REDE DE CO-EXPRESSÃO E REGULAÇÃO GÊNICA POR. CO-EXPRESSION NETWORK AND GENE REGULATION BY mirnas IDENTIFIED IN MONOCOTYLEDONS

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1 REDE DE CO-EXPRESSÃO E REGULAÇÃO GÊNICA POR mirnas IDENTIFICADOS EM MONOCOTILEDÔNEAS CO-EXPRESSION NETWORK AND GENE REGULATION BY mirnas IDENTIFIED IN MONOCOTYLEDONS Renan Gonçalves da Silva (1) Jóice de Oliveria Leite Silva (2) Bruna Manfiolli (3) Lucas de Faria Nogueira (4) Sonia Marli Zingaretti (5) Resumo A ciência das ômicas, da genômica à proteômica, fornece informações relevantes acerca de genes, proteínas e outras moléculas envolvidas em respostas moleculares das plantas. O conhecimento dos processos de regulação pode contribuir para o desenvolvimento de genótipos mais tolerantes aos estresses abióticos. Portanto, o objetivo do trabalho foi analisar in silico quais genes são regulados pelos mirnas397, 408, 6225 e como os processos biológicos são modulados. A análise foi realizada utilizando ferramentas computacionais, que incluem o estudo da sequência do mirna, dos genes e proteínas (por plataformas disponíveis na web), e construção de uma rede de co-expressão gênica pelo software GeneMANIA. A predição dos alvos indica que os genes RRA2, PUMP5, CYP74A e PDH2 podem ser regulados negativamente (por clivagem) pela indução dos mirnas analisados. Processos biológicos como a organização da parede celular, biossíntese de ácido jasmônico e transporte mitocondrial sofrem alterações mediante a regulação pelos mirnas. Desse modo, a capacidade de tolerância da planta a diferentes estresses abióticos pode estar associada aos papéis regulatórios destes e outros mirnas. Palavras-chave: Estresse abiótico. Genes-alvo. micrornas. Plantas. Abstract The science of "omics", from genomics to proteomics, provides relevant information about genes, proteins, and other molecules involved in plant molecular responses. Knowledge of the regulation processes may contribute to the development of genotypes that are more tolerant to abiotic stresses. Therefore, the objective of the work was to analyze in silico which genes are regulated by mirnas397, 408, 6225 and how the (1) Doutorando pela Univ. Estadual Paulista UNESP, Campus de Jaboticabal, Via de acesso Prof. Paulo Donato Castellane s/n, Jaboticabal, , Brasil. (2) Mestranda pela Univ. de Ribeirão Preto UNAERP, Avenida Costábile Romano, 2201, Ribeirão Preto, , Brasil. (3) Graduanda pela Univ. de Ribeirão Preto UNAERP, Avenida Costábile Romano, 2201, Ribeirão Preto, , Brasil. (4) Mestrando pela Univ. de Ribeirão Preto UNAERP, Avenida Costábile Romano, 2201, Ribeirão Preto, , Brasil. (5) Docente da Univ. de Ribeirão Preto UNAERP, Avenida Costábile Romano, 2201, Ribeirão Preto, , Brasil. contato: biotek_rere@hotmail.com.

