UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO UNINOVE MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO

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1 UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO UNINOVE MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO MECÂNICA DOS MÚSCULOS PAPILARES E DO REMODELAMENTO CARDÍACO DE RATOS IDOSOS SUBMETIDOS AO TREINAMENTO FÍSICO AERÓBICO THIAGO RODRIGUES DE ARAÚJO São Paulo 2010

2 THIAGO RODRIGUES DE ARAÚJO AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO MECÂNICA DOS MÚSCULOS PAPILARES E DO REMODELAMENTO CARDÍACO DE RATOS IDOSOS SUBMETIDOS AO TREINAMENTO FÍSICO AERÓBICO. Dissertação apresentada à Universidade Nove de Julho para obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação. Orientador: Prof. Dr. José Antônio Silva Júnior São Paulo 2010

3 3 FICHA CATALOGRAFICA Araújo, Thiago Rodrigues de Avaliação da função mecânica dos músculos papilares e do remodelamento cardíaco de ratos idosos submetidos ao treinamento físico aeróbico. / Thiago Rodrigues de Araújo f. Dissertação (mestrado) Universidade Nove de Julho UNINOVE Ciências da Reabilitação, São Paulo, Orientador (a): Prof. Dr. José Antônio Silva Júnior 1. Contratilidade Miocérdica. 2. Envelhecimento. 3. Exercício Físico. CDU 615.8

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5 5 RESUMO O envelhecimento existe deterioração progressiva da função de diferentes sistemas do organismo, onde há um processo gradual de remodelamento estrutural, celular e molecular. Assim, parece razoável aceitar que medidas de interrupção ou abrandamento da depressão inotrópica miocárdica são altamente recomendadas. Neste cenário, há informações disponíveis que permitem considerar o exercício físico como ferramenta não farmacológica altamente recomendável. Assim, a proposta deste estudo foi avaliar o papel do exercício físico aeróbio realizado em piscina sob a depressão da contratilidade miocárdica associada ao envelhecimento. Foram utilizados 39 ratos machos com 24 meses de vida (idosos) da linhagem Wistar divididos em dois grupos, o treinado (n=25) e o sedentário (n=14). O treinamento consistiu em um protocolo de natação em piscina aquecida durante 6 semanas, sendo a primeira semana de adaptação. Os animais do grupo treinado eram submetidos ao treino de 1h30min/dia, 6 dias/semana. Após o período de treinamento, os animais foram sacrificados e o coração foi pesado e dissecado para análise da ação mecânica dos músculos papilares do coração contraindo isometricamente. Foram determinadas as variáveis funcionais no comprimento ótimo L, tensão desenvolvida (TD), tensão de repouso (TR), taxa máximas da variação da máx tensão desenvolvida positiva (+dt/dt) e negativa (-dt/dt), tempo para atingir o pico da tensão desenvolvida (TPT) e o tempo para a tensão desenvolvida decrescer 50% do seu valor máximo (TR 50% ). Os animais idosos treinados apresentaram significante hipertrofia cardíaca bi-ventricular, aumento da capacidade funcional, melhoria do inotropismo miocárdico, geração de força e relaxamento, além de redução do conteúdo de colágeno e aumento do volume nuclear dos cardiomiócitos. Com base nos resultados obtidos, podemos concluir que o treinamento físico induziu o aprimoramento da função mecânica e do remodelamento cardíaco de ratos idosos submetidos ao treinamento físico moderado.

6 Palavras-chave: Contratilidade Miocárdica; Envelhecimento; Exercício Físico 6

7 7 ABSTRACT Aging awakens progressive deterioration of function of different organ systems, where there is a gradual process of structural remodeling, cellular and molecular levels. Thus, it seems reasonable to accept that measures interrupting or slowing of inotropic myocardial depression are highly recommended. In this scenario, there is information available that allow us to consider exercise as pharmacological tool highly recommended. Thus, the purpose of this study was to evaluate the role of physical exercise performed in a pool under the depression of myocardial contractility associated with aging. We used 39 male rats with 24 months (aged) Wistar divided into two groups, the trained (n = 25) and sedentary (n = 14). The training protocol consisted of swimming in a heated pool for 6 weeks, being the first week an adaptation period. Animals in the trained group were subjected to training 1h30min/dia, 6 days/week. After the training period, animals were sacrificed and the heart was weighed and dissected for analysis of the mechanical action of the papillary muscles contracting isometrically heart. Functional variables were determined at optimum length - Lmax, developed tension (DT), resting tension (RT), maximum rate of change of developed tension positive (+ dt/dt) and negative (-dt/dt), time to achieve peak tension (TPT) and time to the tension developed to decrease 50% of its maximum value (TR50%). Aged animals showed significant cardiac hypertrophy trained bi-ventricular functional capacity, improvement of myocardial inotropism, force generation and relaxation, and reduction of collagen content and increased nuclear volume of cardiomyocytes. Based on these results, we conclude that exercise training induced enhancement of mechanical function and cardiac remodeling in aged rats subjected to physical training.

8 Keywords: Myocardial contractility, Aging, Physical exercise 8

9 9 DEDICATÓRIA Tudo o que um sonho precisa para ser realizado é alguém que acredite que ele possa ser realizado. Roberto Shinyashik

10 10 Dedico este trabalho primeiramente a Deus, pois sem Ele nada seria possível e não estaríamos aqui reunidos, desfrutando juntos, destes momentos que nos são tão importantes, o qual foi O primeiro quem confiou em mim. Aos meus pais Valdison e Aparecida pelo esforço, dedicação e compreensão, em todos os momentos desta e de outras caminhadas. E especial minha mãe Aparecida que, primeiro do que tudo quero dizer que te amo muito. Meus olhos se enchem de lágrimas quando me lembro dos momentos felizes que passamos juntos, e o seu maior sonho era que eu chegasse até aqui, só que infelizmente Deus quis levar na hora certa, mas foi a senhora quem confiou e lutou para que esse mestrado se realizasse, e de onde a senhora esteja está muito feliz com essa caminhada na qual esteve todos os momentos ao meu lado. Aos professores e especialmente ao Prof. Dr. José Antonio Silva Jr., que não foi apenas um professor e sim um pai que me ajudou em todas as áreas, principalmente nos momentos em que eu nem tinha condição de ficar em São Paulo. Ao senhor eu dedico não só esse mestrado, e sim toda a minha gratidão por tudo que fez comigo, pela contribuição dentro de diversas áreas para o desenvolvimento de minha dissertação, e por toda dedicação e empenho que demonstrou no decorrer das atividades. Dedico este trabalho à minha irmã Karla e à minha sobrinha Maria Eduarda, pelo incentivo, cooperação e apoio, e toda minha família que compartilharam comigo os momentos de tristezas e também de alegrias, nesta etapa, em que, com a graça de Deus está sendo vencida; principalmente à minha irmã Karla, que não foi só minha irmã, e sim minha mãe: a você minha irmã lhe dedico a minha vida, te amo. Aos meus colegas de trabalho Marcelo, Moisés, Eduardo, Dannylo, Danilo e Edinei, pelos momentos de aprendizagem constante e pela amizade solidificada

