ATIVIDADE DA REDUTASE DO NITRATO EM FOLHAS DE PLANTAS SUPERIORES, SUBMETIDAS AO ESTRESSE HÍDRICO

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1 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIA (ICA) CURSO DE DOUTORADO EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS AGROECOSSISTEMAS DA AMAZÔNIA PROFº: DR. ROBERTO CEZAR LOBO DA COSTA ATIVIDADE DA REDUTASE DO NITRATO EM FOLHAS DE PLANTAS SUPERIORES, SUBMETIDAS AO ESTRESSE HÍDRICO MÉTODO IN VIVO HAGEMAN e HUCKLESBY, Methode in Enzymology 17 a:

2 1 INTRODUÇÃO O nitrogênio inorgânico é normalmente absorvido pelas plantas na forma de nitrato (NO 3- ), embora sob certas circunstâncias, os íons amônio (NH 4+ ) possam ser assimilados. A seqüência global da absorção do nitrogênio inorgânico no material orgânico pode ser resumida nas seguintes seqüências de reações: a) Redução do nitrato, via nitrito a amônio; b) Assimilação de amônia no glutamato; c) Transaminação do glutamato para aminoácidos; d) Síntese de outros aminoácidos.

3 Além disto, um número de bactérias e microorganismos simbióticos são capazes de reduzir o N 2 atmosférico a amônio. No caso das leguminosas, e outras plantas superiores o microorganismo fixador de nitrogênio (Rhizobium) é encontrado nos nódulos das raízes (bacterióide).

4 Para a maioria das plantas no seu meio ambiente natural, o nitrato (NO 3- ) é a fonte usual de nitrogênio. O nitrato tem que ser transformado em amônio (NH 4+ ) antes que possa se combinar com os compostos de carbono, de modo a formar os vários componentes nitrogenados da célula. O processo é conhecido como redução assimilatória do nitrato para diferenciá-lo da redução do nitrato (tipo respiratório) feito por vários tipos de bactérias, as quais, sob micro-aerofilia ou condição anaeróbias, usa nitrato como um aceptor de elétrons no lugar do oxigênio molecular. Pode-se estimar que as plantas assimilam toneladas de nitrato por ano. A redução assimilatória do nitrato ocorre nas plantas superiores, algas e várias bactérias, fungos e leveduras. O processo pode ser resumido do seguinte modo:

5 EQUAÇÃO ASSIMILATÓRIA DO NITRATO (+5) (+3) (-3) NO 3ˉ 2e - NO 2ˉ 6eˉ NH 4 + RN RN i Isto envolve a participação seqüencial de duas metaloprotéinas: A) Redutase do nitrato; B) Redutase do nitrito. A fonte fisiológica de elétrons é a piridina nucleotídeo reduzido ou ferredoxina reduzida, isto vária de acordo com o tipo de enzima. O ATP não é necessário para a redutase do nitrito ou nitrato. Ambas as reações ocorrem com decréscimo de energia livre.

6 Em eucarióticos, a redutase do nitrato é um complexo enzimático (PM~ D), possuindo flavina (FAD), grupo heme (citocromo b 557 ) e molibdênio. Elétrons provenientes do NAD(P)H (da fotossíntese ou oxidação dos carboidratos) são transferidos para o nitrato através da cadeia enzimática de transporte de elétrons: NAD(P)H NAD(P) + [FAD cit. b Mo] NO 3ˉ NO 2ˉ + H 2 O

7 Em algas e tecidos fotossintéticos, a redutase do nitrato parece estar localizada no citoplasma ou fracamente ligada à membrana externa do cloroplasto. A enzima apresenta uma alta taxa de regeneração protéica e esta presente em altos níveis quando as células são alimentadas com nitrato, porém esta enzima encontra-se reprimida quando a mesma encontra-se em meio contendo íons amônia. A atividade da redutase do nitrato é estimada medindo a quantidade de nitrito produzido a partir do nitrato, e a redutase do nitrito pelo desaparecimento do nitrito na mistura de reação. O método in vivo utilizado para a determinação do nitrito (SNELL & SNELL, 1949, citado por COSTA, 1999), é baseado na formação de um sal de diazônio durante a reação em meio ácido com a sulfanilamida. Este complexo reage com o N- (1-Naftil) etilenodiamina (NNEDA), formando um complexo colorido, o qual é vermelho, e possui máximo de absorção em 540nm.

