Dependência do Grau de Ativação do Músculo Cardíaco do Comprimento Muscular

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1 Atualização Dependência do Grau de Ativação do Músculo Cardíaco do Comprimento Muscular Dilson J. E. Rassier São Leopoldo, RS A lei de Frank-Starling do coração 1-3 pode ser descrita na relação entre força e comprimento do músculo cardíaco. Com o advento da teoria das pontes cruzadas de contração muscular 4,5 e o clássico estudo de Gordon e cols. 6, descrevendo a adequação desta teoria à relação força-comprimento no músculo esquelético, vários investigadores passaram a estudar esta relação no músculo cardíaco. A relação força-comprimento no músculo cardíaco é observada em uma pequena variedade de comprimentos de sarcômero, aproximadamente entre 1,8µm a 2,3µm. Esta região corresponde a parte ascendente da relação força-comprimento do músculo esquelético, investigada por Gordon e cols. 6, e os níveis de força do miocárdio variam de zero (1,8µm) até valores de força máxima (2,3µm). Esta grande variação de força resulta em uma relação força-comprimento de inclinação muita acentuada, principalmente quando comparada ao músculo esquelético (fig. 1). Para se ter uma idéia, quando a tensão desenvolvida pelo miocárdio em diferentes comprimentos de sarcômero é normalizada em relação à sua força máxima (F máx ) no comprimento em que ocorre (L máx ), a tensão desenvolvida é de aproximadamente 10-15% quando o miocárdio é medido a 80% de L máx. Já no músculo esquelético, a força normalizada nas mesmas condições seria de aproximadamente 80-85% de F máx 7 (fig. 1). Esta diferença entre os músculos esquelético e cardíaco evidencia que a relação força-comprimento no miocárdio não é uma função simples do grau de superposição dos filamentos actina e miosina, já que comprimento desses filamentos são semelhantes nos dois músculos; outros fatores devem estar envolvidos na relação força-comprimento muscular. Nos últimos anos, esta diferença na relação força-comprimento nos dois músculos passou a ser atribuída a uma dependência do grau de ativação muscular do comprimento dos sarcômeros 8. Ativação muscular tem sido utilizada na literatura para referir-se coletivamente a diversos processos que podem Universidade do Vale do Rio dos Sinos (UNISINOS) São Leopoldo Correspondência: Dilson J. E. Rassier - UNISINOS - Centro de Ciências da Saúde (02) Av. Unisinos, São Leopoldo, RS Recebido para publicação em 14/10/99 Aceito em 29/12/99 dar início à contração muscular, modificando o estado muscular de inativo para ativo. Assim, a ativação muscular tem sido associada à freqüência de estimulação muscular ou de potenciais de ação das membranas, para descrever a concentração intracelular de Ca 2+ [Ca 2+ ] i, ou para descrever a ocupação da proteína troponina C (TnC) com o Ca 2+. Neste artigo, o termo ativação muscular será utilizado para descrever a proporção de TnC associada ao Ca 2+. Esta associação TnC/Ca 2+ representa um evento fundamental na contração muscular e, portanto, a sensibilidade da TnC ao Ca 2+ será discutida em maiores detalhes no contexto deste artigo. Além disso, esta escolha é proveniente a mudanças de força do miocárdio causadas pelas alterações no comprimento muscular não relacionadas à concentração de [Ca 2+ ] i 9,10. Este artigo revisa os estudos relacionados à dependência da força e, mais importante, do processo de ativação muscular do miocárdio do comprimento muscular. Especificamente, este artigo pretende investigar mecanismos propostos na literatura que sejam os responsáveis pela dependência da sensibilidade dos filamentos ao Ca 2+ do comprimento muscular. Dependência da sensibilidade dos filamentos ao Ca 2+ do comprimento muscular - Evidências de que a ativação do miocárdio é dependente do comprimento muscular são encontradas em estudos demonstrando que intervenções inotrópicas (por exemplo, aumento da freqüência de estimulação muscular) induzem um deslocamento da relação forçacomprimento