DEXGELARATION SOLUÇÕES AVANÇADAS DE REGENERAÇÃO ÓSSEA COM BASE EM HIDROGÉIS DE DEXTRINO PORTEFÓLIO
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- Vagner Bonilha Bacelar
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1 DEXGELARATION SOLUÇÕES AVANÇADAS DE REGENERAÇÃO ÓSSEA COM BASE EM HIDROGÉIS DE DEXTRINO PORTEFÓLIO
2 Índice Introdução... 1 Preparação do HG e caracterização... 4 Esterilização dos componentes do hidrogel... 5 Avaliação do efeito da oxidação e da radiação gama na estrutura química do dextrino 6 Mecanismo de oxidação do periodato de sódio no dextrino analisado por técnicas de espectrometria de massa... 7 Preparação do BL Poro e caracterização... 8 Análise química das matérias-primas utilizadas na produção de Bonelike Poro... 8 Avaliação da influência dos agentes formadores de poros nos grânulos:... 9 Análise MEV do Bonelike Poro: Análise por Porosimetria de Mercúrio: Extração e diferenciação das células mesenquimais do cordão umbilical (MSCs) Caracterização das MSCs isoladas a partir do TCU Citometria de fluxo Imunocitoquímica Análise citogenética (cariótipo em fase de expansão) RT-PCR Associação das MSCs isoladas do TCU com o biomaterial e avaliação in vitro da viabilidade celular Injetabilidade das formulações HG+BL poro Condições Testadas KIT de administração Ensaios Pré-Clínicos Defeitos ósseos críticos: Defeitos calvariais Análise por micro-ct Análise histológica Conclusões e perspetivas de desenvolvimento... 25
3 Introdução O envelhecimento da população mundial e o número crescente de pessoas afetadas por doenças degenerativas determinam a necessidade do desenvolvimento de novas tecnologias de medicina regenerativa e engenharia de tecidos, as quais, por sua vez, estão na base de um mercado em rápida evolução. A prevalência de doenças ósseas afeta centenas de milhões de pessoas em todo o mundo, e estas constituem a principal causa de dor e deficiência/incapacidade, apresentando um enorme impacto sobre indivíduos, famílias, sociedades e economias. Os defeitos ósseos continuam a ser uma condição clínica não resolvida no contexto da medicina regenerativa. A utilização de biomateriais como substitutos ósseos sintéticos tem vindo a crescer significativamente ao longo do tempo. São várias as estratégias que têm vindo a ser desenvolvidas para regeneração óssea, incluindo a aplicação singular ou combinada de biomateriais sintéticos ou biológicos, de fatores bioativos e células. Nos últimos anos, o recurso a hidrogéis como matrizes de regeneração de tecidos tem constituído uma área emergente de investigação, devido à possibilidade destes materiais reproduzirem as estruturas químicas e representarem uma matriz que permite assistir o processo de regeneração do tecido biológico. A injetabilidade é também reconhecida como uma propriedade desejável no desenvolvimento de hidrogéis, pois permite a sua administração de forma minimamente invasiva, sendo o tempo de gelificação (e a capacidade de se poder manipular esta propriedade) uma característica essencial nestes materiais. O projeto Dexgeleration foi concebido para aprofundar e acelerar desenvolvimentos paralelos de soluções avançadas de regeneração óssea com base em novas formulações do hidrogel de dextrino. O principal objectivo do projeto prendeu-se com o desenvolvimento de formulações injetáveis de hidrogel de dextrino com Bonelike e outros agentes bioactivos, de forma a reunir num só material a sofisticação funcional de um scaffold com propriedades estruturais e biomecânicas, que permitam facilitar a sua integração no tecido e a biocompatibilidade. O projeto estruturou-se num conjunto de atividades de I&D que visam sustentar, numa lógica de pipeline de produto, o desenvolvimento de
4 formulações e comprovação da respetiva eficácia pré-clínica no tratamento das condições priorizadas: defeitos críticos, não-uniões e osteomielites. Caracterização de formulações injectáveis de hidrogel com agentes bioactivos Caracterização de formulações injectáveis de hidrogel com células estaminais mesenquimais Desenvolvimento de produto, estudos de scale-up e optimização de produto Ensaios pré-clínicos DEXGELARATION
5 Preparação do HG e caracterização O hidrogel é constituído por um polímero natural, o dextrino, como matéria-prima, sendo este um polissacarídeo constituído por unidades de D-glucose, maioritariamente unidas por ligações glicosídicas α-1,4, podendo apresentar também algumas ramificações α-1,6 (<5%). A cadeia do dextrino é oxidada pelo periodato de sódio, que ataca dióis e leva á formação de grupos aldeídos. Os aldeídos são grupos funcionais reativos que reagem com moléculas como a dihidrazida do ácido adípico (ADH), para formar ligações hidrazonas hidrolisáveis. Assim, o ADH atua como agente reticulante dando origem à matriz do hidrogel, a qual se vai degradando à medida que as ligações hidrazonas se vão hidrolisando. O período de gelificação pode ser obtido entre alguns segundos e várias horas, dependendo da concentração dos componentes. O grau de oxidação também pode ser facilmente controlado pela quantidade de agente oxidante utilizada, permitindo dispor de grupos aldeído reativos, não só para a ligação covalente com agentes reticulantes, mas também para o acoplamento e libertação de cerâmicos bioativos nos tecidos alvo, como é o caso do Bonelike Poro.
