Inibição do recrutamento celular pelo extrato aquoso de Mikania laevigata. Schultz Bip. ex. Baker e cumarina em ratos submetidos à peritonite

Transcrição

1 Inibição do recrutamento celular pelo extrato aquoso de Mikania laevigata 3 Schultz Bip. ex. Baker e cumarina em ratos submetidos à peritonite Renata Buratto Vieira 1*, Sandra Manoela Dias Macedo 1, Melissa Schwanz 1 ¹Departamento de Ciências da Saúde, Curso de Farmácia, Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões. URI Campus de Erechim. Av. Sete de Setembro, CEP RESUMO: Mikania laevigata é uma planta nativa do sul do Brasil conhecida popularmente como guaco e usada como expectorante. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do extrato aquoso de M. laevigata sobre a mobilização de células imunocompetentes no sangue periférico e no foco da lesão na resposta inflamatória aguda. O extrato aquoso foi obtido por maceração a 10% sendo administrado por via subcutânea 200 mg/kg em ratos Wistar machos que foram submetidos à peritonite por injeção de glicogênio de ostra (1% em PBS). O recrutamento celular foi avaliado por contagem total (contador celular eletrônico) e diferencial (extensão celular corada pelo método de Romanowsky). Animais controle receberam somente PBS. A cumarina, principal componente do guaco, também foi testada na dose de 2,5 mg/kg. O recrutamento de neutrófilos e monócitos após 4h da indução da inflamação foi inibido nos animais tratados com extrato aquoso de M. laevigata. Tanto o grupo controle, quanto o grupo tratado com extrato, mostraram redução no número de leucócitos totais, quando comparados aos seus respectivos grupos antes da indução da inflamação. Conclui-se que o extrato de M. laevigata inibe a mobilização de leucócitos da medula óssea para o sangue, efeito não decorrente da presença de cumarina. Unitermos: Mikania laevigata. Cumarina. Recrutamento celular. ABSTRACT: Inhibition of cell recruitment by aqueous extract of Mikania laevigata Schultz Bip. ex. Baker and coumarin in rats subjected to peritonitis. Mikania laevigata is a plant native of southern Brazil known popularly as guaco and used as expectorant. The purpose of this study was * Av. Sete de Setembro, 920/25 - Centro, , Erechim/RS. renataburatto@yahoo.com.br

2 4 to evaluate the effect of aqueous extract of M. laevigata on the mobilization of immunocompetent cells in the peripheral blood and in the focus of the lesion in the acute inflammatory response. The aqueous extract was obtained by maceration to 10% for subcutaneous administration of 200 mg/kg in male rats Wistar that were submitted to peritonitis by injection of oyster glycogen (1% PBS). The recruitment cell was evaluated by counting total (counting cellular electronic) and differential (extension cell stained by the method of Romanowsky). Animal control received only PBS. The coumarin, the main component of guaco, was also tested in the dose of 2.5 mg/kg, dissolved in PBS. The recruitment of neutrophils and monocytes after 4h of the induction of the inflammation was inhibited in animals treated with aqueous extract of M. laevigata. Both the control group, as the group treated with extract, showed reduction in the total number of when compared to their respective groups before the induction of inflammation. It was concluded that the extract of M. laevigata inhibits the mobilization of leukocytes from bone marrow to the blood, no effect deriving from the presence of coumarin. Keywords: Mikania laevigata. Coumarin. Cell recruitment. INTRODUÇÃO Atualmente há um interesse crescente e renovado no uso de terapias complementares e produtos naturais como recurso terapêutico, sendo as plantas medicinais amplamente utilizadas na medicina popular para o tratamento de diferentes condições inflamatórias. Entretanto, para muitas destas plantas, a real eficácia e os princípios ativos são desconhecidos, sendo que estudos experimentais visam demonstrar as propriedades farmacológicas e identificar os princípios ativos destas (Elisabestky, 2001; Rates, 2001; Sosa et al., 2002). As várias etapas envolvidas no processo inflamatório têm por objetivo principal recrutar populações celulares distintas, que irão eliminar o agente causal e, concomitantemente, reparar o tecido lesado; finalizada a ação do agente inflamatório, a microcirculação retorna ao estado hemodinâmico original e o líquido e as células exsudadas voltam à circulação sanguínea geralmente