do miocárdio à esquerda. Como resultado de tal deslocamento, a inclinação da relação força-comprimento muscular assemelha-se à relação observada no músculo esquelético (fig. 1) 7,11,12. Três linhas principais de investigação têm sido utilizadas na avaliação da dependência da ativação e sensibilidade do sistema regulatório ao Ca 2+ do comprimento muscular: 1) estudos com a utilização de marcadores intracelulares de Ca 2+ e encurtamento rápido de fibras intactas do miocárdio; 2) estudos com a utilização de fibras sem membrana; e 3) estudos com marcadores isótopos de proteínas. Os estudos com a medição de [Ca 2+ ] i após mudanças bruscas no comprimento de fibras são utilizados para avaliar a afinidade da TnC ao Ca 2+. Nesses estudos, substâncias fluorescentes marcadoras de Ca 2+ são introduzidas nas células cardíacas e, quando estimuladas adequadamente, for- 449

2 Arq Bras Cardiol Força Fig. 1 - Ilustração esquemática da relação força-comprimento dos músculos esquelético (linha cheia) e cardíaco (linha tracejada) a partir de 80% L máx. Neste ponto, o músculo esquelético produz 80-85% F máx, enquanto que o músculo cardíaco produz 10-15% F máx. Em 90% L máx o músculo esquelético produz força próxima à F máx, enquanto o músculo cardíaco produz 50% F máx. Isto é traduzido em uma inclinação aumentada do ramo ascendente da relação força/comprimento muscular no miocárdio (a zona em que o miocárdio normalmente opera) quando comparada ao músculo cardíaco. necem informações referentes à quantidade intracelular de Ca 2+. Esses estudos assumem que uma redução da afinidade TnC/Ca 2+ resultaria em uma maior concentração de [Ca 2+ ] i, já que uma menor quantidade de [Ca 2+ ] i estaria associada à TnC. Por sua vez, isto induziria uma menor ativação muscular (conforme conceito utilizado neste artigo). Diferentes autores demonstram que um encurtamento abrupto do músculo cardíaco intacto em estágios finais de uma contração resultam em uma diminuição de tensão muscular, acompanhada de um aumento nos níveis de [Ca 2+ ] i. Esta observação sugere uma diminuição da associação TnC/Ca 2+, i.e. a afinidade da TnC ao Ca 2+ é diminuída quando o músculo é encurtado 10, Nos estudos com fibras sem membranas, as células do miocárdio são estudadas sem o sarcolema que envolve as proteínas responsáveis pela contração muscular. Neste tipo de preparação, a contração muscular é iniciada pela adição de Ca 2+ ao meio líquido no qual as fibras estão sendo investigadas (que contém várias substâncias para manter a viabilidade dos experimentos, e.g., a glicose). Desta forma, a ativação induzida por Ca 2+ pode ser controlada pelo investigador através das concentrações extracelulares de Ca 2+, e é possível estabelecer-se a relação força/ca 2+ em diferentes situações (fig. 2). A relação força/ca 2+ é extremamente eficiente no estudo do músculo cardíaco, uma vez que permite a investigação da sensibilidade do sistema regulatório ao Ca 2+. De acordo com essa relação, uma quantidade aumentada de Ca 2+ é associada com um aumento na força desenvolvida pelo miocárdio, até um determinado platô. Se a quantidade de Ca 2+ necessária para produzir um determinado nível de Fig. 2 - A relação força/ca 2+. Ca 2+ é representado por pca 2+ ((-log 10 (Ca 2+ )). A figura demonstra que a quantidade de Ca 2+ necessária para produção de força é diminuída quando a relação força/pca 2+ é deslocada à esquerda (seta direcionada do círculo vazio para o círculo cheio). Este deslocamento da relação força/pca 2+ para a esquerda é um indicativo de aumento na sensibilidade do sistema muscular ao Ca 2+. força é diminuída, a relação força/ca 2+ é deslocada à esquerda (fig. 2), e a sensibilidade do sistema ao Ca 2+ fica aumentada. Neste contexto, estudos têm demonstrado que a quantidade de Ca 2+ necessária para a obtenção de determinada força é diminuída quando a resposta é avaliada em sarcômeros alongados 16,17. Por exemplo, em um destes estudos Hibberd e Jewell 16 demonstraram que a