Acta Scientiae Veterinariae ISSN: Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Brasil

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1 Acta Scientiae Veterinariae ISSN: Universidade Federal do Rio Grande do Sul Brasil Leal de Araújo, Jeann; Medeiros Dantas, Antônio Flavio; Nogueira de Galiza, Glauco José; Ocampos Pedroso, Pedro Miguel; Rodrigues Silva, Maria Luana Cristiny; Pimentel, Luciano da Anunciação; Riet-Correa, Franklin Aspectos histopatológicos e imuno-histoquímicos da raiva em raposas Cerdocyon thous Acta Scientiae Veterinariae, vol. 42, 2014, pp. 1-6 Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre, Brasil Disponível em: Como citar este artigo Número completo Mais artigos Home da revista no Redalyc Sistema de Informação Científica Rede de Revistas Científicas da América Latina, Caribe, Espanha e Portugal Projeto acadêmico sem fins lucrativos desenvolvido no âmbito da iniciativa Acesso Aberto

2 Acta Scientiae Veterinariae, (Suppl 1): 67. CASE REPORT Pub. 67 ISSN Aspectos histopatológicos e imuno-histoquímicos da raiva em raposas Cerdocyon thous Histopathological and Immunohistochemical Aspects of Rabies in foxes Cerdocyon thous Jeann Leal de Araújo 1, Antônio Flavio Medeiros Dantas 1, Glauco José Nogueira de Galiza 2, Pedro Miguel Ocampos Pedroso 3, Maria Luana Cristiny Rodrigues Silva 1, Luciano da Anunciação Pimentel 4 & Franklin Riet-Correa 1 ABSTRACT Background: Several wild canids are considered reservoirs of rabies virus in the Northeast of Brazil, two wild canids have been reported as reservoirs of rabies virus Cerdocyon thous (crab-eating fox) and Pseudalopex vetulus (hoary fox) (previously called Dusicyon vetulus). The diagnosis of rabies in foxes is usually performed through fluorescent antibody test (FAT) and mouse inoculation test (MIT). However, until the moment, there are no detailed histopathological and immunohistochemical (IHC) description studies in foxes affected by this disease studies. Therefore, the aim of this work was the characterization of pathological and IHC findings of foxes with rabies sent to the Laboratory of Animal Pathology (LPA) of the Federal University of Campina Grande (UFCG) in Patos, semiarid region of Paraiba, Brazil. Case: Two foxes were sent to the LPA, phenotypic species identification through analysis of morphological aspects was performed and posteriorly necropsied. Fragments of organs of the thoracic and abdominal cavities, salivary glands, eye and Gasser ganglia were collected in addition to the central nervous system (CNS) that was collected integer and fixed at 10% buffered formalin. Later, serial sections of the 16 fragments of the CNS were performed, measuring about 0.5 cm thick and cleaved. Fragments of cerebrum, cerebellum, brainstem, spinal cord and salivary glands were sent to performing FAT and MIT. Paraffin blocks with fragments of the hippocampus were selected and submitted to IHC. Macroscopically, the two foxes had multiple skin lacerations, bone fractures and ruptures of abdominal organs from injuries. The vessels of the meninges were slightly congested. Histologically, the CNS had diffuse non-suppurative encephalitis, with inflammatory infiltrate composed primarily by lymphocytes and plasma cells, forming mononuclear perivascular cuffing, and gliosis associated with mild eosinophilic intracytoplasmic inclusion corpuscles primarily in neurons of the cortex, basal ganglia, hippocampus, thalamus, colliculi, bridge, obex and cerebellum. Meningitis and mild myelitis non-suppurative were also observed in both cases with rare viral inclusions in spinal cord neurons. Similar inflammation was also observed in the Gasser ganglion and in others peripheral nerve ganglia. Adrenal and salivary glands showed multifocal areas of moderate mononuclear inflammatory infiltrate composed mainly