11 11 ao longo deste trabalho que certamente se eternizará, e em especial aos amigos Prof. Dr. Paulo Tucci e Andrey Serra, que me ajudaram muito neste trabalho e me ensinaram tudo o que sabem com muita dedicação. Eu dedico esse trabalho à minha esposa Aline, o meu anjo vigilante, que a toda hora e todo dia me animou e deu-me força, servindo de companhia; e ao meu filho que ainda está por vir, Guilherme, o qual será muito amado. A todos os professores do Mestrado em Ciências da Reabilitação da Uninove e aos colegas de mestrado. À Juliana Ribeiro, Camila Camarão e Cristiane Taborda pelo auxílio e dedicação. À CAPES, FAPESP, CNPq e UNINOVE pelo auxílio financeiro para o desenvolvimento deste estudo.

12 12 ÍNDICE 1. Contextualização Objetivo Artigo submetido para publicação Discussão Conclusão Referências Bibliográficas...51

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14 14 1. CONTEXTUALIZAÇÃO É concebível que o avanço da idade predispõe ao desenvolvimento de anormalidades cardiovasculares. De particular interesse são modificações bem estabelecidas na estrutura e função do miocárdio. De fato, mesmo comum ao processo de envelhecimento, o remodelamento miocárdico pode culminar em depressão da função ventricular e reduzida capacidade tolerante dos cardiomiócitos a diferentes situações de estresse. O exercício físico (EXF) é amplamente aceito como terapia não farmacológica de intervenção para promoção de saúde, melhoria da qualidade de vida e prevenção e/ou controle de certas doenças cardiovasculares. Assim, não é insensato pensar que os benefícios do EXF possam ser legítimos também no miocárdio envelhecido. Neste sentido, há evidências que permitem advogar a favor do EXF. De interesse, são os efeitos favoráveis do EXF sob as propriedades funcionais do miocárdio. Realmente, ensaios experimentais têm providenciado resultados altamente relevantes, ilustrando que animais idosos submetidos a processo de treinamento físico aeróbio apresentam melhora na contratilidade miocárdica. Os estudos da mecânica da contração muscular desenvolvidos em músculos esqueléticos inspiraram a aplicação de técnica equivalente ao miocárdio, possibilitando avaliar a capacidade funcional do músculo cardíaco isento de influências dos fatores atuantes na cavidade ventricular. Nos anos 60 e 70, amostras isoladas de miocárdio passaram a ser utilizadas em investigações

15 15 experimentais sobre contração do músculo cardíaco e permitiram expressivos avanços no conhecimento da ação mecânica do miocárdio normal e patológico.

16 16 2. OBJETIVO Objetivo Geral: Avaliar se o Exercício Físico aeróbio regular contribui para a melhoria da função cardíaca. Objetivos Específicos: Avaliar parâmetros como o conteúdo de colágeno intersticial e análise da ação mecânica dos músculos papilares do coração contraindo isometricamente. em ratos idosos machos submetidos ao treinamento físico.

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18 18 3. ARTIGO SUBMETIDO PARA PUBLICAÇÃO Avaliação da função mecânica dos músculos papilares e do remodelamento cardíaco de ratos idosos submetidos ao treinamento físico aeróbico Thiago Rodrigues de Araújo a, Eduardo Tadeu Santana a, Ednei Antonio b, Andrey Jorge Serra a, Paulo J Tucci b, Jose Antonio Silva Júnior a a Departamento de Ciências da Reabilitação. Universidade Nove de Julho. UNINOVE. Brasil. b Departamento de Patologia. Universidade Federal de São Paulo. UNIFESP. Brasil. Autor correspondente: Jose Antonio Silva Jr (josejr@uninove.br) Resumo O envelhecimento desperta deterioração progressiva da função de diferentes sistemas do organismo, onde há um processo gradual de remodelamento estrutural, celular e molecular. Assim, parece razoável aceitar que medidas de interrupção ou abrandamento da depressão inotrópica miocárdica são altamente recomendadas. Neste cenário, há informações disponíveis que permitem considerar o exercício físico como ferramenta não farmacológica altamente recomendável. Assim, a proposta deste estudo foi avaliar o papel do exercício físico aeróbio realizado em piscina sob a depressão da contratilidade miocárdica associada ao envelhecimento. Foram utilizados 39 ratos machos com 24 meses de vida (idosos) da linhagem Wistar divididos em dois grupos, o treinado (n=25) e o sedentário (n=14). O treinamento consistiu em um protocolo de natação em piscina aquecida durante 6 semanas, sendo a primeira semana de adaptação. Os animais do grupo treinado eram submetidos ao treino de 1h30min/dia, 6 dias/semana. Após o período

19 19 de treinamento, os animais foram sacrificados e o coração foi pesado e dissecado para análise da ação mecânica dos músculos papilares do coração contraindo isometricamente. Foram determinadas as variáveis funcionais no comprimento ótimo L, tensão desenvolvida (TD), tensão de repouso (TR), taxa máximas da variação da máx tensão desenvolvida positiva (+dt/dt) e negativa (-dt/dt), tempo para atingir o pico da tensão desenvolvida (TPT) e o tempo para a tensão desenvolvida decrescer 50% do seu valor máximo (TR 50% ). Os animais idosos treinados apresentaram significante hipertrofia cardíaca bi-ventricular, aumento da capacidade funcional, melhoria do inotropismo miocárdico, geração de força e relaxamento, além de redução do conteúdo de colágeno e aumento do volume nuclear dos cardiomiócitos. Com base nos resultados obtidos, podemos concluir que o treinamento físico induziu o aprimoramento da função mecânica e do remodelamento cardíaco de ratos idosos submetidos ao treinamento físico moderado. Palavras-chave: Contratilidade Miocárdica; Envelhecimento; Exercício Físico Abstract Aging awakens progressive deterioration of function of different organ systems, where there is a gradual process of structural remodeling, cellular and molecular levels. Thus, it seems reasonable to accept that measures interrupting or slowing of inotropic myocardial depression are highly recommended. In this scenario, there is information available that allow us to consider exercise as pharmacological tool highly recommended. Thus, the purpose of this study was to evaluate the role of physical exercise performed in a pool under the depression of myocardial contractility associated with aging. We used 39 male rats with 24 months (aged) Wistar divided into two groups, the trained (n = 25) and sedentary (n = 14). The training protocol consisted of swimming in a heated pool for 6 weeks, being the first week an adaptation period. Animals in the trained group were