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9 2 OBJETIVOS a) Determinar a atividade da redutase do nitrato em tecidos de plantas superiores; b) Determinar a atividade de redutase do nitrato em folhas de plantas superiores submetidas ao estresse hídrico; c) Diferenciar a atividade de redutase do nitrato em plantas cultivadas sob estresse de água e em condições normais.

10 3 - MATERIAIS E REAGENTES a) Tampão fosfato [(KH 2 PO 4 ) 0,1 M ph 7,5 contendo isopropanol 1% (V/V) e KNO 3ˉ - Nitrato de potássio - 50mM]; b) Sufanilamida 1% em HCl 2,4 N; c) NNEDA 0,02%; d) Tubos de ensaio; e) Tubos de ensaio para bombas de vácuo, com rolha de borracha; f) Bomba de vácuo; g) Banho-maria; h) Termômetro ( C); i) Espectrofotômetro (visível); j) Estantes para tubos de ensaio; k) Agulhas e mangueiras de borracha; l) Papel alumínio; m) Vortex (agitador de tubos).

11 METODOLOGIA Na casa de vegetação da UFRA/ICA em... vasos plásticos de... Kg contendo solo, coloque... sementes de espécies sugeridas pelo professor para germinarem. Após a germinação deixe 2 plantas por vaso. Ou mudas de espécies florestais com... meses de idade. Quando as plantas estiverem com 20 dias após a emergência faça o tratamento de estresse de água na metade dos vasos, durante 4 (quatro) dias consecutivos, através da suspensão da rega, para as espécies anuais; e/ou 10 dias para espécies florestais. Após esse período, leve as plantas túrgidas e estressadas imediatamente ao laboratório de Fisiologia Vegetal e com o auxílio de um furador de rolhas retire discos foliares 0,5 cm 2 de diâmetro e em seguida, pese aproximadamente 200 mg dos discos foliares. Transfira para tubos de ensaio para vácuo contendo 5,0 ml do tampão fosfato (meio de reação) e em seguida fazer vácuo por 2 minutos após, colocar os tubos de ensaio em banho-maria à 30 0 C por 30 minutos e ao abrigo da luz (escuro). Em tubo de ensaio comum, adicionar 2,0 ml de tampão + 1,0 ml do extrato de reação +1,0 ml de sulfanilamida 1% + 1,0 ml de NNEDA 0,02%. Deixar em repouso por 15 minutos. Fazer a leitura no espectrofotômetro à 540nm contra o branco (3,0mL de tampão fosfato + 1,0 ml de sulfanilamida + 1,0 ml de NNEDA). Comparar absorbância com a curva padrão de NO 2ˉ (nitrito) e expressar a atividade da enzima em moles de NO 2ˉ. gmf -1. hˉ1. Apresentar os resultados em tabela e/ou gráfico.

12 PREPARAÇÃO DOS REAGENTES a) Tampão fosfato (KH 2 PO 4 ) 0,1M ph = 7,5, contendo Isopropanol 1% (V/V ); KNO 3 50 mm. KH 2 PO 4 PM = 136, , ml 1 M X 1000 ml 0,1 M X = 13, 609 g K NO 3 PM = 101, , ml 1000 mm X 1000 ml 50 mm X = 5,055 g Isopropanol 1% (10 ml / L) Dissolver 13,609 g de KH 2 PO 4 em 600 ml de H 2 O destilada juntamente com 5,055 g de KNO 3. Adicionar 10 ml/l de Isopropanol e misturar em seguida, ajustar o ph para 7,5 e completar o volume até 1000 ml, em balão volumétrico.

13 PREPARAÇÃO DOS REAGENTES b) Sulfanilamida 1 % ( V/V) em HCl 2,4N PM = 36,46 HCl d = 1,19 (1,19 g / ml de HCl) Pureza = 37 % m = d V 100 % 1190 g V 1 N 1 = V 2 N 2 m = 1, ml 37 % V 1 x12,08 = 500 mlx2,4 N m = 1190 g = 440,3 g V 1 = 99,34 ml nº de moles PM 440,3 36,46 1 N = N = = 12,08 N Colocar 99, 34 ml de HCl puro (37%) em 500mL (Completar o volume) Disolver 5 g de Sulfanilamida em 0,5 L de H Cl 2,4 N