3 5 pelos vasos linfáticos. A exacerbação deste processo promove a necessidade de usar agentes que interfiram em uma ou mais dessas etapas (Pereira; Bogliolo, 1998; Kumar; Abbas; Fausto, 2005). Muitas plantas têm sido utilizadas na medicina tradicional não só pela sua eficiência em atenuar ou mesmo eliminar os efeitos indesejáveis da resposta inflamatória, mas também pela facilidade de acesso e, principalmente, pelo seu baixo custo (Presibella; Santos; Weffort-Santos, 2003). Mikania laevigata Schultz Bip. ex. Baker conhecida popularmente por guaco pertence à família Asteraceae, sendo nativa do sul do Brasil, e encontra-se desde São Paulo até o Rio Grande do Sul. Constitui uma planta muito utilizada na medicina popular no tratamento de doenças do trato respiratório, como expectorante, em xaropes para tosse e gripe (Oliveira et al., 1984; Davino, Giesbrecht; Roque, 1989; Teske; Trentini, 1997). Além disso, as atividades antialérgica e broncodilatadora já foram comprovadas em estudos farmacológicos (Leite et al., 1993; Fierro et al., 1999). Cabe ressaltar que o efeito benéfico do guaco no tratamento da asma/doenças respiratórias não pode ser comprovado exclusivamente pelo relaxamento da musculatura lisa do trato respiratório, isso porque o processo inflamatório exerce um papel fisiopatológico importante (Moura et al., 2002). Estudos químicos das espécies M. glomerata e laevigata determinam as seguintes substâncias isoladas: cumarina (1,2-benzopirano), ácido caurenóico, ácido cinamolglandiflóroco, estigmasterol, friedelina, flavonóides e lupeol; sendo que a cumarina foi escolhida como substância marcadora por ser um dos constituintes majoritários do vegetal e contribuir para os efeitos farmacológicos (Oliveira et al., 1984; Leite et al., 1993; Cabral; Dos Santos; Alhaique, 2001; Aguinaldo et al., 2003). Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do extrato aquoso de M. laevigata e da cumarina sobre a mobilização de células imunocompetentes para o sangue periférico e para o foco da lesão em modelo experimental de peritonite.

4 METODOLOGIA 6 Extrato Vegetal O extrato aquoso foi preparado por maceração a 10% utilizando amostra de M. laevigata coletada na região de Erechim-RS (exsicata da espécie encontra-se depositada no Herbário Balduíno Rambo da Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões Campus de Erechim, sob nº 9920, e foi identificada por Ritter, M. ICN-UFRGS). O extrato aquoso foi liofilizado, sendo então diluído em Solução Tampão Fosfato Salina (PBS) na concentração de 200 mg/kg. Preparação do Padrão de Cumarina O padrão cumarina (Merck) foi diluído em PBS na concentração de 2,5 mg/kg. Animais de Experimentação Foram utilizados 18 ratos Wistar machos, pesando entre g, procedentes do Laboratório de Experimentação Animal da Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões Campus de Erechim. Os animais foram mantidos nas condições normais do biotério, com fotoperíodo de 12 horas de claro e escuro, ruídos mínimos, temperatura ambiente 22 ± 2 C e umidade mantida por ar condicionado, com livre acesso à alimentação e água. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Regional Integrada URI - Campus Erechim, RS (Registro n 126/TCA/07) e os experimentos seguiram as normas éticas de experimentação animal determinadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). Resposta Inflamatória Induzida por Glicogênio de Ostra A indução da resposta inflamatória foi realizada de acordo com Oktar; Yuksel; Alican (2004). Para tanto, os animais foram anestesiados pelo Zoletil 50 (50mg/kg, via intraperitonial) e

