deste estudo foi verificar se os aditivos Fluoreto de Sódio/EDTA (NaF/ EDTA Na 2 ) e EDTA (EDTA K 2 ), normalmente utilizados na rotina laboratorial, promovem alterações na fragilidade osmótica eritrocitária de cães. Palavras-chave: hemólise, Fluoreto de Sódio/EDTA, EDTA, fragilidade osmótica, eritrócitos. ABSTRACT The objective of this study was to verify if the additives sodium fluoride/edta (NaF/EDTANa 2 ) and EDTA (EDTA K 2 ), usually used in laboratory routine, cause alterations in erythrocyte osmotic fragility of dogs. Key words: hemolysis, Sodium Fluoride/EDTA, EDTA, osmotic fragility, erythrocyte. 1. Médica Veterinária. UFRGS/LACVet, Porto Alegre RS. 2. Curso de graduação em Medicina Veterinária da UFRGS/LACVet.

2 135 Diferenças na fragilidade... INTRODUÇÃO Fragilidade osmótica eritrocitária (FOE) pode ser definida como a resistência dos eritrócitos à hemólise [5, 9, 11, 13, 15, 16]. Fornece uma boa estimativa da deformabilidade dos eritrócitos na corrente sangüínea, sendo uma valiosa ferramenta para detectar aumentos na fragilidade dos eritrócitos associada à hemólise [9, 11, 13, 15, 16]. Vários fatores intrínsecos e extrínsecos influenciam a fragilidade osmótica dos eritrócitos, ocorrendo diminuição ou aumento desta em condições diversas [5, 9,11, 15, 16]. Para determinação da glicose plasmática é sugerido o uso de um agente antiglicolítico a fim de evitar o consumo da mesma pelos eritrócitos [12]. Recomendava-se o uso de tubos contendo oxalato de potássio e fluoreto de sódio, devido às suas propriedades anticoagulante e antiglicolítica (inibidor enzimático), respectivamente [1, 2]. Porém, o oxalato de potássio e fluoreto de sódio, dependendo de suas concentrações, aumentam a suscetibilidade à hemólise durante o armazenamento devido ao processo de encolhimento, contração e ruptura da membrana eritrocitária, processos que resultam em diluição do plasma pelo citosol eritrocitário (liberado com o encolhimento ou lise celular) e, conseqüentemente, em concentrações de glicose falsamente diminuídas quando comparadas com amostras coletadas com outros aditivos [3, 6]. Atualmente tubos contendo o anticoagulante EDTA Na 2 (ácido etileno diamino tetracético dissódico) combinado ao fluoreto de sódio são os indicados para coleta de amostras com finalidade de determinar concentração de glicose em humanos [14]. O objetivo deste trabalho foi avaliar a FOE em amostras de sangue canino com os anticoagulantes/ aditivos EDTA K 2 (ácido etileno diamino tetracético dipotássico) e Fluoreto de Sódio/EDTA Na 2, a fim de comprovar se os resultados obtidos nos estudos utilizando humanos podem ser considerados também para os cães [1, 2]. MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizadas amostras de sangue de 10 cães adultos saudáveis pertencentes ao programa de cães doadores do LACVet (Laboratório de Análises Clínicas Veterinárias da UFRGS). Para avaliação da fragilidade osmótica eritrocitária o sangue foi coletado com EDTA K 2 (K 2 EDTA - BD Vacutainer ) e Fluoreto de Sódio/