by macrophages and plasma cells. Strong positive IHC labeling was observed for rabies in the neurons in different brain regions, especially in the cerebral cortex and in Purkinje cells of the cerebellum. In both cases the diagnosis of rabies was confirmed by immunofluorescence and mouse inoculation. Discussion: The diagnosis of rabies in foxes was conducted through the characteristic histopathologic findings of the disease observed in the CNS and confirmed by the FAT, MIT and IHC. Although the histopathological findings in foxes are similar to what is observed in other species, the severity of inflammatory lesions and the large amount of inclusion bodies in the nervous tissue is an outstanding feature, regardless of the inflammatory response. The diagnosis of rabies in foxes can be achieved by characteristic histopathologic findings of the CNS, supported by evaluating peripheral nerve ganglia, salivary glands and adrenal which may also present similar microscopic lesions. Auxiliary Laboratory tests must be performed, such as FAT, MIT and IHC for confirmation of the disease. Keywords: wild animals, canids, Lyssavirus. Descritores: animais selvagens, canídeos, Lyssavirus. Received: 3 June 2014 Accepted: 16 August 2014 Published: 28 December Hospital Veterinário, Laboratório de Patologia Animal, CSTR, UFCG, Campus de Patos, PB, Brazil. 2 Laboratório de Patologia Veterinária, Departamento de Patologia, CCS, UFSM, Santa Maria, RS, Brazil. 3 Laboratório de Patologia Veterinária, CCA, UFRB, Cruz das Almas, BA, Brazil. 4 Universidade de Cuiabá, Cuiabá, MT, Brazil. CORRESPONDENCE: A.F.M. Dantas [dantas.af@uol.com.br - Tel.: +55 (83) ]. Hospital Veterinário, Laboratório de Patologia Animal, CSTR, UFCG, Campus de Patos. Avenida Universitária S/N, Santa Cecilia. CEP Patos, PB, Brazil. 1

3 INTRODUÇÃO Vários canídeos silvestres são considerados reservatórios do vírus rábico, a exemplo da raposa vermelha (Vulpes vulpes), distribuída mundialmente na Europa, América do Norte, norte da África e na Austrália [4]. No Brasil, o ciclo silvestre terrestre da raiva é representado principalmente por saguis (Callithrix jacchus) ou raposas (Cerdocyon thous). Na região Nordeste, dois canídeos silvestres já foram relatados como reservatórios do vírus rábico: C. thous (crab-eating fox, cachorro-do-mato) e Pseudalopex vetulus (hoary fox, raposa cinzenta) (previamente denominada Dusicyon vetulus) [3,6]. Existem relatos de casos de raposas com raiva e transmissão para humanos nos estados do Ceará, Paraíba, Pernambuco, Bahia e Minas Gerais [1,2] e dos 329 casos de raiva notificados no período de 2002 a 2009, cerca de 88% eram de canídeos silvestres, todos ocorridos na região Nordeste, onde muitos desses eram mantidos como animais de estimação. Segundo dados da Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS/MS) [13], no Brasil, os canídeos silvestres foram responsáveis por 7,9% dos 165 óbitos de humanos com raiva, no período de No Estado da Paraíba entre os anos de 2007 e 2010, foram notificados sete casos de raiva em cães e gatos, e cinco casos em canídeos silvestres [13]. Até o momento, não existem estudos detalhados de descrição histopatológica e imuno-histoquímica em raposas acometidas por essa doença, portanto, o objetivo do presente trabalho é a caracterização dos achados patológicos e imuno-histoquímicos de raposas com raiva encaminhadas ao Laboratório de Patologia Animal (LPA) da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG) em Patos, semiárido da Paraíba, Brasil. CASOS As raposas utilizadas foram encaminhas mortas para o LPA da UFCG, realizada a identificação fenotípica da espécie através da análise de aspectos morfológicos do animal com base no Guia de Identificação de Canídeos Brasileiros [10] e posteriormente necropsiadas. Foram coletados fragmentos de órgãos das