5 7 10 ml de glicogênio de ostra diluído em PBS 1% foram administrados por via intraperitonial. Após quatro horas, os animais foram anestesiados novamente e, em seguida, eutanasiados em câmara de CO 2. O exsudato inflamatório foi coletado por lavagem peritonial com PBS. Tratamentos Simultaneamente à injeção do agente flogístico os animais receberam 200 mg/kg de extrato de M. laevigata e, outro grupo, 2,5 mg/kg de solução padrão de cumarina, ambos em volume final de 250 µl e por via subcutânea. O grupo controle recebeu o mesmo volume de PBS. Contagem de Leucócitos Circulantes e no Local da Lesão A contagem total e diferencial de leucócitos circulantes foi realizada a partir de amostras de sangue heparinizado, coletadas do plexo orbital através de um capilar antes e após a indução do processo inflamatório, nos animais previamente anestesiados com Zoletil 50 (50mg/kg, via intraperitonial). A mobilização de células imunocompetentes para o sangue periférico e para o foco da lesão na peritonite foi avaliada por contagem total e diferencial, feita eletronicamente por análise de impedância em contador ABX Micros 60 e extensão celular fixada corada pelo método de Romanowsky, respectivamente e visualizada em microscópio óptico em aumento de 400 vezes, mediante análise de 100 células. Os resíduos biológicos gerados foram descartados conforme RDC 306 de 07 de setembro de 2004 (BRASIL, 2004). Análise Estatística Os resultados obtidos foram expressos com média ± erro padrão da média e analisados estatisticamente por análise de variância (ANOVA), seguido do teste de Tukey, com nível de significância inferior a 0,05.

6 RESULTADOS 8 Para investigar o efeito do extrato aquoso de M. laevigata e da cumarina na mobilização celular para o sangue periférico e para o foco da lesão em modelo experimental de peritonite, administrou-se os tratamentos concomitantemente à indução da resposta inflamatória. Os resultados apresentados na Figura 1 mostram que tanto no grupo controle, quanto no grupo tratado com extrato de M. laevigata na dose de 200 mg/kg, houve redução no número de leucócitos totais, quando comparados aos seus respectivos grupos antes da indução da inflamação, ou seja, houve redução da mobilização celular. Além disso, verificou-se que não ocorreu variação no número de leucócitos totais no grupo tratado com cumarina. Figura 1: Número de leucócitos totais no sangue periférico antes e depois da indução da peritonite. * P<0,05 vs respectivos grupos antes. Os resultados expressam a média ± e.p.m. Os resultados expressos na Figura 2, obtidos na análise total e diferencial das células no exsudato mostram que a administração de extrato aquoso de M. laevigata e cumarina nas doses de 200 e 2,5 mg/kg, respectivamente, não alteraram o recrutamento de leucócitos para a cavidade peritonial em relação à mobilização observada nos animais controles, que receberam o veículo pela mesma via.

7 9 A B C Figura 2: Número de leucócitos totais no exsudato (A); Mononucleares no exsudato (B); Polimorfonucleares no exsudato (C). Os resultados expressam a média ± e.p.m. Através da análise diferencial das células circulantes (Tabela 1) verifica-se que o recrutamento de neutrófilos e monócitos após 4 horas da indução da inflamação foi inibido nos animais tratados com extrato aquoso de M. laevigata em comparação aos animais controle e tratados com cumarina. Com relação ao perfil de linfócitos houve semelhança nos diferentes grupos depois da inflamação. Tabela 1: Contagem total e diferencial de leucócitos circulantes nos diferentes grupos de estudo. Antes PBS Extrato Cumarina Linfócitos 5370,1±399,1 1889,2±118,3 a 2611,2±251,9 b 2974±686,7 c Neutrófilos 842,4±70,8 2175,7±155,3 d 1047,7±276,3 e 2429,8±775,5 Monócitos 137,4±20,5 251,8±30,5 f 124,5±35,5 g 162,8±33,1 Total 6350±413,9 4316,7±253,5 h 3783,3±494,1 i 5566,7±1411,0 Os resultados expressam a média ± e.p.m. a P<0,01 vs antes; b P<0,01 vs PBS antes; c P<0,05 vs antes; d P<0,001 vs antes; e P<0,01 vs PBS depois; f P<0,05 vs antes; g P<0,05 vs PBS depois; h P<0,01 vs antes; i P<0,001 vs antes.