3 Esteves, V.S. et al. 136 EDTA Na 2 (Sodium Fluoride/Na 2 EDTA - BD Vacutainer ). A técnica de fragilidade osmótica foi realizada de acordo como descrito por Dacie & Lewis [6, 7]. Foram misturados 25 µl de sangue a 2,5 ml de solução de NaCl nas seguintes concentrações: 0,9%, 0,7%, 0,5%, 0,3% e 0,1%. Após 30 minutos de incubação a temperatura ambiente e centrifugação a 350 g por 10 minutos, o sobrenadante foi lido (espectrofotometria) a 540 nm contra água deionizada. A solução de NaCl a 0,9% foi utilizada como controle negativo e a solução a 0,1% como controle positivo, concentração cujo grau de hemólise total foi obtido [6]. Esta técnica mensura a estabilidade dos eritrócitos em solução de cloreto de sódio em concentrações variáveis, permitindo definir três parâmetros: a) a resistência eritrocitária mínima, que representa a concentração em que se inicia a hemólise; b) a resistência máxima, ou seja, a concentração de NaCl correspondente à hemólise total (hemólise 100%); c) a fragilidade corpuscular média, correspondente à concentração de NaCl em que se observa 50% de hemólise [6, 7, 8]. As diferenças entre os graus de hemólise foram analisadas e comparadas pelo teste de comparação de médias de Student ou teste t a um nível de significância de 5%. RESULTADOS E DISCUSSÃO Avaliando as amostras de Fluoreto e EDTA em soluções de NaCl a 0,1% observou-se que apenas as concentrações de solução salina a 0,5% e a 0,7% apresentaram diferenças estatísticamente significativas no grau de hemólise (Tabela 2), sendo que as amostras com Fluoreto de Sódio/ EDTA Na 2 apresentaram maior grau de hemólise. A base de dados obtida está representada na Tabela 1.

4 137 Diferenças na fragilidade... Tabela 1 - Fragilidade Osmótica em eritrócitos caninos, comparando tubos de Fluoreto de Sódio/EDTA (NaF/EDTANa 2 ) e EDTAK 2 (ácido etileno diamino tetracético dipotássico) (Valores em absorbância). Solução de sangue e diferentes concentrações das Soluções de NaCl de 0,1 a 0,9%. Fluoreto EDTA Animais 0,1% 0,3% 0,5% 0,7% 0,9% 0,1% 0,3% 0,5% 0,7% 0,9% 1 1,347 1,379 0,061 0,016 0,007 1,32 1,299 0,041 0,004 0, ,362 1,446 0,335 0,015 0,015 1,29 1,344 0,196 0,005 0, ,551 1,539 0,33 0,019 0,013 1,355 1,523 0,149 0,012 0, ,515 1,307 0,187 0,007 0,009 1,661 1,407 0,115 0,002 0, ,319 1,452 0,211 0,009 0,005 1,246 1,485 0,113 0,007 0, ,285 1,299 0,281 0,007 0,016 1,284 1,062 0,161 0,005 0, ,507 1,526 0,144 0,005 0,006 1,481 1,505 0,082 0,003 0, ,39 1,376 0,686 0,007 0,016 1,592 1,264 0,456 0,005 0, ,623 1,334 0,281 0,008 0,013 1,512 1,598 0,192 0,004 0, ,553 1,544 0,09 0,008 0,007 1,46 1,23 0,079 0,006 0,008 Tabela 2 - Fragilidade Osmótica em eritrócitos caninos, comparando tubos de Fluoreto de Sódio/EDTA (NaF/EDTANa 2 ) e EDTAK 2 (ácido etileno diamino tetracético dipotássico) (Valores em absorbância). Solução de sangue e diferentes concentrações das Soluções de NaCl a 05 e 0,7%. Fluoreto EDTA Animais 0,5% 0,7% 0,5% 0,7% 1 0,061 0,016 0,041 0, ,335 0,015 0,196 0, ,33 0,019 0,149 0, ,187 0,007 0,115 0, ,211 0,009 0,113 0, ,281 0,007 0,161 0, ,144 0,005 0,082 0, ,686 0,007 0,456 0, ,281 0,008 0,192 0, ,09 0,008 0,079 0,006 As diferenças no grau de fragilidade celular promovida pelos anticoagulantes/ aditivos podem prejudicar as mensurações de alguns compostos sanguíneos, tendo em vista que os métodos rotineiramente utilizados para determinação de glicose são colorimétricos (espectrofotometria). Assim, há necessidade de estudos para verificar se o grau de hemólise é suficiente para alterar tais determinações.