2 biological processes are modulated. The analysis was performed using computational tools, which included the study of mirna sequence, genes and proteins (by web platforms), and the construction of a co-expression network by software Genemania. Prediction of the targets indicates that the RRA2, PUMP5, CYP74A and PDH2 genes can be down-regulated (by cleavage) by the induction of the mirnas analyzed. Biological processes such as cell wall organization, jasmonic acid biosynthesis and mitochondrial transport undergo changes through regulation by mirnas. Thus, the tolerance of the plant to different abiotic stresses may be associated with the regulatory roles of these and other mirnas. Keywords: Abiotic stress. micrornas. Plants Target genes. 1 Introdução Estudos na área de genômica e transcriptômica contribuem para o entendimento dos aspectos genéticos e moleculares envolvidos na capacidade de tolerância da cana-deaçúcar frente aos variados estresses. O genoma da cana é complexo e a determinação da sequência completa continua sendo um dos principais objetivos. A coleção de ESTs tratase de um recurso valioso e contribui para diversas análises funcionais (GRIVET e ARRUDA, 2002). Esforços são destinados ao entendimento de processos regulatórios, como por exemplo, da regulação pós-transcricional por pequenas moléculas endógenas de RNA não codificantes (de 19 a 24 nucleotídeos) denominados mirnas (VOINNET, 2009). Pela complementação do mirna com seu mrna alvo a inibição pode ser feita pela clivagem e degradação do mrna (LIMA, 2011). A análise dos micrornas em plantas demonstra a importância dessas moléculas na regulação de numerosos aspectos da biologia da planta, especialmente seus padrões de crescimento e desenvolvimento, ou mesmo em mecanismos de defesa contra estresses (JONES-RHOADES et al., 2006; MANTOVANINI, 2017). É necessário a identificação de propriedades associadas a genes-chave em vias ou processos biológicos (DILEO et al., 2011). A rede de co-expressão gênica ilustra a correlação entre os genes, indicando semelhança de padrões de expressão dos genes em diversas condições experimentais (AOKI et al., 2007). O objetivo do trabalho foi analisar, utilizando ferramentas computacionais, os mecanismos regulatórios nos quais os mirnas 397, 408 e 6225 participam, objetivando futuras pesquisas na área de melhoramento genético de cana-de-açúcar.

3 2 Material e Métodos Com base em resultados obtidos pelo grupo de pesquisa (dados ainda não publicados) e revisão de literatura, foram selecionados os mirna397, mirna408 e mirna6225 pelo envolvimento em diferentes tipos de estresse abiótico (MA et al., 2015). Esses mirnas já foram identificados em cana-de-açúcar, milho ou sorgo, plantas monocotiledôneas, de metabolismo similar (C4) e com similaridade de sequências do genoma (VINCENTZ et al., 2004). O estudo in silico foi realizado utilizando diferentes softwares da bioinformática: a) mirbase análise da sequência dos mirnas identificados em cana-de-açúcar, milho ou sorgo (KOZOMARA e GRIFFITHS-JONES, 2014); b) psrnatarget - busca dos potenciais alvos (targets) (DAI et al., 2018); c) BLAST e UniGene (NCBI) - identificação da sequência do gene alvo e proteína; d) UniProt confirmação da proteína (targets) identificada na planta modelo Arabidopsis thaliana; e) QuickGO (EMBL-EBI) anotação funcional da proteína (função molecular, processo biológico e componente celular); f) GeneMANIA software utilizado para construção da rede de co-expressão dos targets, baseado no método de ponderação selecionado automaticamente (WARDE-FARLEY et al., 2010). 3 Resultados e Discussão A busca pelos mirnas resultou em 4 mirnas pertencentes a família mirna397, 7 mirnas408 e 2 mirnas6225. As sequências para os mirnas397 e 6225 de cana-deaçúcar ainda não foram depositadas no banco de dados mirbase, provavelmente porque esses mirnas ainda não foram encontrados em cana, desse modo, para mirnas não identificados em Saccharum (ssp, sof), selecionou-se mirnas encontrados em Zea mays (zma) ou Sorghum bicolor (sbi) (Tabela 1). Os mirnas das familias 397 e 408 possuem de 21 a 22 nucleotídeos, e os dois mirnas6225 apresentam 24 nucleotídeos. As sequências dos mirnas zma-mir397a- 5p, ssp-mir408a e sbi-mir6225-3p foram utilizadas para a busca dos targets regulados (Tabela 2).