cavidades torácica e abdominal, glândulas salivares, globo ocular e gânglio de Gasser, além do sistema nervoso central (SNC) que foi coletado e fixado em formol tamponado a 10%. Posteriormente foram realizados cortes seriados do encéfalo, medindo aproximadamente 2 0,5 cm de espessura e clivados 16 fragmentos do SNC identificados: 1) córtex frontal, 2) córtex parietal, 3) córtex temporal, 4) córtex occipital, 5) núcleos da base, 6) hipocampo, 7) tálamo, 8) colículo rostral, 9) colículo caudal, 10) pedúnculos cerebelar, 11) ponte, 12) óbex, 13) cerebelo, 14) medula cervical, 15) medula torácica e 16) medula lombar. Para a confecção das lâminas histológicas, os fragmentos clivados foram processados rotineiramente e coradas pela técnica de hematoxilina e eosina (HE). Seguindo protocolos estabelecidos previamente [5,8] foram realizadas as técnicas de imunofluorescência direta (IFD) e inoculação intracerebral em camundongos (ICC), respectivamente, em fragmentos do cérebro, cerebelo, tronco encefálico, medula espinhal e glândulas salivares das raposas foram enviados para a execução dessas técnicas. Blocos de parafina com fragmentos do hipocampo foram selecionados e submetidos à técnica de imuno-histoquímica para a detecção do vírus da raiva. Após desparafinizanação e reidratação dos tecidos, foi realizada recuperação antigênica com solução de citrato (ph 6,0) em forno micro-ondas, em potência máxima, por dez min. O anticorpo primário utilizado era policlonal para raiva produzido em cabras marcado com FITC (anticorpo conjugado de isotiocianato de fluorescência - Chemicon #5199) 1, diluído 1:1000 em solução tamponada fosfato salina (PBST) com Tween 20 (Sigma P2287) 2, e incubado por 60 min a 37Cº. O anticorpo secundário biotilinilado e o complexo estreptavidina-biotina-peroxidase (LSAB+System HRP)3 foram utilizados consecutivamente, incubados à temperatura ambiente por 30 min e marcados através da adição do DAB + Substrate - Choromogen System 3 e contra corados com hematoxilina de Harris. Como controle positivo foi utilizado secções histológicas de casos confirmados de raiva em bovinos. Como controle negativo, as mesmas secções foram utilizadas, com substituição do anticorpo primário por PBST. Esses casos ocorreram em anos distintos, sendo o primeiro em maio de 2010 e o segundo em abril de As duas raposas enviadas foram identificadas como pertencentes à espécie Cerdocyon thous. Segundo informações obtidas dos moradores da zona rural do Município de São José de Espinharas - PB, local onde os animais foram encontrados, as raposas foram atropeladas após terem sido vistas com sinais nervosos caracterizados por incoordenação, perda de equilíbrio,

4 acentuado balançar compulsivo da cabeça e aparente debilidade muscular. Macroscopicamente as duas raposas apresentavam múltiplas lacerações cutâneas, fraturas ósseas e rupturas de órgãos abdominais provenientes de traumatismos. Os vasos das leptomeninges estavam levemente congestos. Histologicamente verificou-se reação inflamatória mononuclear, principalmente no SNC, variando no grau de intensidade e sua localização (Tabela 1). Havia encefalite não supurativa, caracterizada pela presença de infiltrado inflamatório constituído principalmente por linfócitos e plasmócitos, formando manguitos perivasculares (Figura 1A), associada a discreta gliose e corpúsculos de inclusões eosinofílicos intracitoplasmáticos principalmente em neurônios dos córtices, núcleos da base, hipocampo (Figura 1B), tálamo, colículos, ponte, óbex e cerebelo. Meningomielite linfoplasmocitária discreta com raras inclusões virais em neurônios da medula espinhal também foram observadas nos dois casos. Inflamação semelhante também foi observada nos gânglios nervosos periféricos, glândulas salivares e adrenais dos dois casos. Havia infiltrado inflamatório principalmente