8 DISCUSSÃO 10 A inflamação aguda caracteriza-se pelo aumento de leucócitos no sangue circulante, os quais são atraídos para o local, onde desencadeiam o processo de defesa (Kumar; Abbas; Fausto, 2005). Para isso, o fluxo sanguíneo torna-se mais lento, promovendo a marginação dos leucócitos à superfície endotelial próximas à área inflamada e a migração, por junções entre as células endoteliais, em direção ao local da lesão, onde, os leucócitos, liberam substâncias armazenadas em grânulos intracelulares e secretam mediadores que, associados, irão destruir o agente lesivo e proporcionar a resolução do processo inflamatório; assim, a microcirculação retorna ao estado hemodinâmico original e o líquido e as células exsudadas voltam à circulação sanguínea geralmente pelos vasos linfáticos (Tracey, 2002; Kumar; Abbas; Fausto, 2005). A natureza do desafio antigênico e o local onde a reação ocorre são determinantes para os tipos de células encontradas, bem como a sua preponderância e fase de chegada. Em geral, o processo inicial da resposta inflamatória aguda caracteriza-se pelo aumento de neutrófilos no sangue circulante, sendo que constituem a primeira linha de defesa fisiológica, seguido dos linfócitos e monócitos (Male, 2003). Analisando os resultados encontrados neste estudo, observa-se que corroboram com os dados encontrados na literatura, visto que na análise diferencial observou-se que o número de neutrófilos apresentou-se estatisticamente aumentado no grupo que recebeu apenas o veículo, indicando que o modelo experimental de peritonite aguda, proposto para avaliar a atividade antiinflamatória, foi aplicável e efetivo; considerando que os neutrófilos são as células responsáveis pela defesa inicial diante de agentes exógenos, o aumento numérico é resposta ao estímulo promovido pela administração do glicogênio de ostra. Quando se observa a análise diferencial do sangue circulante após a indução da peritonite, verifica-se que o grupo que recebeu o extrato aquoso de M. laevigata na dose de 200 mg/kg mostrou redução do recrutamento de neutrófilos, o que evidencia a interferência do extrato sobre a mobilização de leucócitos da medula para o sangue circulante.

9 11 Outro evento relevante é a mobilização de monócitos, sendo que os estímulos inflamatórios potencializam o recrutamento destas células do sangue e, posteriormente, das reservas da medula óssea (Gordon, 2003). Ao verificar a análise diferencial do sangue circulante após a indução da inflamação, observa-se que houve um aumento significativo no número de monócitos no grupo controle, o qual recebeu PBS pela mesma via de administração, evidenciando, novamente, a efetividade do modelo utilizado. Por outro lado, a administração de extrato aquoso de M. laevigata proporcionou redução no número de monócitos, quando comparado ao grupo controle, o que justifica a inibição do recrutamento celular e, consequentemente, alteração na resposta inflamatória aguda. Suyenaga et al. (2002), verificaram que decocções de folhas e caules secos de M. laevigata nas doses de 200 mg/kg e 400 mg/kg quando administrados por via oral, possuem uma potente atividade antiedematosa, após injeção subplantar de carragenina, em ratos. Além disso, nas mesmas condições, em modelo experimental de pleurisia, observaram potente atividade antiinflamatória, através da inibição da mobilização leucocitária, sendo que a redução do número de polimorfonucleares na cavidade pleural foi de 28,26%. Em ambos os experimentos as decocções de folhas foram mais ativas do que aquelas preparadas com caules. O influxo de leucócitos polimorfonucleares, seguido do acúmulo de leucócitos no local da inflamação pode ser monitorado pela determinação do número e tipo de células que estão presentes. A avaliação da mobilização dos leucócitos do sangue circulante para o local da lesão não mostrou diferença entre os grupos controle, tratado com extrato aquoso de M. laevigata e tratado com cumarina, o que possivelmente poderia ser visto se houvesse a administração de uma segunda dose, após o glicogênio de ostra ou se a dose inicial fosse maior. Ao avaliar isoladamente o efeito da cumarina sobre a mobilização celular, verifica-se que não houve alterações significativas que possam determinar características antiinflamatórias a este metabólito neste estudo. Suyenaga et al. (2002), verificaram que as frações lipofílicas de M. laevigata não apresentam atividade sobre a inflamação aguda em modelos experimentais de edema