20 20 subjected to training 1h30min/dia, 6 days/week. After the training period, animals were sacrificed and the heart was weighed and dissected for analysis of the mechanical action of the papillary muscles contracting isometrically heart. Functional variables were determined at optimum length - Lmax, developed tension (DT), resting tension (RT), maximum rate of change of developed tension positive (+ dt/dt) and negative (-dt/dt), time to achieve peak tension (TPT) and time to the tension developed to decrease 50% of its maximum value (TR50%). Aged animals showed significant cardiac hypertrophy trained bi-ventricular functional capacity, improvement of myocardial inotropism, force generation and relaxation, and reduction of collagen content and increased nuclear volume of cardiomyocytes. Based on these results, we conclude that exercise training induced enhancement of mechanical function and cardiac remodeling in aged rats subjected to physical training. Keywords: Myocardial contractility, Aging, Physical exercise Introdução Sob a luz de estudos experimentais, há fortes evidências que apoiam a existência de estrita relação entre envelhecimento e contratilidade miocárdica deprimida 1,2. Relatos análogos da literatura, em que preparações musculares isoladas de corações de roedores foram consideradas para as avaliações, caracterizam com exatidão o efeito prejudicial do envelhecimento sob a contratilidade miocárdica. 3,4 Apesar de pouco compreendidos, certos fatores podem ser responsabilizados pela redução da capacidade contrátil do miocárdico com o envelhecimento. Destaque-se decréscimo do número de cardiomiócitos viáveis, hipertrofia anormal das células remanescentes, aumento na deposição de colágeno intersticial, alterações no potencial de ação e inadequado transiente de

21 21 cálcio intracelular decorrente de modificações no conteúdo e atividade de proteínas envolvidas na cinética do cálcio e na sinalização via receptores acoplados a proteína G. 5,6,7,8,9 Leblanc et al. 10 avaliaram a contratilidade miocárdica em preparações de músculos papilares isolados de roedores machos e fêmeas e caracterizaram que após o quarto mês de vida o gênero masculino apresentava capacidade contrátil superior às fêmeas. Grandy & Howllet 8, trabalhando com cardiomiócitos isolados de rato, observaram que a capacidade de encurtamento celular foi reduzida somente em animais machos idosos, sendo as fêmeas não afetadas pelo envelhecimento. Em outro estudo conduzido em macacos, a redução da contratilidade miocárdica associada ao envelhecimento também foi evidente unicamente no gênero masculino. 11 Em adição, os mecanismos celulares, moleculares e gênicos determinantes para a ocorrência de depressão contrátil diferencial em acordo com o gênero permanecem por ser elucidados. Ao se considerar importante a manutenção da capacidade contrátil do miocárdico para homeostasia da função ventricular durante o envelhecimento, é concebível que a adoção de medidas preventivas de depressão do inotropismo miocárdico seja fortemente recomendada. O exercício físico (EXF) é amplamente aceito como terapia não farmacológica de intervenção para promoção de saúde, melhoria da qualidade de vida e prevenção e/ou controle de certas doenças cardiovasculares. 12 Assim, não é insensato pensar que os benefícios do EXF possam ser legítimos também no miocárdio envelhecido. Neste sentido, há evidências que permitem advogar a favor do EXF.

22 22 De interesse, são os efeitos favoráveis do EXF sob as propriedades funcionais do miocárdio. Realmente, ensaios experimentais têm providenciado resultados altamente relevantes, ilustrando que animais idosos submetidos a processo de treinamento físico aeróbio apresentam melhora na contratilidade miocárdica. 13,14 Os avanços neste campo de investigação permitiram, ainda, identificar possíveis mecanismos envolvidos no aprimoramento da contratilidade miocárdica, em que se destacam atenuação na deposição de colágeno 15,16, aumento da angiogênese 17, maior responsividade beta-adrenérgica 17 e elevação de proteínas envolvidas na cinética do cálcio. 18 Os estudos da mecânica da contração muscular desenvolvidos em músculos esqueléticos inspiraram a aplicação de técnica equivalente ao miocárdio, possibilitando avaliar a capacidade funcional do músculo cardíaco isento de influências dos fatores atuantes na cavidade ventricular. Em trabalho pioneiro de Ullrick & Whitehorn 19, e mais tarde, consolidando essa preparação, Kelly et al 20 utilizaram preparações de músculos papilares para analisar as propriedades mecânicas do músculo cardíaco. A partir desta época, amostras isoladas de miocárdio passaram a ser utilizadas em investigações experimentais sobre contração do músculo cardíaco e permitiram expressivos avanços no conhecimento da ação mecânica do miocárdio normal e patológico. O uso de amostras musculares isoladas para avaliações do estado contrátil, ou contratilidade miocárdica, inclui vantagens sobre estudos que se realizam no coração como um todo, sejam corações in situ ou corações isolados. Os estudos conduzidos em músculos papilares são isentos dos inconvenientes mencionados para as câmaras cardíacas e possibilitam abordagem adequada do estado

23 23 contrátil do miocárdio. Este método inclui características bastante favoráveis para se analisar a capacidade contrátil muscular, tais como a possibilidade de controle estrito do comprimento em repouso das miofibrilas e das cargas a que o miocárdio é submetido, além de avaliações precisas do montante de força desenvolvida ou do encurtamento miocárdico durante a contração e Avaliar se o Exercício Físico aeróbio regular contribui para a melhoria da função cardíaca, como a cardioproteção que inclui a redução de colágeno intersticial e geração de cardiomiócitos e o aprimorameto do relaxamento cardíaco em ratos idosos machos submetidos ao treinamento físico. MATERIAL E MÉTODOS Animais Foram utilizados 39 ratos machos (Rattus norvergicus albinus, Rodentia Mammalia), idosos com 24 meses da linhagem Wistar, pesando entre 500 a 600 gramas, provenientes do Biotério Central da Universidade Nove de Julho (UNINOVE). Os animais foram mantidos em caixas plásticas, em ambiente com controle de luz e temperatura, servindo-se ad libitum de água e ração Nuvital (Nuvilab). Em cada caixa foram mantidos, no máximo, cinco ratos. Que foram divididos randomizadamente em treinados e sedentários, e o protocolo de treinamento de natação foi realizado em piscina aquecida entre 32 e 33 graus,e foram de seis semanas de (90 minutos) sendo a primeira semana de adaptação.