de linfócitos e plasmócitos entre os feixes nervosos do gânglio de Gasser, caracterizando ganglioneurite não supurativa (Figura 1C), associada a raras inclusões virais intracitoplasmáticas em neurônios. Ganglioneurite não supurativa também foi observada no gânglio ciliar do primeiro caso. Infiltrado linfoplasmocitário também foi encontrado nas glândulas salivares (Figura 1D) e nas adrenais dos dois casos, característicos de adenite e adrenalite não supurativa. Corpúsculos de inclusões raramente foram verificados em agregados de neurônios distribuídos perifericamente a essas estruturas glandulares. No exame de IFD e na ICC o resultado foi positivo em todos os fragmentos testados para o vírus da raiva. Pela imuno-histoquímica os dois casos marcaram fortemente com anticorpos para o vírus rábico, demonstrando múltiplos agregados de grânulos distribuídos no pericário, como também na forma de corpúsculos grandes, únicos ou múltiplos no citoplasma de neurônios do córtex (Figura 2A) e ponte (Figura 2B). No controle negativo não foram observadas nenhum tipo de imunomarcação (Figura 2C). Tabela 1. Distribuição das lesões no SNC de raposas (Cerdocyon thous) com raiva de acordo com a intensidade da resposta inflamatória e presença de corpúsculos de Negri. CORTE REGIÃO DO SNC MENINGITE A1 * /A2** MANGUITOS A1*/A2** INCLUSÕES A1*/A2** 1 Córtex Frontal +/+ +/+ +++/++ 2 Córtex Parietal +/+ +/- ++/+ 3 Córtex Temporal +/+ ++/+ +++/+++ 4 Córtex Occipital +/+ +/- +/+ 5 Núcleos da base +/- +/- +++/++ 6 Hipocampo +/- ++/- +++/+++ 7 Tálamo +/+ ++/+ +++/+ 8 Colículo rostral +/- ++/+ +/+ 9 Colículo caudal +/- +/+ +/ Ponte +/- ++/+ +/+ 11 Quarto Ventrículo -/- +/+ ++/+ 12 Óbex +/- +/+ +/+ 13 Cerebelo ++/- +/- ++/- 14 Medula cervical -/- +/- -/- 15 Medula torácica -/- +/- -/+ 16 Medula lombar -/- ++/- +/+ *Animal 1. **Animal 2. -: Sem lesão. +: Lesão discreta. ++: Lesão moderada. +++: acentuada. 3

5 J.L. Araújo, A.F.M. Dantas, G.J.N. Galiza, et al Aspectos histopatológicos e imuno-histoquímicos da raiva em raposas Cerdocyon thous. Acta Scientiae Veterinariae. 42(Suppl 1): 67. Figura 1. Lesões histológicas de raposas (Cerdocyon thous) com raiva. (A) Córtex occipital mostrando manguitos mononucleares perivasculares e corpúsculos de Negri (seta) [HE, 10x]. (B) Hipocampo com múltiplos corpúsculos de Negri (setas) [HE, 20x]. (C) Gânglio trigêmeo com infiltrado inflamatório mononuclear [HE, 20x]. (D) Glândula salivar com inflamação não supurativa [HE, 20x]. Figura 2. Seções do encéfalo de raposas (Cerdocyon thous) com raiva, submetidas à técnica de imuno-histoquímica. (A) Córtex e (B) Tronco encefálico (ponte) mostrando múltiplos agregados de grânulos amarronzados distribuídos no pericário e prolongamentos citoplasmáticos de neurônios, caracterizando imunomarcação positiva para raiva. (C) Córtex. Controle negativo (sem anticorpo). Técnica de imuno-histoquímica método da estreptavidina-biotina-peroxidase (LSAB+System HRP) contracorados com Hematoxilina de Harris [Barra = 20 µm]. 4

6 DISCUSSÃO O diagnóstico da raiva em raposas foi realizado através dos achados histopatológicos característicos da doença, observados no SNC e confirmados pela IFD, ICC e IHQ. Apesar dos achados histopatológicos encontrados nas raposas serem semelhantes ao que são observados em outras espécies [14], a severidade das lesões inflamatórias e a grande quantidade de corpúsculos de inclusão no tecido nervoso é uma característica marcante, independente da resposta inflamatória. A inflamação não supurativa e a presença de inclusões observadas nos gânglios nervosos periféricos encontrados ao redor ou dentro do tecido das glândulas salivares e das adrenais, semelhantemente a reação inflamatória observada no SNC, podem auxiliar no diagnóstico dessa patologia, principalmente nos casos em que não são observadas inclusões no SNC. As glândulas salivares também tem sido um importante órgão para a realização do isolamento viral do Lyssavirus, já tendo sido encontrada positividade para raiva em glândulas salivares avaliadas por outros autores [11]. Diferentemente dos herbívoros, onde geralmente as principais lesões são cerebelares, os carnívoros tendem a apresentar lesões mais intensas na região de hipocampo, entretanto, de forma semelhante aos bovinos, pode haver áreas com pouca ou ausente reação inflamatória [14]. Um aspecto importante da análise histopatológica é a realização de cortes seriados do sistema nervoso central, uma vez que a localização e intensidade das lesões podem variar entre as regiões do SNC, não havendo uma uniformidade. A forte marcação nos neurônios do hipocampo no presente trabalho através da imuno-histoquímica, difere dos achados de Stein et al. [12] que encontraram uma marcação moderada no hipocampo de raposas da espécie Urocyon cinereoargenteus e Vulpes vulpes. Apesar das implicações legais, muitas pessoas tem o hábito de criar raposas e outros animais silvestres no Nordeste brasileiro. Essa tradição aumenta significativamente o risco de transmissão da raiva para humanos e outros animais. No ano de 2012, duas pessoas morreram no Nordeste vítimas de raiva transmitidas por animais silvestres [13]. No Estado da Paraíba, a raposa tem sido o animal silvestre com maior número de agressões contra humanos, havendo no período de 2000 a 2003, cerca de 24 casos de agressões em humanos por raposas [7]. 5 Propõe-se que a ocorrência de raiva em herbívoros nos Estados da Paraíba e Pernambuco é causada principalmente por uma variante do vírus chamada de RABV, relacionada a morcegos hematófagos e que ela está circulante nessa área do Nordeste por pelo menos sete anos, isolada por barreiras geográficas [9]. Sugere-se ainda, a presença de duas ramificações de Lyssavirus na região da Paraíba, sendo uma associada com quirópteros e outra com carnívoros. Entretanto, existe uma variabilidade genética nessas ramificações, subdividindo o grupo de quirópteros em morcegos insetívoros e morcegos hematófagos, e o grupo dos carnívoros em cão, raposa 1 e raposa 2 (está mais próxima do grupo cão ) [7]. Essa existência de variabilidade entre as ramificações das variantes do vírus rábico sugere que pelo menos dois grupos de vírus coexistem na mesma região e apesar de somente a variante de morcegos hematófagos ter sido incriminada como causadora da raiva em herbívoros, a criação de animais silvestres como animais de estimação no Nordeste favorece o risco de transmissão da doença para os animais de produção, sugerindo um papel importante das raposas nesse cenário. A presença da variabilidade genética das variantes de raposas, sugerem que estes animais tem um papel muito mais importante na manutenção e disseminação da raiva no Brasil do que antes se pensava, tendo uma implicação de saúde pública significante já que nessa região o monitoramento desses animais é muitas vezes ineficiente ou ausente, e a prática da vacinação de animais silvestres não tem sido empregada no país [2]. O diagnóstico da raiva em raposas pode ser realizado pelos achados histopatológicos característicos do SNC, auxiliado pela avaliação dos gânglios nervosos periféricos, glândulas salivares e adrenais que também podem apresentar lesões microscópicas semelhantes. Em adição os exames laboratoriais auxiliares devem ser realizados, como IFD, ICC e IHQ para a confirmação da doença. MANUFACTURERS 1 Chemicon International Inc. Temecula, CA, USA. 2 Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA. 3 Dako Cytomation. Carpinteria, CA, USA. Declaration of interest. The authors report no conflicts of interest. The authors alone are responsible for the content and writing of the paper.

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