14 c) N 1 - Naftilenodiamina (Bicloridato) : 0,02 % (NNEDA) 0,02 g 100 ml x 1000 ml x = 0,2 g / L Disolver 0,2 g de NNEDA em 1 L de H 2 O destilada

15 CURVA PADRÃO 1. SOLUÇÃO ESTOQUE: Na NO 2 0,1 M * (Quantidade de NO 2 - (nmoles / 1,0 ml)

16 PASSOS PARA PREPARAR SOLUÇÃO ESTOQUE DE NITRITO a) Preparar solução estoque de NaNO 2 0,1 M (preparar 10 ml); b) Retirar 5 ml de 0,1M para preparar 500 ml (0,001 M); c) retirar 10 ml de 0,001 M para preparar 100 ml (0,0001 M = 100 M). OBS: retirar volumes da solução 100 M conforme tabela anterior.

17 LEITURA NO ESPECTROFOTÔMETRO

18 4. ANAEROBIOSE: INIBE NIR Escuro (sem luz): NADH; Temperatura ótima: 30 c; Nitrato: 50 mm; Isopropanol; ph: 7,5.

19 II RESUMO DA METODOLOGIA 1. PESAR 200MG DE DISCOS FOLIARES RECÉM-COLHIDOS; 2. TRANSFERIR PARA TUBO DE ENSAIO PARA VÁCUO CONTENDO 5 ML DO TAMPÃO (MEIO DE REAÇÃO); 3. FAZER O VÁCUO POR 2 MINUTOS (ANAEROBIOSE); 4. COLOCAR OS TUBOS EM BANHO MARIA À 30 C POR 30 MIN, AO ABRIGO DA LUZ (ESCURO) PAPEL ALUMÍNIO; 5. EM TUBO DE ENSAIO ADICIONAR 1ML DO TAMPÃO + 2ML DO EXTRATO DE REAÇÃO DE + 1ML DE NNEDA = 5ML (TOTAL); 6. DEIXAR EM REPOUSO POR 15MIN; 7. FAZER A LEITURA NO ESPECTROFOTOMETRO A 540NM CONTRA O BRANCO (3ML DO TAMPÃO + 1ML SUFANILAMINA + 1ML NNEDA) 8. COMPARAR A ABSORBÂNCIA COM A CURVA PADRÃO DE NO 2- ; 9. EXPRESSAR A ATIVIDADE EM: MOLES DE NO 2-.H -1.G -1 MF; 10. FAZER UM GRÁFICO DOS RESULTADOS.

20 5 QUESTIONÁRIO 1. Mostre a reação química de redução do nitrato a amônia e indique as enzimas envolvidas nesses passos metabólicos. 2. Mostre a estrutura química da redutase do nitrato, indicando a cadeia transportadora de elétrons. 3. Qual o efeito do estresse hídrico na atividade da redutase do nitrato? Justifique sua resposta. 4. De que maneira é estimada a atividade da redutase do nitrato em plantas pelo método in vivo e mostre os principais passos metabólicos que ocorrem até a formação do complexo colorido o qual é vermelho, e possui máximo de absorção em 540nm? 5. Explique qual a finalidade de se cobrir os tubos de ensaio com pepel alumínio nessa determinação? 6. Na formulação do tampão fosfato você coloca um álcool (isopropanol). Qual a finalidade de se usar este álcool? Justifique sua resposta. 7. Em que parte da célula vegetal ocorre à redução do nitrato a nitrito e a desse composto a amônia? 8. Em quais regiões da planta ocorre a atividade de redutase do nitrato? Mostre um esquema de uma planta indicando no mesmo cada um dos passos de redução de nitrato à amônia.

21 6 BIBLIOGRAFIA 1. COOMBS, J. & HALL, D. O. Técnicas de produtividade e fotossíntese, EUFC, Fortaleza, Edições UFC, COSTA, R. C. L. da. Assimilação de nitrogênio e ajustamento osmótico em plantas noduladas de feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) (Walp)] submetidas ao estresse hídrico f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, HAGEMAN, R. H. G. & HUCKLESBY, D. P., Nitrate reductase from higher plants. In: METHODS IN ENZIMOLOGY, 17 A: , KERBAUY, Gilberto Barbante - 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, LEA, P.J. & LEEGOOD, R.C. Plant Biochemistry and Molecular Biology. Wiley. New York, TAIZ, L. & ZEIGER, E. Fisiologia Vegetal 3ª Edição. Editora Artmed 719, 2009.