24 24 Estudo da função mecânica de músculos papilares Para a realização do estudo os animais foram anestesiados com solução de uretana (400 mg/kg de peso corporal) injetada por via introperitoneal. Após toracotomia mediana, os corações foram retirados imediatamente e colocados em solução de Krebs-Henseleit previamente aquecida a 29 o C e borbulhada com oxigênio. A parede livre do ventrículo direito foi extirpada com o objetivo de expor o septo interventricular, que foi dividido ao meio para exposição dos dois músculos papilares do ventrículo esquerdo. Os corações foram rapidamente transferidos para placa de Petri contendo solução de Krebs-Henseleit adequadamente oxigenada e aquecida a 29 o C e os músculos papilares anterior e posterior foram cuidadosamente dissecados. Cada extremidade dos músculos foi fixada por anéis de aço inoxidável. Em seguida, os músculos foram transferidos para câmara de vidro e permaneciam submersos em solução de Krebs-Henseleit constantemente oxigenada por borbulhamento e mantida em temperatura controlada de 29 o C. Um dos anéis foi fixado a gancho existente no fundo da câmara de vidro e o outro foi ligado à extremidade de transdutor de força (Grass, modelo FT 03) por meio de fio de aço inoxidável. O transdutor de força foi conectado a micromanipulador Mitutoyo, modelo 2046F, que permitia deslocamentos verticais de 10 micrômetros/volta. A composição da solução de Krebs-Henseleit, em milimoles por litro, foi de 132 NaCl; 4,69 KCl; 1,5 CaCl; 1,16 MgSO ; 1,18 KH PO ; 5,50 glicose, insulina 10 U e 20 de HEPES como tampão. A pressão parcial de oxigênio da solução foi mantida entre 550 e 600 mmhg. Paralelamente ao músculo papilar existiam dois eletrodos de platina que

25 25 liberavam ativação de campo gerada por estimulador DV&M, modelo ESF-10. Os estímulos elétricos eram liberados em ondas quadradas com duração de 5 ms e voltagem aproximadamente 10 a 15% maior que o mínimo necessário para provocar resposta mecânica máxima do músculo, sob freqüência de 0,2 Hz. Durante período de 60 minutos os músculos foram deixados contrair isotonicamente contra pré-carga baixa. A contração isotônica foi possibilitada pela existência de mola entre o anel superior e o transdutor, de modo a permitir a ocorrência de encurtamento miocárdico. Cada mola tinha tensão nominal de 0,3 gramas/cm. Em seguida, a mola foi retirada do sistema e as contrações passavam a ser isométricas. Os músculos permaneciam em contração isométrica durante 20 minutos para que a estabilização da preparação fosse alcançada. Com auxilio do micromanipulador o músculo foi cuidadosamente estirado até atingir o ápice da curva comprimento/tensão: comprimento diastólico do músculo no qual a tensão isométrica desenvolvida atinge valor máximo (L ). Definido o estiramento do máx músculo que propiciava o maior valor da tensão desenvolvida, mediu-se o seu comprimento com auxílio de paquímetro Mitutoyo. Após a determinação de L os músculos permaneceram em contração máx isométrica por 20 minutos e consideravam-se os dados funcionais verificados nestas condições como os valores correspondentes a 100% L. Seguindo-se, máx foram determinados os valores das variáveis em comprimentos correspondentes a 92%, 94%, 96%, 98% de L, possibilitando a determinação da curva max estiramento-tensão desenvolvida (relação de Frank-Starling) para cada músculo.

26 26 Os parâmetros da função contrátil analisados foram: 1. TD máx : tensão máxima desenvolvida isometricamente; 2. TR: tensão de repouso; 3. dt/dt: taxa da variação da tensão desenvolvida, sendo consideradas a taxa positiva (+dt/dt) e negativa (-dt/dt) máximas, que informam a variação temporal da força durante a contração e o relaxamento, respectivamente; 4. TPT: tempo para atingir o pico da tensão desenvolvida, ou seja, o tempo decorrido desde o inicio da contração até que seja atingido o pico de tensão desenvolvida; máximo. 5. TR50%: tempo para a tensão desenvolvida decrescer 50% do seu valor Terminadas as manobras de avaliação da mecânica miocárdica, os músculos eram retirados do sistema, o segmento contido entre os anéis de aço era isolado e pesado em balança Fisher Scientific, modelo OCCU-124.

27 27 Protocolos experimentais Os experimentos foram conduzidos aos pares. Em todos os experimentos, cada par de músculos foi constituído pelo papilar anterior e pelo papilar posterior do mesmo coração. Esta programação possibilitou comparar o desempenho mecânico do miocárdio do mesmo coração, caracterizando, em separado, a função mecânica dos papilares anterior e posterior. Cada músculo era colocado em uma cuba individual e as características funcionais avaliadas simultaneamente. Todos os procedimentos foram reproduzidos de Bocalini etal. 21. O transcurso das experiências mostrou que as áreas de secção dos músculos papilares anteriores e posteriores eram muito semelhantes, de tal forma que características biométricas diferentes só seriam possíveis por variações dos comprimentos dos músculos. Esta verificação condicionou a condução dos experimentos de modo a constituir dois protocolos. Os músculos foram dissecados e as extremidades fixadas pelos anéis de aço que prendiam o músculo papilar posterior eram intencionalmente colocados em posições adequadas para que parte do comprimento do músculo fosse excluída da análise. Com esta manobra procurou-se restringir a massa miocárdica do papilar posterior participante da contração, de modo que a quantidade de miocárdio do papilar anterior que participou da contração foi maior do que a do papilar posterior. Os valores verificados para as variáveis que envolvem força foram avaliados em seus valores absolutos e normalizados segundo a sistemática tradicional pela área de secção e pela massa de miocárdio participante da contração, expressa pelo peso (em miligramas) do músculo.

28 28 Os dados verificados para a tensão de repouso, quando projetados em função dos diversos comprimentos em repouso, foram ajustados por equação exponencial do tipo muscular. y = β 0. e β1x + εi onde β o, β 1 e ε i são constantes da curva. A constante β 1 expressa a rigidez Análise estatística A análise estatística foi conduzida com o Teste t Student não pareado unicaudal. A única mudança no uso do teste concerne aos dados provenientes do teste de esforço. Para tal, foi utilizado o Teste t pareado de Student. O nível de significância adotado foi de 5% (p<0,05). Os dados são apresentados como médio ± erro padrão da média. Os valores de p estão dispostos nas próprias figuras. RESULTADOS Dados Biométricos Os animais treinados (MT) apresentaram significante hipertrofia cardíaca comparados aos animais que permaneceram sedentários (MC, Figura 1A). Foi verificado também que o padrão de hipertrofia miocárdica foi bi-ventricular de

29 29 acordo com a normalização do peso do coração e peso corpóreo dos animais (Figura 1B, 1C). A B C D Figura 1. A. Índice cardíaco de animais idosos não treinados (MC) e animais idosos treinados (MT). B. Índice do ventrículo direito (VD) de animais idosos não treinados (MC) e animais idosos treinados (MT). C. Índice do ventrículo esquerdo (VE) de animais idosos não treinados (MC) e animais idosos treinados (MT). D. Pesos úmido e seco dos pulmões de animais idosos não treinados (MC) e animais idosos treinados (MT) e medida do teor de água. *p<0,05. Calculou-se também o peso do pulmão seco e úmido do pulmão para verificar se houve uma congestão pulmonar, o que poderia gerar uma disfunção

30 30 cardíaca, mas no estudo demonstrou que este parâmetro está dentro dos padrões de normalidades que em ratos é ate 79% (Figura 1D). Teste de esforço O teste de esforço mostrou que o treinamento físico foi efetivo em induzir melhora na capacidade funcional dos animais (Figura 2). Antes do treinamento, os ratos idosos apresentavam capacidade máxima de esforço de 60 segundos, sendo que após o treino, a capacidade funcional dos ratos idosos foi de 130 segundos. Figura 2. Análise da eficácia do protocolo de treinamento adotado na melhoria da capacidade funcional de ratos idosos. *p<0,05. Análise dos músculos papilares em estiramento máximo A Figura 3A caracteriza com exatidão que houve aprimoramento do inotropismo miocárdico após a realização do exercício, em que músculos de animais treinados foram aptos a gerar mais tensão que músculos de animais sedentários. Em 3B e 3C, nota-se que a velocidade de geração de força e relaxamento dos músculos dos animais idosos também foi aprimorada com o treinamento físico.

31 31 A B C Figura 3. Análise do inotropismo miocárdio dos músculos papilares de ratos idosos sedentários e idosos. *p<0,05 Análise da tensão desenvolvida pelos músculos papilares A figura 4 provém de experimento realizado em músculos papilares em solução de banho com elevado conteúdo de cálcio. A interpretação conduz ao fato que a sensibilidade dos miofilamentos contráteis ao cálcio foi significativamente melhorada nos animais idosos submetidos ao processo de treinamento Figura 4. Variação da tensão desenvolvida pelos músculos papilares de ratos idosos sedentários e idosos. *p<0,05 A Figura 5 caracteriza o mecanismo de Frank-Starling, em que a força desenvolvida dos músculos papilares foi avaliada como uma função dos diferentes

32 32 estiramentos musculares. A análise foi conduzida com curvas de comprimento/tensão musculares traçadas pela seguinte equação monoexponencial: y= β 0 e β1x + i, onde β 0, β 1 e i são as constantes da curva. Da equação derivam os valores de slope (que são indicadores de inclinação da reta) para os diferentes grupos. Nota-se que a inclinação da reta do grupo treinado é mais deslocada para a esquerda, enquanto que, a reta do grupo não treinado desloca-se mais para a direita. Tal comportamento indica que o mecanismo de Frank-Starling foi aprimorado após o treinamento, indicando que a sensibilidade dos miofilamentos contráteis ao estiramento está aprimorada. Figura 5. Comportamento da tensão desenvolvida pelos músculos papilares de ratos idosos sedentários e idosos. *p<0,05 Análise do conteúdo de colágeno do ventrículo esquerdo O acúmulo anormal de colágeno no miocárdio, que se constitui num dos aspectos mais característicos da remodelação miocárdica, ainda não é totalmente

33 33 esclarecida. Em tese, esse desvio está condicionado ao desequilíbrio entre a produção e a degradação do colágeno, com predomínio do primeiro processo. Como mostrado na Figura 6, os ratos treinados apresentaram significante redução no conteúdo de colágeno no ventrículo esquerdo em comparação com os ratos sedentários. Colágeno total (%) Sedentários Treinados Figura 6. Conteúdo de colágeno total em ventrículo esquerdo de ratos idosos sedentários e idosos. *p<0,05 Análise do volume nuclear dos cardiomiócitos A mensuração do volume nuclear de cardiomiócitos é um importante marcador de hipertrofia celular. O grupo de ratos treinados apresentou aumento significativo do volume nuclear em relação aos animais sedentários (Figura 7).

34 Volume Nuclear (μm 3 ) Sedentários Treinados Figura 7. Volume nuclear de cardiomiócitos de ratos idosos sedentários e idosos. *p<0,05 DISCUSSÃO Em que pese a importância do exercício físico (EXF) como terapia não farmacológica de intervenção para promoção de saúde, melhoria da qualidade de vida e prevenção e/ou controle de certas doenças cardiovasculares 12, não é insensato pensar que os benefícios do EXF possam ser legítimos também no miocárdio envelhecido 22,23. Nosso dados corroboram achados anteriores da literatura 24, em que o EXF mostrou reduzir o peso corporal de ratos senescentes. Também derivam de nossos resultados a confirmação que animais senescentes exercitados desenvolvem hipertrofia miocárdica 24,9 (Figura 1). Acresça-se a informação que o processo hipertrófico induzido pelo EXF ocorreu em ambas as câmaras ventriculares, direita e esquerda. Ao considerar a razão entre massa miocárdica e peso corporal como indicadora de hipertrofia celular, é aceitável que a veracidade deste procedimento

35 35 de indexação fica comprometida em circunstâncias de alteração do peso corporal do animal, como em nossos casos. Assim, desde que o aumento nuclear está associado com hipertrofia celular 25, o crescimento dos cardiomiócitos nos ratos exercitados foi confirmado pela análise do volume nuclear. Tais achados também corroboram estado hipertrófico do miocárdio despertado pelo EXF. Seguinte a avaliação biométrica do coração, em uma análise microscópica sob lâminas contendo fragmentos de tecido ventricular esquerdo incubados com picro-sirius red, preconizou-se a avaliação do conteúdo de colágeno miocárdico. Esta abordagem se fez necessária na medida em que o papel do EXF neste cenário ainda é irresoluto. Thomas et al 26 observaram que dez semanas de EXF em esteira não afetaram o aumento de colágeno intersticial evocado pelo envelhecimento. Contudo, em nossos casos, seis semanas de treinamento em piscina resultaram em significativa diminuição do conteúdo colágeno no miocárdio ventricular esquerdo de roedores idosos exercitados. É importante considerar que estes achados não são exclusivos aos nossos casos e, assim, corrobora informações precedentes divulgadas por outros investigadores 16. De interesse, são os efeitos favoráveis do EXF sob as propriedades funcionais intrínsecas do miocárdio senescente. Experimentos iniciais despertaram novas perspectivas acerca da importância do EXF no combate a depressão inotrópica miocárdica ligada ao envelhecimento. O primeiro trabalho, por nós localizado, que avaliou a influência do EXF sobre a depressão contrátil induzida pelo envelhecimento, foi o de Li et al Os autores verificaram que ratos senescentes treinados em esteira por período de 16 semanas apresentaram reversão da duração prolongada da contração isométrica de músculos papilares.

36 36 Posteriormente, Tate et al. 14 corroboraram achados anteriores, demonstrando que dez semanas de exercício em esteira resultaram em apreciável melhora da contratilidade miocárdica em animais senescentes. Realmente, ensaios experimentais têm providenciado resultados altamente relevantes, ilustrando que animais idosos submetidos a processo de treinamento físico apresentam melhora na contratilidade miocárdica. Contudo, ainda há certa indefinição, sobretudo pelo fato de existirem estudos que não demonstraram benefícios advindos com o EXF em ratos senescentes. É válido mencionar o estudo de Taffet et al 28, em que o inotropismo de músculos papilares isolados não foi significativamente melhorado em animais senescentes exercitados. Neste trabalho também nos valemos do emprego de preparação de músculos papilares trabalhando isoladamente para análise da função miocárdica. Os valores de indicadores de capacidade inotrópica, tensão desenvolvida e taxa de aumento máximo da tensão desenvolvida, possibilitaram estabelecer o potencial salutar do EXF para aumento da capacidade contrátil do miocárdio senescente. Acresça-se informações provenientes da taxa de decaimento máximo da tensão desenvolvida, em que valores mais elevados foram observados somente nos animais exercitados, portanto, configurando um estado de relaxamento miocárdico aprimorado. Em adição, o protocolo experimental de preparação de músculos papilares in vitro possibilitou caracterizar a sensibilidade dos miofilamentos ao mecanismo de Frank-Starling, isto é, a intensificação da tensão desenvolvida promovida pelo estiramento muscular. Consequentemente, quando se analisaram as retas de estiramento-tensão ativa (Figura 5), foi evidenciado que os

37 37 estiramentos musculares acentuaram menos a tensão desenvolvida nos papilares dos animais sedentários. Inversamente, as inclinações das retas provenientes da relação estiramento muscular e tensão desenvolvida dos animais senescentes exercitados foram sugestivas de melhora do mecanismo de Frank-Starling. Apesar de nós não termos analisado os possíveis mecanismos responsáveis pelo aprimoramento da contratilidade miocárdica, destacam-se as já reconhecidas ações do EXF sobre a melhora da sensibilidade dos miofilamentos ao cálcio 29,30,31 e o aumento da expressão da cadeia leve da miosina no miocárdio 32. Particular a ratos senescentes, o aprimoramento do inotropismo miocárdico têm sido associado a aumento da angiogênese 17, maior responsividade a estimulação beta-adrenérgica 9, elevação do conteúdo tecidual de proteínas envolvidas na cinética do cálcio 18 e redução da apoptose dos cardiomiócitos 33. Há a se considerar que o acúmulo de colágeno pode piorar a distensibilidade e prejudicar a transmissão de força entre os cardiomiócitos em contração 34,35,36, é possível deduzir que o menor teor de colágeno intersticial nos animais exercitados possa contribuir ao menos para a manutenção do inotropismo. Em suma, as informações precedentes fundamentam o posicionamento de que o EXF pode ser considerado como intervenção não farmacológica efetiva para prevenção/atenuação das adversidades contráteis cardíacas associadas ao envelhecimento. Neste sentido, o efeito cardioprotetor do EXF foi observado em amplo aspecto e incluiu redução do colágeno intersticial, aumento da geração de força pelos cardiomiócitos e aprimoramento do relaxamento miocárdico.

38 38 REFERÊRENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1.Lakatta EG, Sollot SJ. Perspectives on mammalian cardiovascular ageing: humans to molecules. Com Biochem Physiol A Mol Integr Physiol, 132: , Taylor RP, Starnes JW. Age, cell signalling and cardioprotection. Acta Physiol Scand, 178: , Capasso JM, Remily RM, Sonnenblick EH. Age-related differences in excitationcontraction coupling in rat papillary muscle. Basic Res Cardiol, 78: , Kiriazis H, Gibbs CL. Effects of ageing on the activation metabolism of rat papillary muscles. Clin Exp Pharm Physiol, 28: , Anversa P, Hiler B, Ricci R, Guideri G, Olivetti G. Myocyte cell loss and myocyte hypertrophy in the aging rat heart. Am Coll Cardiol, 8:1441-8, Pugh KG, Wei JY. Clinical implications of physiological changes in the aging heart. Drugs Aging, 18: , Heckman GA, MD, McKelvie RS. Cardiovascular Aging and Exercise in Healthy Older Adults. Clin J Sport Med, 18: , Grandy SA, Howlett SE. Cardiac excitation-contraction coupling is altered in myocytes from aged male mice but not in cells from aged female mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 291: , Leosco D, Rengo G, Iaccarino G, Filippelli A, Lymperopoulos A, Zincarelli C, Fortunato F, Golino L, Marchese M, Espósito G, Rapacciuolo RB, Ferrara N, Koch WJ, Rengo F. Exercise training and β-blocker treatment ameliorate age-

