Foto 9: Canteiro de obra da construção do gasoduto.

Transcrição

1 exigindo um esforço de logística, na medida em que nestes trechos tiveram que ser mobilizados de uma só vez até funcionários, além da mobilização imediata de uma grande frota de veículos e máquinas 22 (Foto 8). Em Mato Grosso do Sul, o gasoduto Bolívia - Brasil chegou no território brasileiro através da cidade de Corumbá, atravessando então 15 municípios do Estado, inclusive Campo Grande, numa extensão total de 702 quilômetros. Nos municípios com instalação de canteiros de obra por períodos não inferiores a dois anos, foi sempre registrada intensa movimentação de veículos e indivíduos, em média de 150 veículos / dia e, em cada canteiro funcionários que chegavam pela manhã e retornavam aos à tarde para cidade mais próxima ou permaneciam nos canteiros (Foto 9) Foto 9: Canteiro de obra da construção do gasoduto. A avaliação do traçado mais favorável do gasoduto no Estado de Mato Grosso do Sul levou em conta a necessidade de aproximá-lo dos centros consumidores potenciais e a preocupação com a preservação ambiental. Pelo fato de contar com um dos mais ricos ecossistemas do País, Mato Grosso do Sul recebeu particular atenção quando da definição do melhor trajeto para a construção do gasoduto. Assim, considerou-se que o 49

2 traçado do gasoduto deveria acompanhar a mesma rota e linha da estrada rodoviária BR-262, no trecho que liga Corumbá a Três Lagoas 22. Pelas informações anteriores fica evidenciado que o gasoduto se desenvolveu e avançou numa velocidade extremamente mais rápida que a ferrovia e a rodovia BR 262 e, o sentido da construção foi oeste para o leste, da Bolívia, em Santa Cruz de La Sierra para o Brasil, Corumbá, Campo Grande e Três Lagoas em Mato Grosso do Sul, seguindo daí para o Estado de São Paulo, inicialmente pelo município de Castilho e, caminhando até Campinas. Por coincidência as três grandes obras acima citadas cortaram transversalmente o Estado de Mato Grosso do Sul, não se esquecendo que tanto a Ferrovia como a BR foi construída de leste-oeste e o Gasoduto Bolívia - Brasil oeste para leste. (Figura 4). A hipótese de a LVA endêmica em Corumbá tenha se disseminando para os outros municípios, por coincidência na mesma rota da construção do gasoduto e reforçando as epidemias que ocorreram a partir 1999 nas cidades também coincide com a localização dos canteiros de obras. 50

3 Fonte: Ministério dos Transportes e Petrobrás, Figura 4 - MAPA DE MATO GROSSO DO SUL, COM TRAJETO DA FERROVIA, BR 262 E GASODUTO. 51

4 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVOS GERAIS Caracterizar a ecoepidemiologia e a disseminação da Leishmaniose Visceral Americana (LVA), no Estado de Mato Grosso do Sul, com ênfase na sua distribuição nos municípios de Corumbá, Campo Grande e Três Lagoas, com registros espaciais dos dados descritivos, por meio de técnicas de geoprocessamento. Estudar a Leishmaniose Visceral Canina (LVcanina) no município de Campo Grande em seus aspectos espaciais e de diagnóstico. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Descrever a evolução das notificações e expansão da LVA autóctone no Estado de Mato Grosso do Sul, no período de 1994 a 2003; Estudar a prevalência da doença na população humana nos municípios de Corumbá, Campo Grande e Três Lagoas, nos últimos 5 anos, ; Coletar dados sobre a distribuição dos casos LVA, nos municípios de Corumbá, Campo Grande e Três Lagoas, no período de 1999 a 2003, segundo o provável local de infecção, local de residência, sexo e idade. 52

5 Estudar a correlação entre os registros da Leishmaniose Visceral humana (LVA) e da Leishmaniose Visceral canina (LVc) no município de Campo Grande, no período de 2002 a 2003; Analisar criticamente o diagnóstico da LV canina no município de Campo Grande, avaliando-se a correlação, a concordância e o índice Kappa de diferentes metodologias diagnósticas, Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), Ensaio Imunoenzimático (EIE), Teste Rápido com utilização de antígeno recombinante K39 (rk39), cultura de aspirado de baço e DNA; Avaliar a viabilidade de utilização de diferentes técnicas diagnósticas em Saúde Pública, no Programa de Controle da LVcanina; Estudar a etiologia da LVcanina em Campo Grande, no Estado de Mato Grosso do Sul; Propor, juntamente com as autoridades municipais responsáveis pelas ações de saúde e de geração e divulgação do conhecimento, bem como, com as lideranças comunitárias, uma política de intervenção para leishmaniose visceral alicerçada nos diagnósticos laboratoriais conclusivos. Caracterizar a disseminação e as possíveis rotas de expansão da LVA, em Mato Grosso do Sul, a partir dos municípios de Corumbá, Campo Grande, Três Lagoas, até a divisa do Estado de São Paulo. 53