10 12 de pata e pleurisia, ambos induzidos por carragenina. Associando esses resultados pode-se sugerir que o efeito antiinflamatório apresentado pelo extrato aquoso de M. laevigata deve-se a presença de outro metabólito ou a um sinergismo entre os metabólitos presentes na planta, visto que, isoladamente, frações lipofílicas e cumarina não promovem alterações na mobilização celular. Com relação à toxicidade, em um estudo realizado por Graça et al. (2007a), foram observadas importantes evidências que indicam a baixa toxicidade do xarope de guaco, quando testado de maneira aguda, crônica e subcrônica em ratos por via oral. Alterações nos parâmetros hematológicos (tempo de coagulação, hemoglobina, contagem de hemácias, leucócitos e plaquetas) não foram observadas nas doses e períodos testados. Além disso, a ausência de alterações nos níveis de albumina, colesterol, triglicerídios, bilirrubina total e aminotransferase (AST e ALT), é indicativo de função hepática normal. Ácido úrico, uréia, sódio, potássio e creatinina inalterados, bem como glicemia e atividade amilásica normal, revelaram que o xarope de guaco não teve qualquer efeito sobre a função renal e pancreática. A DL50 por via oral foi estabelecida em 10 g/kg, já por via intraperitonial foi significativamente superior às doses comumente utilizadas por via oral em humanos. Um outro estudo, igualmente realizado por Graça et al. (2007b), onde ratos Wistar receberam durante 90 dias xarope de guaco por via oral, nas doses de 3,5 mg/kg, 7 mg/kg e 14 mg/kg, sugere ausência de efeitos tóxicos sobre o sistema reprodutor masculino; os parâmetros analisados foram produção, número e morfologia dos espermatozóides, alem de peso corpóreo e dos órgãos. CONCLUSÃO Através dos resultados obtidos verificou-se que o extrato aquoso de M. laevigata na dose de 200mg/kg, em modelo experimental de peritonite aguda, inibe o recrutamento de neutrófilos e monócitos da medula óssea para o sangue, no entanto não interfere na mobilização destes para o foco da lesão, mostrando assim que atua em uma das principais fases do processo inflamatório agudo, ou seja, reduzindo a mobilização de células imunocompetentes para o sangue periférico.

11 13 Com relação à cumarina, verificou-se que a dose de 2,5 mg/kg, não interfere no recrutamento celular no modelo experimental utilizado, sugerindo que o efeito antiinflamatório associado ao extrato aquoso de M. laevigata seja decorrente da presença de outro metabólito ou de um sinergismo entre os metabólitos presentes na planta. Quanto ao efeito antiinflamatório, os resultados ratificam a utilização na medicina popular. Além disso, estudos experimentais têm prestado provas de que o uso desta planta é seguro mesmo em casos de administração crônica, no entanto para a extrapolação destes resultados para humanos é imprescindível a realização de estudos complementares que corroborem o efeito e a ausência de toxicidade, considerando a restrição dos parâmetros analisados. REFERÊNCIAS Aguinaldo AM, Padolina WG, Abe F, Yamauchi T Flavonoids from Mikania cordata. Biochem. Sys. Ecol. 31: BRASIL. Resolução RDC nº 306, de 07 de dezembro de Dispõe sobre o Regulamento Técnico para o gerenciamento de resíduos de serviços de saúde. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 10 dez Disponível em: < Acesso em: 25 set Cabral LM, Dos Santos TC, Alhaique F Development of a profitable procedure for the extraction of 2-H-1- benzopyran-2-one (coumarin) from Mikania glomerata. Drug Dev. Ind. Pharm. 27: Davino SC, Giesbrecht AN, Roque NF Antimicrobial activity of kaurenoic acid derivatives substituted on carbon-15. Braz. J. Med. Biol. Res. 22:

12 14 Elisabetsky E Etnofarmacologia como ferramenta na busca de substâncias ativas. In: Simões CMO, Schenkel EP, Gosmann G, Mello JCP, Mentz LA, Petrovick PR Farmacognosia: da planta ao medicamento. 3. ed. Porto Alegre/Florianópolis: Editora UFRGS/UFSC, p Fierro IM, Silva ACB, Lopes CS, Moura RS, Barja-Fidalgo C Studies on the anti-allergic activity of Mikania glomerata. J. Ethnopharmacol. 66: Gordon S Fagócitos mononucleares na defesa imune. In: Roit I, Brostoff J, Male D Imunologia. 6. ed. São Paulo: Manole, p Graça C, Baggio CH, Freitas CS, Rattmann YD, Souza LM, Cipriani TR, Sassaki GL, Rieck L, Pontarolo R, Silva-Santos JE, Marques MCA 2007a. In vivo assessment of safety and mechanisms underlying in vitro relaxation induced by Mikania laevigata Schultz Bip. ex Baker in the rat trachea. J. Ethnopharmacol. 112: Graça C, Freitas CS, Baggio CH, Dalsenter PR, Marques MCA 2007b. Mikania laevigata syrup does not induce side effects on reproductive system of male Wistar rats. J. Ethnopharmacol. 111: Kumar V, Abbas AK, Fausto N Robbins e Cotran patologia: bases patológicas das doenças. 7. ed. Rio de Janeiro: Elsevier. Leite MGR, Souza CL, Silva MAM, Moreira LKA, Matos FJA, Viana GSB Estudo farmacológico comparativo de Mikania glomerata Sprengel (guaco), Justicia pectoralis Jacq (anador) e Torresea cearensis (cumaru). Rev. Bras. Farm. 74:

13 Male D Migração celular e inflamação. In: Roit I, Brostoff J, Male D Imunologia. 6. ed. São Paulo: Manole, p Moura RS, Costa SS, Jansen JM, Silva CA, Lopes CS, Bernardo Filho M, Silva VN, Criddle DN, Portela BN, Rubenich LMS, Araújo RG, Carvalho LCRM Bronchodilator activity of Mikania glomerata Sprengel on human bronchi and guinea-pig traquea. J. Pharm. Pharmacol. 54: Oktar BK, Yuksel M, Alican I The role of cyclooxygenase inhibition in the effect of alphamelanocyte-stimulating hormone on reactive oxygen species production by rat peritoneal neutrophils. Prostaglandins Leukot. Essen. Fatty Acids 71: 1-5. Oliveira F, Alvarenga MA, Akisue G, Akisue MK Isolamento e identificação de componentes químicos de Mikania glomerata Sprengel e Mikania laevigata Schultz Bip. Ex. Baker. Rev. Farm. Bioquim. 20: Pereira FEL, Bogliolo L Inflamação. In: Brasileiro Filho G Bogliolo patologia geral. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p Presibella MM, Santos CAM, Weffort-Santos AM Influência de extratos hidroetanólicos de plantas medicinais sobre a quimiotaxia de leucócitos humanos. Rev. Bras. Farmacogn. 13: Rates SMK Promoção do uso racional de fitoterápicos: uma abordagem no ensino de farmacognosia. Rev. Bras. Farmacogn. 11:

14 16 Sosa S, Balick MJ, Arvigo R, Esposito RG, Pizza C, Altinier G, Tubaro A Screening of the topical antiinflammatory activity of some Central American plants. J. Ethnopharmacol. 81: Suyenaga ES, Reche E, Farias FM, Schapoval EES, Chaves CGM, Henriques AT Antiinflammatory investigation of some species of Mikania. Phytother. Res. 16: Teske M, Trentini AMM Herbarium - Compêndio de fitoterapia. 3. ed. Curitiba: Herbarium Laboratório Botânico. Tracey KJ The inflammatory reflex. Nature 420: