IDENTIFICAÇÃO MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE NEMATOIDES DE CARAMUJOS Achatina fulica NA ZONA URBANA DE PALMAS TOCANTINS

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1 IDENTIFICAÇÃO MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE NEMATOIDES DE CARAMUJOS Achatina fulica NA ZONA URBANA DE PALMAS TOCANTINS Nome dos autores: Carlos Alberto Rodrigues Junior 1 ; Sandra Maria Botelho Mariano 2 ; Marcello Otake Sato 3 1 Aluno do Curso de Medicina; Campus de Palmas; carlos.rouft@gmail.com 2 Orientador(a) do Curso de Medicina; Campus de Palmas; sandrabotelho@mail.uft.edu.br 3 Co-orientador(a) professor assistente da Dokkyo Medical University; Mibu, Japão; marcello@dokkyomed.ac.jp RESUMO INTRODUÇÃO: Achatina fulica pode atuar como um hospedeiro intermediário de Metastrongilídeos de importância médica e veterinária como Angiostrongylus cantonensis, Angiostrongylus costaricensis, Angiostrongylus vasorum e Aelurostrongylus abstrusus. Nesse sentido, devido à presença de A. fulica em praticamente todo o território brasileiro, o objetivo deste trabalho foi encontrar e identificar por meio de técnicas morfológicas e moleculares nematoides causadores de angiostrongilose humana nos caramujos da espécie A. fulica coletados na cidade de Palmas Tocantins. MATERIAL E MÉTODOS: Realizou-se busca de caramujos na zona urbana de Palmas entre os meses de agosto de 2016 e julho de Para pesquisa das larvas, foram selecionados aleatoriamente 102 exemplares vivos de A. fulica. Procedeu-se ao método de digestão química dos tecidos segundo Wallace & Rosen (1969) e sedimentação segundo Baermann modificado. Foi realizada extração do DNA das larvas, amplificação, via PCR, das sequências do DNA por meio de primers. As reações foram conduzidas em termociclador Esco Swift MaxPro Thermal Cyclers. RESULTADOS E DISCUSSÃO: Foram encontradas 28 larvas de nematoides nas amostras analisadas. Os resultados obtidos por este estudo demonstraram a presença de larvas de A. abstrusus em A. fulica. As larvas foram identificadas de acordo com as características morfológicas. A presença de larvas de A. abstrusus em A. fulica não pode foi confirmada através dos ensaios moleculares realizados. CONCLUSÕES: Diante do exposto, pode-se concluir que havia caramujos infectados na cidade de Palmas, os quais apresentaram infecção apenas para A. abstrusus. Nenhum outro gênero de nematoide foi encontrado. Palavras-chave: Achatina fulica; Aelurostrongylus abstrusus; Caramujo; Nematoides. Página 1

2 INTRODUÇÃO Em várias regiões do Brasil, um caso de invasão atual é a do caramujo gigante africano Achatina fulica (COLLEY; FISCHER, 2009), relatado em 26 estados e no Distrito Federal (AGUDO; AQUINO, 2011), é considerada uma das cem piores espécies invasoras (LOWE et al., 2004). A disseminação de A. fulica em todo o território nacional pode tornar-se um sério problema de saúde pública, pois se apresenta como potencial hospedeiro de nematoides causadores de angiostrongilose humana (TELES; FONTES, 2002). Oliveira et al. (2010) afirma que existe A. fulica infectada naturalmente por Angiostrongylus cantonensis, nematóide responsável pela transmissão da meningite eosinofílica, no Japão, nas ilhas do Oceano Pacífico e na China. Segundo Caldeira et al. (2007), os dois primeiros casos dessa verminose no Brasil ocorreram no município de Cariacica, localizado no estado do Espírito Santo, onde relataram várias espécies de moluscos terrestres infectadas, inclusive A. fulica. Outra zoonose de importância que pode ser transmitida por este caramujo para seres humanos é a angiostrongilose abdominal, causada pelo verme Angiostrongylus costaricensis (ESPIRITO SANTO et al., 2013). Não havendo controle eficaz dos caramujos, essa doença pode tornar-se uma endemia rural e urbana (FARIA, 2007). Além disso, um estudo realizado no município de Palmas TO constatou a presença de caramujos da espécie A. fulica parasitados pelos nematoides Aelurostrongylus abstrusus e nematoides do gênero Rhabditis sp. (RODRIGUES JUNIOR; PINHEIRO, 2015). A. abstrusus é um nematódeo parasito de pulmão de felídeos causador de pneumonia, não sendo zoonotico (THIENGO et al., 2007). Em relação ao gênero Rhabditis sp., a maioria das espécies vive em matéria orgânica em decomposição, sendo comuns no solo, água parada e frutas em decomposição, entretanto, Neveu-Lemaire (1936) afirmou que três espécies do gênero podem ocorrer no homem: R. pellio, que pode acidentalmente parasitar a vagina de mulheres, R. niellyi e R. hominis. MATERIAL E MÉTODOS Realizou-se uma busca na zona urbana de Palmas TO entre os meses de agosto de 2016 e julho de 2017 para determinar a localização dos caramujos. No mês de fevereiro foram obtidas também algumas amostras na cidade de Santa Tereza do Tocantins TO e no mês de abril em Santa Maria do Tocantins TO, cidades situadas a 61Km e 277Km da capital do estado, respectivamente (IBGE, 2016). Os exemplares de A. fulica foram escolhidos aleatoriamente, acondicionados em caixas de polietileno devidamente identificadas de acordo Página 2

3 com o local da amostragem, e transportados até o Laboratório de Experimentação Animal e Biotério da UFT, Campus de Palmas, onde permaneceram até o momento das análises. Os exemplares foram mantidos em caixas plásticas (35x30x15 cm), com uma fina lâmina de água, e alimentados com folhas de alface fresca a cada dois dias até o processamento para a pesquisa de nematódeos. Cada caramujo foi lavado em água corrente, e em seguida verificada as características de sua concha para identificação com base na conquiliologia e por comparações com espécies descritas (COELHO, 2005). Para pesquisa das larvas, foram selecionados aleatoriamente 102 exemplares vivos de A. fulica. As conchas dos caramujos foram quebradas e descartadas. Em seguida, foram triturados e procedeu-se ao método de digestão química dos tecidos segundo Wallace & Rosen (1969) e sedimentação, por 12 horas, segundo Baermann modificado (MORAES, 1948). Para a extração de DNA das amostras foi utilizado o Kit Purelink Genomic DNA mini kit K (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), seguindo-se as recomendações do fabricante. Foram amplificadas, via PCR, as sequências do DNA da larva de Aelurostrongylus abstrusus por meio de primers: PR-A (forward 5`TGG TTT TTT GTG CAT CCT GAG GTT TA-3`) e PR-B (reverse 5`AGA AAG AAC GTA ATG AAA ATG AGC AA- 3`) em 5 protocolos distintos, sendo que em todos os protocolos as reações foram conduzidas em termociclador Esco Swift MaxPro Thermal Cyclers. RESULTADOS E DISCUSSÃO Caramujos da espécie A. fulica são considerados organismos de hábitos noturnos e mais ativos em períodos chuvosos (SHEELA et al., 1998). Deste modo, devido a irregularidades no período de chuvas não foi possível à realização de um mapeamento completo das principais regiões da cidade de Palmas para a verificação da presença dos moluscos em questão. A. fulica pode atuar como um hospedeiro intermediário de Metastrongilídeos de importância médica e veterinária (Thiengo et al., 2007) como Angiostrongylus cantonensis, Angiostrogylus costaricensis, Angiostrongylus vasorum e Aelurostrongylus abstrusus (Oliveira et al., 2010). Foram coletados 220 exemplares vivos de A. fulica em três cidades do estado do Tocantins. Alíquotas dos sedimentos foram coletadas com pipeta para visualização de larvas em estereomicroscópio. Foram encontradas 28 larvas de nematoides nas amostras analisadas. Página 3

4 Os resultados obtidos por este estudo demonstram a presença de larvas de Aelurostrongylus abstrusus em A. fulica provenientes da cidade de Palmas TO. Nas amostras provenientes das cidades de Santa Maria do Tocantins TO e de Santa Tereza do Tocantins TO não foram encontradas larvas. Larvas de A. abstrusus (Figura 1) foram identificadas de acordo com as características morfológicas, tais como, corpo filiforme com a extremidade anterior arredondada e a posterior curvada dorsoventralmente; cauda pontiaguda com extremidade puntiforme com um botão terminal (OLIVEIRA et al., 2010). Figura 1. Larva de Aelurostrongylus abstrusus. Extremidade posterior (seta) da larva evidenciando o botão terminal. A. abstrusus é um parasita de pulmão distribuído mundialmente que afeta o sistema respiratório de gatos e causa broncopneumonia de intensidade variável (GRANDI et al., 2005). Os gatos adquirem o parasita comendo caramujos contendo larvas do terceiro estágio infeccioso (L3) de A. Abstrusus (TRAVERSA et al., 2008). Em gatos, as larvas L3 migram para os pulmões, onde se tornam adultas e a reprodução ocorre. As larvas do primeiro estágio (L1) são tossidas e engolidas pelo hospedeiro e são, então, eliminadas nas fezes para o ambiente, onde podem permanecer vivas por 45 a 60 dias (HAMILTON, 1969). Quando as larvas L1 atingem os moluscos, elas penetram ativamente no tegumento dos pés e se desenvolvem através de duas mudas para atingirem as larvas L3 (THIENGO et al., 2008). Apesar de não ter grande importância em saúde pública, esse nematoide é responsável por um quadro grave de pneumonia em gatos, sendo relevante para o diagnóstico diferencial com o gênero Angiostrogylus sp. (FERREIRA DA SILVA et al., 2005). identificada somente nos caramujos coletados na cidade de Palmas TO. A espécie foi Página 4

5 LITERATURA CITADA AGUDO, I. A F.A.O; AQUINO, M. Incentiva o consumo de insetos em todo o mundo. Informativo Achatina fulica. com News nº 5, CALDEIRA, R.L., MENDONÇA, C.L., GOVEIA, C.O., LENZI, H.L., GRAEFF-TEIXEIRA, C., LIMA, W.S., MOTA, E.M., PECORA, I.L., MEDEIROS, A.M.Z. & CARVALHO, O.S.. First record of molluscs naturally infected withangiostrongylus cantonensis (Chen, 1935) (Nematoda: Metastrongylidae) in Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 102(7): , COELHO, L. M. Informe técnico para controle do caramujo africano (Achatina fulica, Bowdich 1882 em Goiás. Goiânia: AGÊNCIA RURAL. 12P. AGENCIA RURAL. DOCUMENTO,4), COLLEY, E.; FISCHER, M. L.. Avaliação dos problemas enfrentados no manejo do caramujo gigante africano Achatina fulica (Gastropoda; Pulmonata) no Brasil. Zoologia, v. 26, n. 4, p , dez ESPIRITO SANTO, M. C. C. do; PINTO, P. L. S.; MOTA, D. J. G., da; et al. The first case of Angiostrongylus cantonensis Eosinophilic Meningitis diagnosed in the city of São Paulo, Brazil. Rev. Inst. Med. trop. São Paulo, v.55, n.2, GRANDI, G., CALVI, L.E., et. al. Aelurostrongylus abstrusus (cat lungworm) infection in five cats from Italy. Vet. Parasitol.; 134: , HAMILTON, J.M.,. On the migration, distribution, longevity and pathogenicity of larvae of Aelurostrongylus abstrusus in the snail, Helix aspersa. J. Helminthol. 3/4: , IBGE. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, Acessado em 02/08/2017. Desponível em: LOWE, S.; BROWNE, M.; BOUDJELAS, S.; DE POORTER, Ben. 100 de las espécies exóticas invasoras más daniñas de mundo. Uma selección del global invasive species database. GEEI, MORAES, R.G. Contribuição para o estudo do Strongyyloides stercoralis e da estrongiloidose no Brasil. Rev Ser Saude Publiça, v.1, p , NEVEU-LEMAIRE M. Traité D`Helminthologie Médicale et Veterinaire. Vigot Frères, Paris, OLIVEIRA, A. P. M.; TORRES, E. J. L.; MALDONADO, A.; ARAÚJO, J. L. B.; FERNANDEZ, M. A.; THIENGO, S. C. como hospedeiro intermediário de nematódeos de interressse médico-veterinário em Goiás, Brasil. Revista de Patologia Tropical, Goiânia, v. 39, n. 3, p , RODRIGUES JUNIOR, C.A.; PINHEIRO, S.M.B. Incidência de Nematoides em Caramujos Achatina fulica na Zona Urbana de Palmas TO. XI Seminário de Iniciação Científica da UFT, Página 5

6 TELES, H. M. S.; FONTES, L. R. Implicações da introdução e dispersão de Achatina fulica Bowdich, 1822 no Brasil. Boletim Inst. Adolfo Lutz, Rio de Janeiro, v. 12, p. 3-5, THIENGO, S.C., FERNANDEZ, M.A., TORRES, E.J.L, COELHO, P.M., LANFREDI, R.M. First record of a nematode Metastrongyloidea (Aelurostrongylusabstrusus larvae) in Achatina (Lissachatina) fulica(mollusca, Achatinidae) in Brazil. J Invest. Pathol. 2008; 98(1): THIENGO, S.C.; F.A. FARACO; N.C. SALGADO; R.H. COWIE & M.A. FERNANDEZ Rapid spread of an invasive snail in South America: the giant African snail, Achatina fulica, in Brazil. Biological Invasions, v. 4, p. 1-10, TRAVERSA, D., LIA, R.P., IORIO, R., et. al. Diagnosis and risk factors of Aelurostrongylus abstrusus (Nematoda, Strongylida) infection in cats from Italy. Vet. Parasitol.;153 (1-2): , WALLACE, G.D.; ROSEN, L. Techniques for recovering and identitying larve Angiostrongy/us cantollellsis from molluscs. Malacologia, v. 7: , AGRADECIMENTOS "O presente trabalho foi realizado com o apoio da UFT Página 6