6 4 JUSTIFICATICA / RELEVÂNCIA Em Mato Grosso do Sul (MS), a presença de LVA é registrada nos municípios de Corumbá e de Ladário, desde o início da década de 1980 com disseminação para o leste do Estado, nos últimos anos, municípios de Dois Irmãos do Buriti, Bodoquena, Miranda, Aquidauana, Anastácio, Antônio João, Bela Vista Terenos, Rio Verde, Três Lagoas, Bonito e Campo Grande 93,15,16,17,18,19. Registro de expressivos números de cães infectados que foram sacrificados em 2001, nas cidades de Campo Grande, 67 (2,27%), Corumbá, 537 (8,19 %) e Três Lagoas 153, (19,76%), com reação positiva, por imunofluorescência indireta 2. Em decorrência de a LVA ter adquirido, na atualidade, nova dimensão como infecção oportunista, como já havia ocorrido com a leishmania tegumentar e das mais graves quando associada à síndrome de imunodeficiência adquirida (aids) pelo HIV, síndrome esta em expansão para populações de áreas endêmicas dessa protozoose ou, que as visitam 43,47,116,76,138,34,36. Registro de presença de cães infectados em 44 dos 77 municípios do Estado de Mato Grosso do Sul (ANEXO 1), necessidades de diagnóstico precoce e tratamento específico para diminuir a letalidade por LVA. Necessidade urgente de estudos sobre métodos e técnicas sorológicas, altamente específicas e sensíveis para a obtenção de resultados que permitam diagnósticos laboratoriais mais rápidos e confiáveis. 2 Números fornecidos pelo Centro de Zoonose de cada município no ano de

7 Disseminação, a partir de 1998, com casos humanos em diferentes regiões do Estado, culminando com a epidemia em Campo Grande e Três Lagoas, e com alta taxa de letalidade 125,123,

8 5 MATERIAIS E MÉTODOS 5.1 ÁREAS DE ESTUDO Os estudos foram realizados, a partir de levantamentos e mapeamentos de todos os casos humanos confirmados nas cidades de Corumbá, Campo Grande e Três Lagoas no intervalo de 05 anos, do período de 1999 a 2003, (Tabela 1). Figura 5: Mapa de Mato Grosso do Sul, com a localização dos municípios incluídos no presente estudo para o georreferenciamento dos casos confirmados de Leishmaniose Visceral Americana. 56

9 5.1.1 CORUMBÁ Município situado a oeste do Estado, FIGURA 4, com uma população de habitantes, (IBGE, 2000), sendo que 92% dela está na zona urbana. A sede do município está a W e S e altitude de 103 metros, faz fronteira com a Bolívia, sendo limítrofe com os municípios de Sonora, Coxim, Rio Verde de Mato Grosso, Aquidauana, Bodoquena e Porto Murtinho. O Município de Corumbá tem 100% de seu território na planície do Pantanal. Área: ,9 Km 2 (18,19% do território do Estado), dista 415 Km da capital, o Município de Campo Grande 62 (Fotos 10, 11,12 e 13). Foto 10: Sopé do Morro Cristo, Município de Corumbá, foco de transmissão natural de LVA em Mato Grosso do Sul, Brasil. Foto 11: Morro Cristo Redentor, Município de Corumbá, foco de transmissão natural de LVA em Mato Grosso do Sul, Brasil. Foto 12: Morro Cristo Redentor, Município de Corumbá, Mato Grosso do Sul, no horizonte vê-se o território da Bolívia. Foto 13: Município de Corumbá, Mato Grosso do Sul apresentando paisagem típica de áreas de transmissão de LVA, córrego (umidade), matéria orgânica e lixo. 57

10 Histórico do Município de Corumbá Após a fundação do presídio de Nova Coimbra, em 13 de setembro de 1775, o governador Luiz de Albuquerque e Cárceres, determinaram que João Leme do Prado encontrasse ao longo do rio Paraguai, local que servissem a construção de um segundo presídio. O local foi definido em 31 de agosto de 1778, e ali, juntamente com diversas famílias, dando início a uma nova população. A ata de fundação foi lavrada em 21 de setembro de 1778, com a denominação de Albuquerque. Foi elevada a condição de distrito pela Lei N. º 04, de 19 de abril de 1838 e a município pela Lei N. º 712, de 05 de julho de No dia 21 de setembro é comemorado o seu aniversário e, no dia 13 de junho a retomada do território de Corumbá do Paraguai CAMPO GRANDE Capital do Estado de Mato Grosso do Sul, FIGURA 4, desde 1977, com uma área de Km 2, localiza-se na parte central do Estado, nas imediações do divisor de águas das bacias dos rios Paraná e Paraguai, com coordenadas geográficas 20º26 34 latitude Sul e 54º38 47 longitude Oeste e com altitude média de 532 metros 62 (Fotos 14, 15, 16 e 17). Foto 14 e 15: Horto Florestal, Região Central do Município de Campo Grande, área com foco de transmissão natural de LVA em Mato Grosso do Sul, Brasil. 58

11 Fotos 16 e 17: Confluência dos Córregos Segredo e Prosa, Região Central do Município de Campo Grande, área com foco de transmissão natural de LVA em Mato Grosso do Sul, Brasil. Segundo estimativa do IBGE, a população Campo Grandense atingiu um total de habitantes, sendo que estão na zona urbana, com uma taxa de alfabetização de 94,6% 63. A média mensal da umidade relativa do ar no ano 2001 variou de 49% em agosto a 79% no mês de fevereiro, e a média anual foi de 70% 63. A temperatura média mensal do ar em 2001 foi de 23,29ºC sendo o mês de janeiro o mais quente com uma média mensal de 25,09ºC; junho foi o mês mais frio, com 18,19ºC em média 63. No período compreendido entre os censos de 1970 e 2000, a população multiplicou-se por quase quatro vezes, entretanto, mais recentemente, tem sido observada a diminuição deste crescimento em decorrência da redução dos níveis de fecundidade e diminuição do fluxo migratório. O Município de Campo Grande apresenta alto grau de urbanização; a população urbana no ano 2000 representava 98,84 % e a rural, 1,16%. Em relação ao Estado de Mato Grosso do Sul, a participação da população do município é elevada, em 2000 chegou a 31,94%, isto é, para cada 100 habitantes do Estado, 32 residem em Campo Grande. No 59

12 contexto nacional, Campo Grande é o 23º município em tamanho populacional 104. Com a criação do Fundo Municipal de Saúde CMS, o município pode arcar com o funcionamento de seu sistema de saúde, tanto em relação aos recursos físicos como para os recursos financeiros e, isto em cumprimento das normas constitucionais referentes à implantação do SUS. O crescimento de Campo Grande, com base nas diferenças e semelhanças populacionais, epidemiológicas e sanitárias de cada região impôs a distritalização da cidade. Para o melhor planejamento das ações de saúde, no início do ano de 1999, passou a ser utilizada uma nova divisão, a mesma é usada pelo censo, a qual foi regulamentada pelo Decreto de 11 de novembro de , que fornece a base populacional e permite traçar o perfil epidemiológico dos distritos e seus setores 123. O Município de Campo Grande é gestor pleno da saúde desde 1996 e gerencia todas as suas unidades além daquelas credenciadas pelo Sistema Único de Saúde - SUS e sediadas na capital. Histórico do Município de Campo Grande Na história de Campo Grande são destacados três vultos: João Nepomuceno e os mineiros José Antônio Pereira e Manoel Vieira de Souza. A José Antônio Pereira são dadas as honras de fundador da cidade, pois ele e sua comitiva acamparam, em 21/06/1872, em um local que denominaram Mato Cortado, onde hoje se encontra o Horto Florestal. Foi elevada a distrito pela Lei Nº. 793, de e o município criado pela resolução 60

13 estadual 255, de Em , com a criação do Estado de Mato Grosso do Sul, tornou-se a capital do mesmo. O seu aniversário é comemorado dia 26 de agosto TRÊS LAGOAS Este município está situado a leste do Estado, com uma população de habitantes 62, sendo 94% residentes na zona urbana. A sede do município tem coordenadas W e S, com altitude média de 319 metros, faz fronteira com o Estado de São Paulo, e limítrofes com os municípios de Selvíria, Inocência, Água Clara e Brasilândia. Sua área é de ,8 km 2 (representa 2,86% do Estado) e dista da Capital 313 km 122 (Fotos 18, 19, 20 e 21). Fotos 18 e 19: Região Central do Município de Três Lagoas, área com foco de transmissão natural de LVA em Mato Grosso do Sul, Brasil. A direita localiza-se uma reserva natural sob responsabilidade do Exército Brasileiro, com aproximadamente 10 hectares. 61

14 Foto 20 e 21: Região da Vila Ferroviária, no Município de Três Lagoas, área com foco de transmissão natural de LVA em Mato Grosso o Sul, Brasil. Histórico do Município de Três Lagoas Em 1887 chegaram à região, Protázio Garcia Leal e Antônio Trajano dos Santos. Protázio instalou-se na região de Piaba e Antônio na que chamou de Fazenda das Alagoas. Em 1909, um grupo de engenheiros estabeleceu um acampamento à margem da Lagoa Maior. Em 1911, na região do acampamento foram construídas inúmeras moradias, alicerçando um novo povoado. Foi elevada a distrito pela Lei N. º656 de 12 de junho de 1914 e o município criado pela Lei N. º 706 de 15 de junho de Comemora-se, no dia 15 junho sua emancipação política INFORMAÇÕES SOBRE O REGISTRO DE CASOS DE LEISHMANIOSE VISCERAL AMERICANA NO SISTEMA NACIONAL DEAGRAVOS NOTIFICÁVEIS (SINAN). Foram analisadas as fichas de Investigação Epidemiológica das Secretarias Municipais de Saúde de Corumbá, Campo Grande e Três Lagoas, levantando informações que permitiram identificar o local provável da transmissão do parasita. 62

15 Para o período proposto no estudo, 1999 a 2003, foram confirmados 78 casos de LVA em Corumbá, 130 em Campo Grande e 170 em Três Lagoas 123,124,125. Nas fichas epidemiológicas do SINAN, são registrados os locais prováveis de infecção, residência, sexo e idade de cada paciente. Estas variáveis para o período de 1999 a 2003 foram obtidas das fichas epidemiológicas do SINAN municipal. 5.3 DISTRIBUIÇÃO ESPACIAL DOS CASOS DE LEISHMANIOSE VISCERAL AMERICANA NOS MUNICÍPIOS DE CORUMBÁ, CAMPO GRANDE E TRÊS LAGOAS NO ESTADO DE MATO GROSSO DO SUL, BRASIL, MATERIAIS Para a interpretação dos dados e informações espaciais (georreferenciadas), descritivas e espaciais obtidas, foram utilizados os seguintes materiais: Para o banco de dados de campo, o programa Excel (MICROSOFT, 2003). Construção de os arquivos gráficos, o Excel (MICROSOFT, 2000). Imagens de satélite CBERS-2 (China Brazil Earth Resources Satellite),sensor CCD de Equipamento GPS (Geographic Positioning System - Sistema de Posicionamento Global) de navegação (marca Garmin, modelo GPS 72, com acurácia de até 20m). 63

16 Geomorena: fotografias aéreas digitais georreferenciadas de Campo Grande 104. Para o processamento digital de imagens digitais de satélite foi utilizado o Programa ERDAS IMAGINE 45. Para o Sistema de Informação Geográfica e construção das bases cartográficas digitais, os programas Macromedia FreeHand 81 e Avenza Mapublisher 6,7, MÉTODOS Para a interpretação dos dados e informações espaciais obtidas (descritivas e espaciais), foram cumpridas as seguintes etapas: De posse das fichas epidemiológicas dos casos confirmados de LVA 123,124,126 por municípios, a fim de serem obtidas as informações diversas, como o sexo, faixa etária e endereçamento postal, para a inclusão no banco de dados descritivo construído em Microsoft Excel (Microsoft, 2003). As coordenadas geográficas (informações espaciais - latitude e longitude) foram obtidas através de visitas aos locais indicados nas fichas epidemiológicas dos pacientes como sendo os locais prováveis de transmissão da doença. Em Corumbá e Três Lagoas as coordenadas foram obtidas com auxílio do equipamento GPS - Geographic Positioning System de navegação (com acurácia adequada à escala de trabalho). Em Campo Grande estas coordenadas foram obtidas da base digital da PLANURB conhecida como Geomorena 104, que também possui a acurácia necessária ao trabalho. O erro máximo de acurácia aceito neste trabalho foi de 20m, 64

17 compatível, de acordo com a legislação federal, com mapeamentos na escala 1: Para locação dos dados descritivos e espaciais dos locais prováveis de transmissão de LVA nos três municípios, e devido à falta de uma base cartográfica atualizada, esta foi construída com imagens do satélite CBERS-2 (China Brazil Earth Resources Satellite) sensor CCD, de 2005, com resolução espacial de 20m, fornecendo assim informações atualizadas da cobertura do solo nas áreas estudadas. Primeiramente, as imagens foram georreferenciadas com apoio de imagens do satélite Landsat 7 ETM+, disponíveis no laboratório de Geoprocessamento para Aplicações Ambientais do Departamento de Hidráulica e Transportes da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. Estas imagens foram recortadas, de modo a apresentarem a área urbana dos municípios de interesse. O processamento digital das imagens de satélite foi realizado em Erdas Imagine 45. Para o Município de Campo Grande, foi tomado um recorte da cena CBERS-2 órbita-ponto, sensor CCD, , de 25 de setembro de ; para o Município de Corumbá, um recorte da cena de 25 de setembro de e, para Três Lagoas, um recorte da cena de 25 de setembro de Para realizar de maneira simples a análise da distribuição dos casos da LVA, os pontos de ocorrência da doença foram lançados sobre a base cartográfica elaborada para cada cidade. Para tanto, as imagens foram registradas no programa Avenza Mapublisher 6 e então os pontos de ocorrência de LVA foram plotados sobre as cartas, com base nas suas coordenadas de terreno. 65

18 As inter-relações dos dados descritivos e dados espaciais de cada um dos locais de ocorrência da doença, referenciados e analisados sobre as bases cartográficas criadas para cada município, possibilitaram a geração dos diferentes mapas temáticos apresentados nesta tese. De posse das fichas epidemiológicas dos casos notificados de LVA, por municípios, foram realizadas visitas aos locais de moradia dos pacientes, a fim de serem obtidas as informações diversas para a inclusão no banco de dados descritivo construído em Microsoft Excel, além, é claro, das informações de endereçamento postal. As coordenadas geográficas (informações espaciais - latitude e longitude) dos locais prováveis de transmissão da doença em Corumbá e Três Lagoas foram obtidas com auxílio de aparelho GPS - Geographic Positioning System. Garmin GPS 72 de navegação. Em Campo Grande as coordenadas foram obtidas da base digital da PLANURB 104,106. De posse dos dados descritivos e espaciais dos locais prováveis de transmissão de LVA nos três municípios foi construída uma base cartográfica digital, com imagens China Brazil Earth Resources Satellite (CBERS). As inter-relações dos dados descritivos e dados espaciais de cada um dos locais de ocorrência da doença, referenciados e analisados sobre esta base cartográfica, possibilitaram a geração de diferentes mapas temáticos. 5.4 DISTRIBUIÇÃO ESPACIAL DOS CASOS DE LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA E HUMANA NO MUNICÍPIO DE CAMPO GRANDE ESTADO DE MATO GROSSO DO SUL, BRASIL, Para verificar a correlação entre LVcanina e LVA, utilizou-se dos dados dos cães positivos por bairro fornecidos pelo Centro de Controle de Zoonoses e os dados do SINAN por local provável de infecção da 66

19 Secretaria Municipal de Campo Grande. Para a distribuição espacial foram utilizados tantos dados de LVcanina e LVA, estes dados foram distribuídos sobre a malha dos bairros de Campo Grande. 5.5 LEISHMANIOSE VISCERAL AMERICANA E PRECIPITAÇÃO PLUVIOMÉTRICA (mm) NO MUNICÍPIO DE CAMPO GRANDE, ESTADO DE MATO GROSSO DO SUL, BRASIL, Os casos de LVA, fornecidos pela Secretaria de Saúde Municipal Campo Grande foram inseridos em uma planilha eletrônica Excel (Microsoft, 2004), sendo separados por semanas epidemiológicas. Em seguida, foram gerados os gráficos de número de casos por semanas epidemiológicas (no eixo das abscissas), para o ano de 2002 e Para o gráfico de precipitação pluviométrica, primeiro, na página do Agritempo, 2004, foram acessados os dados da estação de Campo Grande, MS, com as precipitações (em mm) do primeiro dia da primeira semana epidemiológica ate o último dia da última semana, nos anos de 2002 e Os dados fornecidos pelo site são em dias. Por isso, para serem relacionados com as informações dos casos de LVA, esses dias foram encaixados em sua respectiva semana epidemiológica, ficando os dois gráficos com a mesma unidade no eixo das abscissas. Após essa etapa, através de recursos de edição gráfica, os gráficos foram ajustados para igualar a escala no eixo da horizontal e em seguida serem sobrepostos. 67

20 5.6 LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA (LVcanina) DO MUNICÍPIO DE CAMPO GRANDE, MATO GROSSO DO SUL, BRASIL, 2004 Cães - No total foram examinados 155 animais recolhidos no Centro de Zoonose de Campo Grande no Estado de Mato Grosso do Sul, com ou sem prévio diagnóstico de LV Canina Coleta de amostras biológicas Imediatamente após o registro de identificação de caracteres individuais de sexo, raça, tamanho de pêlo e avaliação clínica, procedeu-se à sedação/anestesia (Tiopental sódico 1 mg, CRISTALIA ) do animal, para diagnóstico da LV Canina, sendo coletadas: I - Amostra de sangue total; II - Amostra de sangue em papel de filtro; III - Amostra de sangue em tubo seco para obtenção de soro sangüíneo. Eutanásia No total de 133 cães com diagnóstico prévio para LVC e/ou quadro clínico compatível, foram submetidos à eutanásia pela aplicação de cloreto de potássio após a tranqüilização e sedação profunda com Tiopental sódico 1 mg, CRISTALIA ; Necropsia - Imediatamente após a eutanásia, os cães foram examinados em necropsia, ocasião em que foram registrados os eventuais achados clínicos macroscópicos de alterações de órgãos internos de cada animal examinado; 68

21 Diagnóstico parasitológico - Durante a necropsia, foram coletados: Aspirado e fragmento de baço de cada animal, sendo o primeiro destinado ao isolamento de Leishmania spp, e o segundo congelado para posterior extração de DNA para a realização de diagnóstico molecular. Isolamento de Leishmania spp - As 133 amostras de aspirado de baço colhido dos cães necropsiados foram semeadas em meio bifásico acelular de cultura (BAB-Blood Agar base como fase sólida e BHI - brain heart infusion, com 5% de urina estéril humana como fase líquida), atividade realizada nas dependências do Laboratório Central de Saúde Pública do Estado de Mato Grosso do Sul, LACEN/MS. Das 133 amostras acima referidas foram selecionadas, ao acaso, 50 para a inoculação, pela via intraperitoneal, em modelo experimental hamster (Cricetus auratus), para posterior isolamento em meio bifásico acelular de cultura, como descrito anteriormente; Detecção de anticorpos anti-leishmania spp. - Amostras de sangue e soro sangüíneo dos cães incluídos no estudo foram examinadas para o diagnóstico da LVC, pela realização de Reação de imunofluorescência indireta - RIFI (Kit Bio Manguinhos /FIOCRUZ), pelo Ensaio imunoenzimático - ELISA (Kit EIE Bio Manguinhos /FIOCRUZ) e pelo Teste rápido Kalazar Detect TM rk39 (InBios, USA), este último sendo realizado no momento da coleta com µl de sangue total. Os resultados foram anotados em planilhas especialmente elaboradas para esse fim (APÊNDICE A). Para a realização das reações RIFI e ELISA, as amostras de sangue colhidas ficaram em repouso para retração do coágulo, por tempo variável, sendo então centrifugadas a rpm, por cinco minutos, para 69

22 obtenção do soro. As amostras de soros ficaram armazenadas em congelador à - 20ºC, até serem levadas para o Instituto Adolfo Lutz, Seção de Parasitoses Sistêmicas, em São Paulo, onde foram realizadas essas reações para detecção de anticorpos anti-leishmania. (ANEXO 2) Análise do Diagnóstico da LVC em Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil, 2004 A partir dos resultados dos testes para a detecção de anticorpos anti-leishmania, foi possível analisar a concordância e discordância, bem como o Índice Kappa, para os diferentes procedimentos técnicos utilizados para o diagnóstico da Leishmaniose Visceral em cães de Campo Grande, Mato Grosso do Sul, foram calculados baseados em uma tabela 2 x 2 (ANEXO 3) Diagnóstico Etiológico da Leishmaniose Visceral Canina no Município de Campo Grande, Estado de Mato Grosso do Sul, 2004 Ao final da realização dos procedimentos diagnósticos, considerados os 133 cães submetidos à eutanásia e necropsia, foi possível a constituição de oito diferentes grupos de animais* considerando-se a concordância e a discordância dos resultados dos testes para a detecção de anticorpos anti-leishmania (rk39 sangue total e RIFI soro sangüíneo, considerado como o teste de referência) e, para isolamento do agente etiológico (cultivo em meios acelulares e inoculações em hamsteres): I rk39 (+) / RIFI (+) / Isolamento (+) = 38 animais; II - rk39 (+) / RIFI (+) / Isolamento (-) = 32 animais; III - rk39 (+) / RIFI (-) / Isolamento (+) = 03 animais; IV rk39 (+) / RIFI (-) / Isolamento (-) = 05 animais; 70

23 V - rk39 (-) / RIFI (+) / Isolamento (+) = 03 animais; VI rk39 (-) / RIFI (-) / Isolamento (+) = 03 animais; VII rk39 (-) / RIFI (+) / Isolamento (-) = 04 animais; VIII rk39 (-) / RIFI (-) / Isolamento (-) = 43 animais. (*): Excluídos dois cães cujas culturas foram desprezadas por apresentarem contaminação bacteriana e fúngica. Para cada um destes grupos foram selecionados alguns ou todos os animais, de acordo com o tamanho do grupo, para a realização de extração de DNA de fragmento de baço (anteriormente coletados e congelados) e reação em cadeia da polimerase, com a utilização de primers gênero-específico (Leishmania spp.) e espécie-específico (L.L. chagasi= L.L.donovani sensu lato) e complexo-específico (L. braziliensis) (Invitrogen,São Paulo, Brasil). No total foram incluídos 33 cães para a realização do diagnóstico etiológico. Especial atenção foi dada para aquelas situações em que foi obtido sucesso no isolamento de Leishmania, confirmando a presença da infecção, porém o teste rápido (rk39) e/ou a RIFI foram negativos (Grupos III, V,e VI). Para estes grupos todas as amostras foram processadas para o diagnóstico etiológico. O mesmo sendo considerado para as situações de discordância entre os resultados para a detecção de anticorpos anti-leishmania (Grupos IV e VII), quando a maioria das amostras foi processada. Tabela 2 - RELAÇÃO DOS GRUPOS DE CÃES SELECIONADOS PARA O DIAGNOSTICO ETIOLÓGICO PELA PCR. TOTAL DE AMOSTRAS PARA % GRUPO CÃES PCR* I ,4 II ,5 III IV V VI VII VII ,6 * Reação da polimerase em cadeia. 71

24 Extração de DNA A partir de fragmento das amostras de baço de cada um dos 33 cães citados foi realizada a extração do DNA. Cada amostra foi triturada em presença de tampão de lise, contendo proteinase K, 10 mm Tris-HCl, ph 8.0, 10 mm EDTA, SDS e sarcozil e, incubadas à 56 o C. A extração propriamente dita foi executada em solução fenol:clorofórmio (volume:volume). As moléculas de DNA foram precipitadas em isopropanol (3 volumes). Ao final foi adicionado água destilada RNAse (50µl/ml) 117. As amostras de DNA foram quantificadas por espectrometria em Obsorbancia a 260 nm e analisadas por eletroforese em gel com 0,8% de agarose contendo brometo de etídio. Reação da polimerase em cadeia (PCR) As reações de amplificação foram realizadas com auxilio de Kits conforme instruções dos fabricantes (PCR Kit pure Taq Ready-To-Go PCR Beads TM Amersham Biosciences Limited). Os glóbulos (beads) são compostos com estabilizadoes, BSA, datp, dctp, dgtp, dttp, ~ 2,5 unidades de pure Taq DNA polimerase e tampão. Quando reconstituído para o volume final de 25µl cada glóbulo, a concentração de dntp é de 200µM em 10mM Tris-HCl, ph 9,0 em temperatura ambiente, 50mM cloreto de potássio (KCl) 2 1,5 mm cloreto de magnésio (MgCl). Foram testadas diferentes concentrações de amostras de DNA. Foram utilizados os oligonucleotídeos ( primers ): Gênero-específico - (Leishmania spp.) GGG(G/T)AGGGGCGTTCT(C/G)CGAA (C/G)(C/G)(C/G)(A/T)CTAT(A/T)TTACACCAACCCC-3 ; Espécie-específico (L.L.chagasi=L.L. donovani sensu lato) 73 RV1-5 -CTTTTCTGGTCCCGCGGGTAGG-3 72

25 RV2-5 - CCACCTGGCCTATTTTACACCA-3 Complexo-específico (L. braziliensis) 51 LU-5A - 5 TTT ATT GGT ATG CGA AAC TTC 3 LB 3C 5 CGT (C/G)CC GAA CCC CGT GTC 3 Foi utilizado aparelho termociclador TECHNE PROGENE para 20 amostras, sendo padronizado: - Primers 150 e Para amplificação de regiões conservadas do minicírculo de kdna, produzindo fragmentos de 120 pares de bases. A PCR foi padronizada para um ciclo inicial de desnaturação à 95 º C por 5 minutos, seguido de 29 ciclos desnaturação, anelamento e extensão, respectivamente à 95 º C por 45 segundos; 55 º C por 45 segundos e, 72 º C por 5 minutos para extensão; ciclo final à 10 º C por 5 minutos; - Primers RV1 e RV2 Para amplificação de regiões não conservadas do minicírculo de kdna produzindo fragmentos de 145 pares de bases. A PCR foi padronizada para um ciclo inicial à 95 º C por 5 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturação, anelamento e extensão, respectivamente à 95 º C por 30 segundos, 60 º C por 30 segundos e, 72 º C por 30 segundos; ao final um ciclo à 72 º C por 5 minutos e resfriamento à 4 º C; - Primers LU-5A e LB-3C Para amplificação de regiões do gene SL RNA (mini-exon), que contém respectivamente seqüências conservadas transcritas e não transcritas variáveis, porém específicas para os diferentes grupos (complexos) de Leishmania, neste caso, do complexo L. braziliensis, produzindo fragmentos de tamanho entre 146 e 149 pares de bases, específico para este grupo. A PCR foi padronizada para um ciclo inicial à 95ºC por 5 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturação, anelamento e extensão, respectivamente à 95 C por 45 segundos, 59 C por 45 73

26 segundos e, 72 C por 45 segundos, ao final um ciclo à 72 C por 5 minutos e resfriamento à 10 C. Eletroforese em gel de agarose Os produtos da PCR foram diluídos no tampão de corrida (glicerol, xilenocianol FF e azul de bromofenol) e separados por eletroforese em gel de 1 a 2% de agarose (dissolvido em Tris-acetato- EDTA contendo brometo de etídio). A eletroforese foi realizada em um sistema de gel-submarino e os géis foram visualizados e analisados em um transiluminador de ultravioleta. A documentação foi realizada por fotografia. 74

27 6 RESULTADOS No período de 1994 a 2003 foram diagnosticados 833 casos de Leishmaniose Visceral Americana (LVA) com 95 (11.40 %) óbitos no Estado de Mato Grosso do Sul (Tabela 1). As curvas da evolução das notificações e expansão da LVA autóctone no Estado de Mato Grosso do Sul para o período de 1994 a 2003 são de padrão claramente ascendente a partir de 1997, tanto em relação ao número de casos notificados a cada ano, quanto em relação ao número de municípios com focos naturais de transmissão (Figuras 6 e 7). No. Casos Autóctones Ano FONTE: FUNASA/MS Figura 6 - NÚMERO DE CASOS AUTOCTONES DE LEISHMANIOSE VISCERAL AMERICANA NO ESTADO DE MATO GROSSO DO SUL

28 25 No. de Municípios Ano. FONTE: FUNASA/MS Figura 7 - NÚMERO DE MUNICÍPIOS COM REGISTROS DE CASO DA LEISHMANIOSE VISCERAL AMERICANA NO ESTADO DE MATO GROSSO DO SUL A análise detalhada da distribuição dos casos de LVA nos municípios de Corumbá, Campo Grande e Três Lagoas revela que para os dois últimos à autoctonia é relativamente recente, com os primeiros registros sendo feitos ao final da década de (Figuras 8). FONTE: FUNASA / SMS /MS. Figura 8 - SÉRIE HISTÓRICA DOS CASOS CONFIRMADOS DE LEISHMANIOSE VISCERAL AMERICANA. MUNICÍPIOS DE CORUMBÁ, CAMPO GRANDE E TRÊS LAGOAS, ESTADO DE MATO GROSSO DO SUL, BRASIL

29 As faixas etárias mais atingidas foram 0-10 anos de ambos os sexos, (Figuras 9, 10 e 11). O Coeficiente de Prevalência no período de 1999 a 2003 é de 8,1 casos em Corumbá, 2 em Campo Grande e 21,5 em Três Lagoas, para habitantes, em área urbana. FONTE: SINAN/ Secretária Municipal de Saúde de Corumbá/MS. Figura 9 - CASOS CONFIRMADOS DE LEISHMANIOSE VISCERAL AMERICANA SEGUNDO FAIXA ETÁRIA E SEXO, NO MUNICÍPIO DE CORUMBA, ESTADO DE MATO GROSSO DO SUL, BRASIL, Nº de casos Nº de casos ONTE: SINAN/ Secretária Municipal de Saúde de Campo Grande /MS. Figura 10 - CASOS CONFIRMADOS DE LEISHMANIOSE VISCERAL AMERICANA SEGUNDO FAIXA ETÁRIA E SEXO, NO MUNICÍPIO DE CAMPO GRANDE, ESTADO DE MATO GROSSO DO SUL, BRASIL, F 77

30 Nº de casos Fonte: SINAN/ Secretária Municipal de Saúde de Três Lagoas /MS. Figura 11 - CASOS CONFIRMADOS DE LEISHMANIOSE VISCERAL AMERICANA SEGUNDO FAIXA ETÁRIA E SEXO, NO MUNICÍPIO DE TRÊS LAGOAS, ESTADO DE MATO GROSSO DO SUL, BRASIL, No período de 1999 a 2003, foram diagnosticados 78, 130 e 170 casos de LVA, respectivamente nos Municípios de Corumbá, Campo Grande e Três Lagoas. Como critério de confirmação destes casos de LVA foi considerado: o quadro clínico compatível, incluindo a presença de hepato e/ou esplenomegalia; o encontro do parasito; ao menos uma reação sorológica positiva. Neste estudo foi possível realizar o georreferenciamento de 97% dos casos de Corumbá; 96% de Campo Grande e 96% de Três Lagoas. 6.1 DISTRIBUIÇÃO ESPACIAL DOS CASOS LEISHMANIOSE VISCERAL AMERICANA NOS MUNICÍPIOS DE CORUMBÁ, CAMPO GRANDE E TRÊS LAGOAS, NO ESTADO DE MATO GROSSO DO SUL, BRASIL, A partir de 1998, a LVA assume um novo ritmo de disseminação para diferentes regiões e municípios no Estado de Mato Grosso do Sul. (Tabela 1 ). 78

31 O Sistema de Informação Nacional de Agravos Notificáveis, SINAN, é um banco de dados utilizados pelos municípios para registrar e armazenar os dados relativos às doenças de notificação compulsória, distribuídos segundo a seqüência das semanas epidemiológicas. A LVA compõe a lista das 42 doenças de notificação compulsórias, classificadas pelo Ministério da Saúde do Brasil. Os dados analisados no presente estudo foram coletados junto às Secretarias Municipais de Saúde Corumbá, Campo Grande, (SESAU) e Três Lagoas, o local provável de infecção. Como resultados do georreferenciamento dos casos confirmados foram geradas imagens das áreas urbanas indicando os prováveis locais de infecção nos Municípios de Corumbá (Figuras 12,13, 14, 15 e 16) Campo Grande (Figuras 17, 18, 19, 20 e 21) e Três Lagoas (Figuras 22, 23, 24 e 25) mostrando as distribuições dos casos de LVA, segundo o setor censitário de residência. 79

32 Figura 12: Imagem da área urbana do Município de Corumbá, Estado de Mato Grosso do Sul. Registro das prováveis locais de infecção de Leishmaniose Visceral Americana, para o ano 1999 num total de 18 casos. O fundo é imagem CBERS (INPE, 2004b) em composição fals-cor rgb 342 DE 25/09/2004. As coordenadas estão em UTM, fuso 21, datum Córrego Alegre. 80

33 Figura: 13- Imagem da área urbana do Município de Corumbá, Estado de Mato Grosso do Sul. Registro das prováveis locais de infecção de Leishmaniose Visceral Americana, para o ano 2000 num total de 18 casos. O fundo é imagem CBERS (INPE, 2004b) em composição fals-cor rgb 342 DE 25/09/2004. As coordenadas estão em UTM, fuso 21, datum Córrego Alegre. 81

34 Figura: 14-Imagem da área urbana do Município de Corumbá, Estado de Mato Grosso do Sul. Registro das prováveis locais de infecção de Leishmaniose Visceral Americana, para o ano 2001 num total de 14 casos. O fundo é imagem CBERS (INPE, 2004b) em composição fals-cor rgb 342 DE 25/09/2004. As coordenadas estão em UTM, fuso 21, datum Córrego Alegre. 82

35 Figura: 15 - Imagem da área urbana do Município de Corumbá, Estado de Mato Grosso do Sul. Registro das prováveis locais de infecção de Leishmaniose Visceral Americana, para o ano 2002 num total de 11 casos. O fundo é imagem CBERS (INPE, 2004b) em composição fals-cor rgb 342 DE 25/09/2004. As coordenadas estão em UTM, fuso 21, datum Córrego Alegre. 83

36 Figura 16: Imagem da área urbana do Município de Corumbá, Estado de Mato Grosso do Sul. Registro das prováveis locais de infecção de Leishmaniose Visceral Americana, para o ano 2003 num total de 15 casos. O fundo é imagem CBERS (INPE, 2004b) em composição fals- COR rgb 342 DE 25/09/2004. As coordenadas estão em UTM, fuso 21, datum Córrego Alegre. 84

37 Figura 17: Imagem da área urbana do Município de Campo Grande, Estado de Mato Grosso do Sul. Registro das prováveis locais de infecção de Leishmaniose Visceral Americana, para o ano 1999 num total de 02 casos. O fundo é imagem CBERS (INPE, 2004b) em composição fals- COR rgb 342 DE 25/09/2004. As coordenadas estão em UTM, fuso 21, datum Córrego Alegre. 85

38 Figura 18: Imagem da área urbana do Município de Campo Grande, Estado de Mato Grosso do Sul. Registro das prováveis locais de infecção de Leishmaniose Visceral Americana, para o ano 2000 num total de 02 casos. O fundo é imagem CBERS (INPE, 2004b) em composição fals- COR rgb 342 DE 25/09/2004. As coordenadas estão em UTM, fuso 21, datum Córrego Alegre. 86

39 Figura 19: Imagem da área urbana do Município de Campo Grande, Estado de Mato Grosso do Sul. Registro das prováveis locais de infecção de Leishmaniose Visceral Americana, para o ano 2001 num total de 07 casos. O fundo é imagem CBERS (INPE, 2004b) em composição fals- COR rgb 342 DE 25/09/2004. As coordenadas estão em UTM, fuso 21, datum Córrego Alegre. 87

40 Figura 20: Imagem da área urbana do Município de Campo Grande, Estado de Mato Grosso do Sul. Registro das prováveis locais de infecção de Leishmaniose Visceral Americana, para o ano 2002 num total de 21 casos. O fundo é imagem CBERS (INPE, 2004b) em composição fals- COR rgb 342 DE 25/09/2004. As coordenadas estão em UTM, fuso 21, datum Córrego Alegre. 88