5 Esteves, V.S. et al. 138 CONCLUSÃO De acordo com os dados obtidos no presente estudo, as amostras de sangue coletadas em tubos contendo Fluoreto de Sódio/ EDTA Na 2 apresentaram maior grau de hemólise do que aquelas com EDTA K 2. REFERÊNCIAS BD Vacutainer Systems\Preanalytical Solutions BD Vacutainer PLUS Sodium Floride/EDTA Tubes: Evaluation of Clotting, Hemolysis and Glucose at Initial Time of Collection and after 24 Hour Storage at Room Temperature When Compared to Glass Sodium Fluoride/Potassium Oxalate Tubes. Franklin Lakes. np. BD Vacutainer Systems\Preanalytical Solutions BD Vacutainer PLUS Sodium Floride/Potassium Oxalate Tubes: Evaluation of Clotting, Hemolysis and Glucose at Initial Time of Colletion and After 4 and 24 Hours Storage at Room Temperature When Compared to Glass Sodium Fluoride/Potassium Oxalate. Franklin Lakes. np BD Vacutainer Systems\Preanalytical Solutions BD Vacutainer PLUS Sodium Fluoride/EDTA Tubes: Evaluation of Glucose and Hemoglobin A1C at Initial Time of Collection and After 24 Hour Storage at 4 C. Franklin Lakes. np Bondan C., Soares J.C.M., Cecim M.S., Lopes S.T.A., Graça D.L. & Rocha R.X. Estresse oxidativo e resposta antioxidante em eritrócitos de bovinos intoxicados por Senecio spp. Disponível em: < 05/CarlosBondan.pdf>. Acessado em 12/12/06. Camiinhas M.M.T., Macedo M.P., Dias P.R. & Marquezini V. Caracterização do Tipo de Hemoglobina e da Fragilidade Osmótica do Eritrócito em Bovinos Tropical Leiteiro. Disponível em: <http: // nim%5csbz140.pdf>. Acessado em 12/12/06. Christopher, M. M., O Neill, S Effect of Specimen Collection and Storage on Blood Glucose and Lactate Concetrations in Healthy, Hyperthyroid and Diabetic Cats. Veterinary Clinical Pathology. 29: Comazzi S., Paltrinieri S., Spagnolo V. & Sartorelli P Some Aspects of Erythrocyte Metabolism in Insulin-Treated Diabetic Dogs. Research in Veterinary Science. 72:

6 139 Diferenças na fragilidade... Dacie J.V. & Lewis S.M., 1975, Practical Hematology. 5th Edition. Churchill Livingstone. London. 629 pp. Elias F., Lucas S.R.R., Hagiwara M.S., Kogika M.M. & Mirandola R.M.S Fragilidade Osmótica Eritrocitária em Gatos Acometidos por Hepatopatias e Gatos com Insuficiência Renal. Ciência Rural. 34: González F.H.D. & Silva S.C Introdução à Bioquímica Clínica Veterinária. Porto Alegre: editora da UFRGS, 198 p. Lippincott Williams Wilkins, Philadelphia,1344p, Coleta de Sangue Venoso. Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica Medicina Laboratorial. 1ª ed, São Paulo, 73 p Sant ana V.A.C., Birgel E.H., Mourão G.B. & Mirandola R.M.S Fragilidade Osmótica dos Eritrócitos de Bovinos das Raças Holandesa, Girolando e Gir, Criados no Estado de São Paulo. Ciência Rural, Santa Maria, v.31, n.4, p , Makinde M.O. & Bobade P.A Osmotic fragility of erythrocytes in clinically normal Dogs and dogs infected with parasites. Research in Veterinary Science. 57: Picheth, G., Jaworski, M. C. G., Pinto, A. P., Kikuti, M. Y., Acartezini, M., Acântara, V. M., Fadel-Picheth, C. M. T Plasma-fluoretado comparado ao soro na determinação da glicose sangüínea. Revista Brasileira de Análises Clínicas. 33: Santoro M.L., Kogika M.M., Hagiwara M.K., Mirándola, R.M.S. & Castelar, I.L.C.G Decreased Erythrocyte Osmotic Fragility During Canine Leptospirosis. Revista Inst. Med. Trop. São Paulo. 36: 1-5. Schalm's Veterinary Hematology, 5th edition, editors Feldman, Zinkl, Jain,