6 Esterilização dos componentes do hidrogel Solução ADH Solução ODEX MEC digerida e moída RADIAÇÃO GAMA 20 kgy (2 kgy/h) A utilização de filtros com poro 0.22 μm constitui um método de esterilização validado. A utilização da dose de irradiação gamma de 20 kgy, a uma taxa de 2 kgy/h, foi suficiente para esterilizar a solução de, bem como a MEC digerida e moída.
7 Na análise de ESR (Electron spin resonance) não foi detetado sinal da presença de radicais livres no ODEX irradiado. Avaliação do efeito da oxidação e da radiação gama na estrutura química do dextrino Análise de ligação do dextrino e ODEX irradiado e não irradiado (mol %) Dextrino ODEX 0 kgy 10 kgy 20 kgy 0 kgy 20 kgy T-Glcp 14,9 15,9 15,6 23,9 22,0 (1 4) Glcp 76,3 76,7 75,5 52,2 49,3 (1 6) Glcp 3,2 3,2 3,3 4,8 4,7 (1 4,6) Glcp 4,0 2,8 4,1 5,3 5,8 (1 2) Glcp 0,4 0,4 0,4 3,3 4,0 (1 3) Glcp 0,5 0,3 0,4 0,9 0,9 (1 3,4) Glcp 0,3 0,2 0,4 6,1 7,7 (1 2,4) Glcp 0,4 0,4 0,4 4,0 5,5
8 Mecanismo de oxidação do periodato de sódio no dextrino analisado por técnicas de espectrometria de massa Os processos de oxidação e de irradiação gama não levaram à formação de novos tipos de ligações glicosídicas, nem de outros açúcares. O periodato de sódio diminui a quantidade de resíduos de glucose no dextrino. Este não provocou outras alterações químicas adicionais além da quebra de ligações C-C entre dióis e trióis vicinais com formação de aldeídos. O processo de irradiação gama, nas condições testadas, não afetou a estrutura química do ODEX.
9 Preparação do BL Poro e caracterização Análise química das matérias-primas utilizadas na produção de Bonelike Poro
10 Avaliação da influência dos agentes formadores de poros nos grânulos: Bonelike Poro PVA Celulose Tempo de Mistura BLP-1 (Protocolo de Partida) 100% 100% 100% BLP-2 100% 0% 100% BLP-3 100% 0% 400% BLP-4 100% 50% 100% BLP-5 0% 100% 100%
11 Análise MEV do Bonelike Poro: Análise por Porosimetria de Mercúrio: Parâmetros μm 500μm - 2mm 2-5.6mm Volume total de intrusão (ml/g) Área total de poros (m 2 /g) Diâmetro mediano dos poros (Volume) (μm) Diâmetro mediano dos poros (Área) (μm) Diâmetro médio dos poros (4V/A) (μm) Densidade "Bulk" para 0.51 psia (g/ml) Densidade aparente (g/ml) Porosidade (%)
12 Extração e diferenciação das células mesenquimais do cordão umbilical (MSCs) Exemplificação da preparação do TCU para cultura. 1)Remoção dos vasos do cordão umbilical. 2) dissecção do TCU em unidades de 0,5 cm3. 3) Colocação das unidades distribuídas pela placa de Petri. 4) Placa de Petri já com meio de cultura para ser colocada na estufa Células humanas mesenquimatosas isoladas da geleia de Wharton indiferenciadas (A) e após diferenciação em células do tipo neuronal (B). A diferenciação ocorreu na presença de meio de cultura neurogénico durante 96 horas (Ampliação de 100x).