39 39 dependet impairment of β-adrenergig stimulation. Am J Physiol Heart Cic Physiol, 293: , Leblanc N, Chartier D, Gosselin H, Roleau J. Age and gender differences in excitation-contraction coupling of the rat ventricle. J Physiol, 511: , Takagi G Asai K, Vatner SF, Kudej RK, Rossi F, Peppas A, Takagi I, Resuelle RRG, Natividad F, Shen Y, Vatner DE. Gender differences on the effects of aging on cardiac and peripheral adrenergic stimulation in old conscious monkeys. Am J Physiol Heart Cic Physiol, 285: , Pate RR, Pratt M, Blair SN, Haskell WL, Macera CA, Bouchard C, Buchner D, Ettinger W, Heath GW, King AC. Physical activity and public health. A recommendation fron the Centers for Disease Control and Prevention and the American College of Sports. JAMA, 273: , Lakatta EG, Spurgeon HA. Effect of exercise on cardiac muscle performance in aged rats. Fed Proc, 46: , Tate CA, Taffet GE, Hudson EK, Blaylock SL, McBride RP, Michael LH. Enhanced calcium uptake of cardiac sarcoplasmic reticulum in exercise-trained old rats. Am J Physiol, 258: , Thomas DP, McCormick RJ, Zimmerman SD, Vadlamudi RK, Gosselin LE. Aging- and training-induced alterations in collagen characteristics of rat left ventricle and papillary muscle. Am J Physiol, 263: , Maifrino LBM, Araújo RC, Faccini CC, Liberti EA, Gama EF, Ribeiro AACM, Souza RR. Effect of exercicise training on aging-induced changes in rat papillary muscle. Arq Bras Cardiol, 92: , 2009.

40 40 17.Iemitsu M, Maeda S, Jesmin S, Otsuki T, Miyauchi T. Exercise training improves aging-induced downregulation of VEGF angiogenic signaling cascade in hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 291: , Iemitsu M, Miyauchi T, Maeda S, Tanabe T, Takanashi M, Matsuda M, Yamaguchi I. Exercise training improves cardiac function- related gene levels through thyroid hormone receptor signaling in aged rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 286: , Ullrick WC, Whitehorn WV. A muscle column preparation from the rat's left ventricle. Circ Res. 4: , Kelly JJ Jr, Hoffman BF. Mechanical activity of rat papillary muscle. Am J Physiol. 199:157-62, Bocalini DS, Carvalho EV, de Sousa AF, Levy RF, Tucci PJ. Exercise traininginduced enhancement in myocardial mechanics is lost after 2 weeks of detraining in rats. Eur J Appl Physiol, 109: , Serra AJ, Santos MHH, Bocalini DS, Antonio EL, Levy RF, Santos AA, Higuchi ML Silva Jr. JA, Magalhães FC, Baraúna VG, Krieger JE, Tucci PJF. Exercise training inhibits inflammatory cytokines and more than prevents myocardial dysfunction in rats with sustained β-adrenergic hyperactivity. J Physiol, 588: , Serra AJ, Higuchi ML, Ihara SSM, Antonio EL, Santos MHH, Bombig MTNM, Tucci PJ. Exercise training prevents β-adrenergic hyperactivity-inducer myocardial hypertrophy and lesions. Eur J Heart Fail, 10: , Rinaldi B, Corbi G, Boccuti S, Filippelli W, Rengo G, Leosco D, Rossi F,

41 41 Filippelli A, Ferrara N. Exercise training affects age-induced changes in SOD and heat shock protein expression in rat heart. Exp Gerontol, 41:764-70, Gerdes AM, Liu Z, Zimmer HG. Changes in nuclear size of cardiac myocytes during the development and progression of hypertrophy in rats. Cardioscience, 5:203-8, Thomas DP, Zimmerman SD, Hansen TR, Martin DT, McCormick RJ. Collagen gene expression in rat left ventricle: interactive effect of age and exercise training. J Appl Physiol, 89: , Li Y, Lincoln T, Mendelowitz D, Grossman W, Wei JY. Age-related differences in effect of exercise training on cardiac muscle function in rats. Am J Physiol, 251:H12-8, Taffet GE, Michael LA, Tate CA. Exercise training improves lusitropy by isoproterenol in papillary muscles from aged rats. J Appl Physiol, 81: , Diffee GM, Seversen EA, Titus MM. Exercise training increases the Ca 2+ sensitivity of tension in rat cardiac myocytes. J Appl Physiol, 91:309-15, Wisløff U, Loennechen JP, Falck G, Beisvag V, Currie S, Smith G, Ellingsen Ø. Increased contractility and calcium sensitivity in cardiac myocytes isolated from endurance trained rats. Cardiovasc Res, 50: , Diffee GM, Nagle DF. Regional differences in effects of exercise training on contractile and biochemical properties of rat cardiac myocytes. J Appl Physiol, 95:35-42, Diffee GM, Chung E. Altered single cell force-velocity and power properties in exercise-trained rat myocardium. J Appl Physiol, 94: , 2003.

42 42 33.Kwak HB, Song W, Lawler JM. Exercise training attenuates age-induced elevation in Bax/Bcl-2 ratio, apoptosis, and remodeling in the rat heart. FASEB J, 20:791-3, Jalil JE, Doering CW, Janicki JS, Pick R, Shroff SG, Weber KT. Fibrillar collagen and myocardial stiffness in the intact hypertrophied rat left ventricle. Circ Res, 64: , Matsubara LS, Matsubara BB, Okoshi MP, Cicogna AC, Janicki JS. Alterations in myocardial collagen content affect rat papillary muscle function. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 279:H1534-H39, Murad N, Tucci PJF. Isoproterenol-induced hypertrophy may result in distinct left ventricular changes. Clin Exp Pharmacol Physiol, 27:352-57, 2000.