quantidade de Ca 2+ necessária para que a força do miocárdio chegasse a 50% da F máx em sarcômero fixado com comprimento de ~2,5µm era significativamente menor do que quando o sarcômero estivesse fixado em um comprimento de ~1.9µm. De acordo com esses resultados, Kentish e cols. 17 demonstraram que cada aumento no comprimento de sarcômero era seguido por aumento na força muscular em paralelo a um pequeno deslocamento da relação força/pca para a esquerda, que significa uma menor quantidade de Ca 2+ necessária para a mesma produção de força. Finalmente, alguns estudos utilizam marcadores isótopos específicos para analisar o grau de associação TnC/ Ca 2+, e relacioná-lo ao comprimento muscular 18,19. Estes isótopos unem-se a determinadas moléculas da proteína TnC e fornecem informações referentes ao grau de associação TnC/Ca 2+. Em um desses estudos 19, os autores utilizaram fibras sem membranas do ventrículo de bovinos marcadas com estes isótopos, e os resultados do estudo demonstraram uma forte associação de Ca 2+ à TnC durante geração de força. Entretanto, esta associação foi relacionada diretamente ao comprimento muscular: em sarcômeros mais curtos, uma redução da associação TnC/Ca 2+ foi observada. Estes resultados estão de acordo com os estudos citados anteriormente, nos quais a dependência da sensibilidade do Ca 2+ do comprimento muscular é relacionada à TnC. 450

3 A principal questão a ser respondida seria como a TnC, uma subunidade protéica associada a ligação de íons Ca 2+ e Mg 2+, recebe informações a respeito das mudanças estruturais no comprimento muscular? Para responder esta pergunta, existem diferentes linhas de investigação e hipóteses sendo testadas atualmente. Alguns autores sugerem que a própria TnC seria o aparelho sensor das mudanças no comprimento muscular Esta hipótese é baseada nas diferenças moleculares que existem entre a TnC do músculo cardíaco e do músculo esquelético, que estariam associadas à diferença na relação força-comprimento nos dois músculos. Entretanto, vários estudos têm rechaçado esta hipótese 23,24. Em um deste estudos, Moss e cols. 23 caracterizaram a relação entre força produzida e ativação induzida por Ca 2+ em fibras musculares sem membrana do músculo esquelético do coelho, em comprimentos de sarcômeros de 2.32µm e 1.87µm. Essas medidas foram realizadas antes e após a TnC ser substituída por TnC do músculo cardíaco, para provar se essa era a principal razão das diferenças na relação forçacomprimento nos músculos esquelético e cardíaco. Quando >95% de substituição das fibras esqueléticas com a TnC cardíaca foi realizada, mudanças significativas na sensibilidade ao Ca 2+ não foram observadas nos comprimentos investigados. Portanto, a TnC não é o principal mecanismo responsável pela dependência da sensibilidade do sistema muscular à força do comprimento muscular. A outra hipótese que vem sendo testada com sucesso é a de que a associação das pontes cruzadas da miosina com a actina e, conseqüente geração de força, é responsável pela dependência do grau de ativação do comprimento muscular 18,19, A justificativa e trabalhos relacionados a esta hipótese serão apresentados a seguir. Relação força-comprimento do músculo cardíaco e associação das pontes cruzadas com a actina - Quando o músculo cardíaco é alongado no ramo ascendente da relação força-comprimento, existe um aumento da superposição dos filamentos de actina e miosina. Com isto a possibilidade de interação entre as pontes cruzadas e a actina, e conseqüente geração de força, é aumentada. Atualmente, existem fortes evidências favorecendo um sistema no qual esta associação aumenta a sensibilidade do sistema regulador de força ao Ca 2+ e, conseqüentemente, a ativação muscular. Esta hipótese tem sido testada detalhadamente nos elegantes estudos de Fuchs e cols. 18,19,26,27. Em um desses estudos, Hofmann e Fuchs 18 mediram a associação TnC/ Ca 2+ em fibras cardíacas sem membrana com a utilização de isótopos (como explicado anteriormente). Como esperado, os resultados confirmam que a associação TnC/Ca 2+ é dependente do comprimento muscular na faixa de sarcômeros compreendida entre 1,7µm to 2,4µm. Entretanto, em alguns experimentos, os autores utilizaram uma substância análoga ao fosfato (P i ), o vanadato de sódio (V i ). Esta substância atua como uma enzima ATPase e deprime a interação associação das pontes cruzadas com a actina, formando um complexo estável miosina ADP V i. Quando utilizada esta substância, a relação entre a associação TnC/Ca 2+ e comprimento do sarcômero foi deprimida, e o grau de ativação muscular não apresentou dependência do comprimento do sarcômero. Desta forma, a dependência da afinidade de Ca 2+ à TnC do comprimento muscular seria na verdade uma dependência do número de pontes cruzadas em associação à actina. Outra evidência da associação pontes cruzadas e afinidade TnC ao Ca 2+ é o estudo de Saeky e cols. 30 que utilizaram fibras musculares cardíacas intactas. No estudo, as fibras foram injetadas com substâncias marcadoras de Ca 2+, para realizar as manobras de encurtamento muscular rápido, como já explicado. Em um grupo de experimentos extra Ca 2+ não foi detectado quando a fibra foi encurtada, partindo de um estado de relaxamento muscular (sem a produção de força). Em outro grupo de experimentos onde o ciclo das pontes cruzadas foi bloqueado por substância química específica (2,3 butaneodione monoxime), foi constatado que mudanças no comprimento muscular também não resultaram na aparição de extra Ca 2+ no espaço intracelular, embora a força tenha sido diminuída de forma considerável. Em outras palavras, quando a associação entre pontes cruzadas e actina foi bloqueada, pelo estado de relaxamento muscular ou por substância química específica, a associação TnC/ Ca 2+ não dependente do comprimento muscular. Desta forma, conclui-se que o aumento da sensibilidade do sistema regulador ao Ca 2+ induzido por um aumento no comprimento do sarcômero é relacionado a um número aumentado de pontes cruzadas associadas à actina, tanto em fibras cardíacas sem membrana, como em fibras cardíacas com as membranas intactas. Pontes cruzadas e regulação da atividade da troponina C - Embora a associação das pontes cruzadas, a força e a sensibilidade da TnC ao Ca 2+ estejam relacionados, cabe ainda estudar-se a natureza desta relação. Em outras palavras, como a associação das pontes cruzadas da miosina com a actina aumenta a afinidade da TnC ao Ca 2+, e conseqüentemente a sensibilidade do sistema muscular ao Ca 2+? Estudos nos quais a TnC é marcada em alguns de seus domínios reguladores com provas fluorescentes, através de substituição de moléculas específicas, fornecem algumas evidências neste sentido Hannon e cols. 33 utilizaram TnC cardíaca marcada com as provas fluorescentes específicas que fornecem informações a respeito da estrutura da TnC resultantes da associação TnC/Ca 2+. Ainda os autores mediram as respostas da sensibilidade do sistema muscular ao Ca 2+ relacionadas com a associação de pontes cruzadas, para associar com alterações na estrutura da TnC, e observaram que a associação entre pontes cruzadas e actina induziu a modificações na conformação de TnC, e que esta alteração foi acompanhada de um aumento da sensibilidade do sistema muscular ao Ca 2+. Na mesma linha de investigação, Liou e Fuchs 31 marcaram dois resíduos da TnC de fibras cardíacas de bovinos com alguns compostos reativos. Medindo os sinais fluorescentes destes compostos, os autores observaram que pontes cruzadas in rigor e pontes cruzadas cíclicas têm efei- 451

4 Arq Bras Cardiol tos diferenciados na conformação da TnC, sugerindo que mecanismos pelos quais as pontes cruzadas afetam TnC são através de conformações moleculares. Esses dois estudos sugerem uma explicação para o mecanismo responsável pela dependência da sensibilidade ao Ca 2+ do comprimento muscular, no qual um aumento no comprimento muscular induz alterações na conformação molecular da TnC, resultando em um aumento de sua afinidade ao Ca 2+. Evidências para outros mecanismos responsáveis pela dependência da ativação do miocárdio do comprimento muscular - Embora as evidências apontem para um mecanismo envolvendo as pontes cruzadas, como mecanismo responsável pela dependência da força e sensibilidade dos filamentos ao Ca 2+ do comprimento muscular, esta hipótese encontra uma dificuldade óbvia. A sensibilidade ao Ca 2+ é aumentada em fibras cardíacas sem membranas 34 quando estas são alongadas na porção descendente da relação força-comprimento, onde o potencial para a interação miosinaactina está diminuído. A hipótese levantada na literatura é que, além da associação de pontes cruzadas, força e afinidade TnC/Ca 2+, as mudanças no comprimento de sarcômero per se são responsáveis por alterações na sensibilidade do sistema muscular ao Ca 2+. Essas mudanças seriam evidenciadas no espaço entre os filamentos musculares compostos de miosina e actina. Estudos que utilizam difração de raio-x têm demonstrado que os filamentos de actina e miosina são posicionados mais próximos quando o músculo é alongado e o volume muscular não é modificado 35,36. É razoável supor-se que a probabilidade de interações entre pontes cruzadas e actina seria aumentada nesta situação, onde a distância para a associação entre os filamentos é diminuída. Esta possibilidade aumentada de interação en- tre os filamentos aumentaria a força em determinada concentração de Ca 2+, aumentando a sensibilidade do sistema muscular ao Ca 2+. Nesta linha de investigação, diferentes autores estudaram os efeitos de compressão osmótica dos filamentosa miosina e actina, utilizando o polímero de alto peso molecular dextran T-5000, polyvinylpyrrolidone-40. Este composto não penetra no espaço compreendido entre os filamentos miosina e actina, mas causa aproximação lateral entre eles. Alguns autores 26,37 observaram que após a utilização desta substância, a sensibilidade ao Ca 2+ foi aumentada de forma significativa no músculo cardíaco. Wang e Fuchs 26 investigaram especificamente a hipótese de que alterações no espaço entre os filamentos miosina e actina contribuem para a dependência da sensibilidade do miocárdio ao Ca 2+ do comprimento muscular. Esses autores estudaram simultaneamente os efeitos de compressão osmótica (Dextran T-5000, 5 e 10%), comprimento de sarcômero (1,7µm a 2,3µm) e o grau de associação TnC/Ca 2+. Os resultados são convincentes: a utilização de 5% dextran na fibra estabilizada em um comprimento de sarcômero de 1.7µm resultou em uma redução no diâmetro (~13%) da fibra muscular, equivalente a situação na qual o sarcômero é alongado a um comprimento de 2,3µm. Mais importante, esta intervenção foi acompanhada de um aumento significativo na sensibilidade muscular ao Ca 2+ [alteração de ~0,25 pca 2+, (fig. 2)] e na associação TnC/Ca 2+ nos níveis de ativação compreendidos entre 6,0 e 5,0 pca. Conclusão - Os estudos revisados neste artigo sugerem que a dependência da sensibilidade ao Ca 2+ do comprimento muscular é um resultado associado da interação de pontes cruzadas e actina, que induzem alterações na afinidade TnC/Ca 2+, e de mudanças no espaço entre os filamentos, que aumenta a probabilidade de interação miosina/actina. Referências 1. Frank O. Zur Dynamik des Heizmuskel. Zeitschrift Biologie 1885; 32: Patterson SW, Piper H, Starling EH. The regulation of the heart beat. J Physiol 1914; 48: Patterson SW, Starling EH. On the mechanical factors which determine the output of the ventricles. J Physiol 1914; 48: Huxley AF, Simmons RM. Proposed mechanisms of force generation in striated muscle. Nature 1971; 233: Huxley AF. Muscle structure and theories of contraction. Progr Biophys biophys Chem 1957; 7: Gordon AM, Huxley AF, Julian FJ. The variation in isometric tension with sarcomere length in vertebrate muscle fibres. J Physiol 1966; 184: Allen DG, Jewell BR, Murray JW. 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