13 Caracterização das MSCs isoladas a partir do TCU Citometria de fluxo Análise por citometria de fluxo de MSCs isoladas por cultura extemporânea de TCU criopreservado. Histogramas de resultados da análise efetuada por citometria de fluxo com marcadores celulares de superfície. 98% das células da população analisada foram consistentemente CD44 +, CD73 +, CD90 + e CD105 + CD34 - (MSCs) 2% das células da população analisada foram consistentemente CD14 +, CD19 +, CD31 +, CD34 +, CD45 + e HLA-DR + (hematopoiéticas) Imunocitoquímica As células mesenquimatosas isoladas da geleia de Wharton foram diferenciadas em células neuronais em meio de cultura neurogénico (96 horas).
14 Por imunocitoquímica, as células diferenciadas são positivas a Proteína Glial Fibrilar Ácida (GFAP) (A), a Proteína Associada ao Crescimento 43 (GAP-43) (B) e Proteína nuclear neuronal (NeuN) (C). As células indiferenciadas são negativas para estes marcadores específicos neuronais (100x) (painéis inseridos em A, B e C). MSCs isoladas de TCU fresco por processo enzimático. Potencial de diferenciação analisado recorrendo a métodos histológicos de coloração qualitativos. Diferenciação adipogénica por Oil Red O (i). Diferenciação osteogénica por fosfatase alcalina (ii). Diferenciação condrogénica por Alcin Blue (iii).
15 Análise citogenética (cariótipo em fase de expansão) Cariótipo das células humanas mesenquimatosas isoladas da geleia de Wharton indiferenciadas utilizadas como sistema celular para regeneração do nervo periférico. Não foram observadas alterações estruturais nem numéricas no cariótipo avaliado em fase de metafase (46,XY). RT-PCR RT-PCR realizado às MSCs indiferenciadas. Média dos valores Ct obtidos (A). Imagem do gel de agarose onde ocorreu a amplificação dos genes seleccionados (B). Os dados confirmaram os dados obtidos com a imunocitoquimica. Gel de agarose
16 (duplicados e negativo dos genes): linha 1-3, gene GFAP e negativo; linha 4-6, gene NeuN e negativo, linha 7-9, gene β-actina e negativo, linha 10, gradiente de DNA, linha 11-13, gene GAPDH e negativo, linha 14-16, gene Nestina e negativo, linha 17, gradiente de DNA, linha 18-20, gene NF-H e negativo, linha 21-23, gene GAP-43 e negativo, linha 24 gradiente de DNA. RT-PCR realizado às MSCs diferenciadas in vitro em células do tipo neuroglial. Média dos valores Ct obtidos (A). Imagem do gel de agarose onde ocorreu a amplificação dos genes seleccionados (B). Os dados confirmaram os dados obtidos com a imunocitoquimica. Gel de agarose (duplicados e negativo dos genes): linha 1-3, gene GFAP e negativo; linha 4-6, gene NeuN e negativo, linha 7 gradiente de DNA, linha 8-10, gene β-actina e negativo, linha 11-13, duplicados do gene GAPDH e negativo, linha 14, gradiente de DNA, linha 15-17, duplicados do gene Nestina e negativo, linha 18-20, duplicados do gene NF-H e negativo, linha 21, gradiente de DNA, linha 22-24, duplicados do gene GAP-43 e negativo.
17 Associação das MSCs isoladas do TCU com o biomaterial e avaliação in vitro da viabilidade celular Proliferação celular de células MG-63 em grânulos macroporosos e esferas de Bonelike durante 1, 3 e 7 dias, avaliada por ensaios MTT e Resazurina. Maior proliferação celular nos grânulos macroporosos (BL-P), quando comparados com as esferas. A atividade da fosfatase alcaliuna nas células aderidas no Bonelike macroporoso foi também mais elevada.