43 4. DISCUSSÃO 43

44 44 Neste estudo, houve confirmação de achados anteriores da literatura 22,23, em que o EXF mostrou eficaz na melhoria das funções cardíacas de ratos. Além disto, nossos dados corroboram resultados onde foi verificado que o EXF foi capaz de reduzir o peso corporal de ratos senescentes 24. Também derivam de nossos resultados a confirmação que animais senescentes exercitados desenvolvem hipertrofia miocárdica 24,9 (Figura 1). Acresça-se a informação que o processo hipertrófico induzido pelo EXF ocorreu em ambas as câmaras ventriculares, direita e esquerda. Ao considerar a razão entre massa miocárdica e peso corporal como indicadora de hipertrofia celular, é aceitável que a veracidade deste procedimento de indexação fica comprometida em circunstâncias de alteração do peso corporal do animal, como em nossos casos. Assim, desde que o aumento nuclear está associado com hipertrofia celular 25, o crescimento dos cardiomiócitos nos ratos exercitados foi confirmado pela análise do volume nuclear. Tais achados também corroboram estado hipertrófico do miocárdio despertado pelo EXF. Seguinte a avaliação biométrica do coração, em uma análise microscópica sob lâminas contendo fragmentos de tecido ventricular esquerdo incubados com picro-sirius red, preconizou-se a avaliação do conteúdo de colágeno miocárdico. Esta abordagem se fez necessária na medida em que o papel do EXF neste cenário ainda é irresoluto. Thomas et al 26 observaram que dez semanas de EXF em esteira não afetaram o aumento de colágeno intersticial evocado pelo envelhecimento. Contudo, em nossos casos, seis semanas de treinamento em piscina resultaram em significativa diminuição do conteúdo colágeno no miocárdio ventricular esquerdo de roedores idosos exercitados. É importante considerar que

45 45 estes achados não são exclusivos aos nossos casos e, assim, corrobora informações precedentes divulgadas por outros investigadores 16. De interesse, são os efeitos favoráveis do EXF sob as propriedades funcionais intrínsecas do miocárdio senescente. Experimentos iniciais despertaram novas perspectivas acerca da importância do EXF no combate a depressão inotrópica miocárdica ligada ao envelhecimento. O primeiro trabalho, por nós localizado, que avaliou a influência do EXF sobre a depressão contrátil induzida pelo envelhecimento, foi o de Li et al 27. Os autores verificaram que ratos senescentes treinados em esteira por período de 16 semanas apresentaram reversão da duração prolongada da contração isométrica de músculos papilares. Posteriormente, Tate et al. 14 corroboraram achados anteriores, demonstrando que dez semanas de exercício em esteira resultaram em apreciável melhora da contratilidade miocárdica em animais senescentes. Realmente, ensaios experimentais têm providenciado resultados altamente relevantes, ilustrando que animais idosos submetidos a processo de treinamento físico apresentam melhora na contratilidade miocárdica. Contudo, ainda há certa indefinição, sobretudo pelo fato de existirem estudos que não demonstraram benefícios advindos com o EXF em ratos senescentes. É válido mencionar o estudo de Taffet et al 28, em que o inotropismo de músculos papilares isolados não foi significativamente melhorado em animais senescentes exercitados. Neste trabalho também nos valemos do emprego de preparação de músculos papilares trabalhando isoladamente para análise da função miocárdica. Os valores de indicadores de capacidade inotrópica, tensão desenvolvida e taxa de aumento máximo da tensão desenvolvida, possibilitaram estabelecer o

46 46 potencial salutar do EXF para aumento da capacidade contrátil do miocárdio senescente. Acresça-se informações provenientes da taxa de decaimento máximo da tensão desenvolvida, em que valores mais elevados foram observados somente nos animais exercitados, portanto, configurando um estado de relaxamento miocárdico aprimorado. Em adição, o protocolo experimental de preparação de músculos papilares in vitro possibilitou caracterizar a sensibilidade dos miofilamentos ao mecanismo de Frank-Starling, isto é, a intensificação da tensão desenvolvida promovida pelo estiramento muscular. Consequentemente, quando se analisaram as retas de estiramento-tensão ativa (Figura 5), foi evidenciado que os estiramentos musculares acentuaram menos a tensão desenvolvida nos papilares dos animais sedentários. Inversamente, as inclinações das retas provenientes da relação estiramento muscular e tensão desenvolvida dos animais senescentes exercitados foram sugestivas de melhora do mecanismo de Frank-Starling. Apesar de nós não termos analisado os possíveis mecanismos responsáveis pelo aprimoramento da contratilidade miocárdica, destacam-se as já reconhecidas ações do EXF sobre a melhora da sensibilidade dos miofilamentos ao cálcio 29,30,31 e o aumento da expressão da cadeia leve da miosina no miocárdio 32. Particular a ratos senescentes, o aprimoramento do inotropismo miocárdico têm sido associado a aumento da angiogênese 17, maior responsividade a estimulação beta-adrenérgica 9, elevação do conteúdo tecidual de proteínas envolvidas na cinética do cálcio 18 e redução da apoptose dos cardiomiócitos 33. Há a se considerar que o acúmulo de colágeno pode piorar a

47 47 distensibilidade e prejudicar a transmissão de força entre os cardiomiócitos em contração 34,35,36, é possível deduzir que o menor teor de colágeno intersticial nos animais exercitados possa contribuir ao menos para a manutenção do inotropismo.

48 5.CONCLUSÃO 48

49 49 Neste sentido, o efeito cardioprotetor do Exercício Físico foi observado em amplo aspecto e incluiu redução do colágeno intersticial, aumento da geração de força pelos cardiomiócitos e aprimoramento do relaxamento miocárdico.

50 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 50

51 51 1.Lakatta EG, Sollot SJ. Perspectives on mammalian cardiovascular ageing: humans to molecules. Com Biochem Physiol A Mol Integr Physiol, 132: , Taylor RP, Starnes JW. Age, cell signalling and cardioprotection. Acta Physiol Scand, 178: , Capasso JM, Remily RM, Sonnenblick EH. Age-related differences in excitationcontraction coupling in rat papillary muscle. Basic Res Cardiol, 78: , Kiriazis H, Gibbs CL. Effects of ageing on the activation metabolism of rat papillary muscles. Clin Exp Pharm Physiol, 28: , Anversa P, Hiler B, Ricci R, Guideri G, Olivetti G. Myocyte cell loss and myocyte hypertrophy in the aging rat heart. Am Coll Cardiol, 8:1441-8, Pugh KG, Wei JY. Clinical implications of physiological changes in the aging heart. Drugs Aging, 18: , Heckman GA, MD, McKelvie RS. Cardiovascular Aging and Exercise in Healthy Older Adults. Clin J Sport Med, 18: , Grandy SA, Howlett SE. Cardiac excitation-contraction coupling is altered in myocytes from aged male mice but not in cells from aged female mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 291: , Leosco D, Rengo G, Iaccarino G, Filippelli A, Lymperopoulos A, Zincarelli C, Fortunato F, Golino L, Marchese M, Espósito G, Rapacciuolo RB, Ferrara N, Koch WJ, Rengo F. Exercise training and β-blocker treatment ameliorate age-