18 Injetabilidade das formulações HG+BL poro Condições Testadas Hidrogel Dextrino (1ml) Hidrogel+BLP ( µm) (30% (p/v) Hidrogel+BLP ( µm) (40% (p/v) Hidrogel+BLP ( µm) (60% (p/v) Hidrogel + 30% BLP Hidrogel + 40% BLP Hidrogel + 60% BLP Força de extrusão máxima (N) Hidrogel + 30% BLP 5.89 Hidrogel + 40% BLP 5.83 Hidrogel + 60% BLP 7.13
19 Hidrogel + MEC hidrolisada Hidrogel + MEC hidrolisada + BLP (60% (p/v) Hidrogel + MEC moída Hidrogel + MEC moída+ BLP (60% (p/v) Hidrogel + MEC hidro Hidrogel + MEC moída Hidrogel + MEC + 60 % BLP Força de extrusão máxima (N) Hidrogel + 60% BLP 7.13 Hidrogel + Mec moida 7.16 Hidrogel + Mec hidro 8.97 Hidrogel + MEC hidro + 60% BLP Hidrogel + MEC moída +60% BLP
20 KIT de administração Durante esta atividade foi efetuada uma pesquisa detalhada de modelos de sistemas usados para o tipo de aplicações pretendido e foram contactadas empresas a operarem no mercado de sistemas de administração de soluções injetáveis. Numa primeira fase foram identificados dois modelos de duas empresas internacionais (Medmix e Nordson Micromedics). A realização dos ensaios de injetabilidade com recurso aos dois Kits permitiu avaliar de forma qualitativa a funcionalidade dos dois dispositivos e identificar os principais alvos de melhoria e customização para satisfazer os objetivos. Sistema A: MedMix Sistema B: Nordon Micromedics Dificuldade em colocar as seringas no M-system (MedMix) e os grânulos ficam retidos No sistema da Nordson Micromedics não se verificou a gelificação
21 Tendo em conta custos de customização apresentados, foram estudadas alterações ao modelo base definido, de modo a reduzir esses custos, e simultaneamente, satisfazer os requisitos inicialmente definidos para o dipositivo de administração. Com base nesse estudo, constatou-se que a substituição da seringa dual, do modelo original, por viais constitui uma alternativa eficaz mais económica. Sistema permite cumprir os requisitos exigidos
22 Ensaios Pré-Clínicos Defeitos ósseos críticos: Defeitos calvariais No decorrer destes ensaios foram usadas 24 cabras. Cada animal suportou 4 defeitos calvariais críticos. Para cada formulação de hidrogel foram feitas 6 réplicas independentes (6 animais). Esquema de formulações de HG Procedimento cirúrgico
23 Análise por micro-ct
24 Análise histológica Todas as formulações de hidrogel ODEX testadas, com ou sem Bonelike, são biocompatíveis O HG manteve os grânulos coesos e não afetou as propriedades osteocondutoras dos grânulos de Bonelike Poro Os agentes bioativos utilizados não parecem contribuir para a formação de novo osso O HG sozinho não é irritante para o tecido, enquanto a sua mistura com o Bonelike Poro é ligeiramente irritante
25 Formulações testadas Controlo Hidrogel Hidrogel + MEC moída Hidrogel + MEC degradada Hidrogel + Bonelike Hidrogel + Bonelike + Células Hidrogel + Bonelike + MEC degradada Semanas Células polimorfonucleares Linfócitos Células plasmáticas Macrófagos Células gigantes/ osteoclastos SUB-TOTAL (2X) Neovascularização Fibrose Tecido adiposo infiltrado SUB-TOTAL TOTAL AVARAGE* (G. teste G. controlo) Necrose Detritos estranhos = ausente; 1 = mínimo; 2 = suave; 3 = moderado; 4 = severo ; *Usado para determinar a classificação do grau de irritação do tecido ao implante: não irritante = 0-2.9; ligeiramente irritante = 3-8.9; moderadamente irritante = 9-15; severamente irritante = >15. Diferenças negativas são registradas como zero.
26 Conclusões e perspetivas de desenvolvimento Objetivos propostos atingidos Validação da investigação pré-clínica permitirá o avanço para validação clínica Aprovação do pedido de patentes i a nível mundial - USA e EU Resultados perspetivam um forte impacto para o consórcio a médio-longo prazo Comercialização dos produtos Criação de start up i Formulações de hidrogel de dextrino para a regeneração de defeitos ósseos e não-uniões de fraturas - N.º do Pedido: Formulação com péptidos antimicrobianos para o tratamento de infeções e regeneração óssea - N.º do Pedido:
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