4 Tabela 1 - Relação dos mirnas397, 408 e 6225 selecionados. Família do mirna Nome do mirna Sequência (5 3 ) 1 T(nt) 2 zma-mir397a-5p UCAUUGAGCGCAGCGUUGAUG 21 zma-mir397b-5p UCAUUGAGCGCAGCGUUGAUG 21 zma-mir397a-3p UAGCCGUUAGCGCUCAUUAACU 22 zma-mir397b-3p CCAGCGCUGCACUCAAUUACG 21 ssp-mir408a CUGCACUGCCUCUUCCCUGGC 21 ssp-mir408d CUGCACUGCCUCUUCCCUGGC 21 sof-mir408a CUGCACUGCCUCUUCCCUGGC 21 sof-mir408b CUGCACUGCCUCUUCCCUGGC 21 sof-mir408c CUGCACUGCCUCUUCCCUGGC 21 sof-mir408d CUGCACUGCCUCUUCCCUGGC 21 sof-mir408e CUGCACUGACUCUUCCCUGGC 21 sbi-mir6225-5p AACUAGACUCAAAAGAUUCAUCUC 24 sbi-mir6225-3p GAAACGAAUCUUUUAAGUCUAAUU 24 1 Sequência madura do mirna. 2 T(nt) = tamanho da sequência em nucleotídeos. Esses mirnas regulam inibindo a transcrição através da clivagem da sequência do mrna (dado obtido pelo psrnatarget). Os potenciais alvos do mirna397 são os genes Arabinosyltransferase (RRA2) e Pyruvate dehydrogenase E1 beta subunit (PDH2); do mirna408, o gene Allene oxide synthase protein (CYP74A), e do mirna6225, o gene Mitochondrial uncoupling protein 5 (PUMP5) (Tabela 2). Ainda de acordo com a Tabela 2, os genes RRA2 (localizado no complexo de Golgi) e PDH2 (apoplasto, mitocôndria), estão envolvidos em processos, respectivamente, de biogênese da parede celular e, respostas de defesa a bactéria. O gene CYP74A (localizado no cloroplasto e mitocôndria) participa do processo de biossíntese do ácido jasmônico. O jasmonato está intimamente ligado ao aumento da expressão de proteínas envolvidas na defesa da planta (CREELMAN e MULLET, 1997). Localizado na membrana interna mitocondrial, o gene PUMP5 está envolvido a processos de transporte na membrana. Quando o mirna6225 é reprimido e o gene PUMP5 está induzido, haverá alterações no sistema redox da planta. Resultados sugerem que um dos papéis fisiológicos do gene nas folhas de Arabidopsis está relacionado à manutenção do equilíbrio redox da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial para facilitar o metabolismo fotossintético (SWEETLOVE et al., 2006). Portanto, este mrna e mirna estão relacionados a mecanismos de tolerância da planta à condições de estresses abióticos (VERCESI et al., 2006).

5 Tabela 2 - Anotação funcional dos genes regulados pelos mirnas. mirnas Targets Acesso (UniProt) RRA2 PDH2 Q9C9Q5 Q CYP74A Q PUMP5 Q9SJY5 Função molecular* transferase (GO: ) piruvato desidrogenase (GO: ) aleno óxido sintase (GO: ); monooxigenase (GO: ) transporte ácido dicarboxílico (GO: ); transporte malato (GO: ) Processo biológico* Biogênese da parede celular (GO: ); Organização da parede celular (GO: ) Biossíntese de Acetyl-CoA (GO: ); Resposta de defesa à bactéria (GO: ) Resposta de defesa (GO: ); Biossíntese do ácido jasmônico (GO: ) Transporte mitocondrial (GO: ); Transporte íon fosfato (GO: ) Componente celular* Complexo de Golgi (GO: ) Apoplasto (GO: ); Mitocôndria (GO: ); Nucléolo (GO: ) Cloroplasto (GO: ); Mitocôndria (GO: ) Membrana interna mitocondrial (GO: ) 1 O código de acesso (Uniprot) para o target foi da planta modelo Arabidopsis thaliana. *Anotações funcionais da proteína. A rede de co-expressão fornece um número de genes co-expressos relevantes para os genes alvo, contribuindo para o entendimento redes reguladoras mais completas (ZINATI et al., 2016) (Figura 1). As relações entre genes-alvo e genes co-expressos são representados por traços cinza. Os genes alvos (RRA2, PUMP5, CYP74A e PDH2) estão indicados nos círculos cinza rachurados e os demais são genes co-expressos. Observa-se a formação de 3 grandes grupos de genes e, estes, encontram-se representados pelos domínios proteicos, por exemplo, o gene CYP74A com o domínio Cyt P450.

6 Dentre as várias relações, o gene PUMP5 regulado pelo mirna6225, estabelece relação com o gene AT1G72820 e, ambos, possuem o domínio proteico conservado Mitochondrial carrier protein - proteínas transportadoras de substrato, envolvidas na transferência de energia (KUAN e SAIER, 1993). O gene PUMP5 também estabelece relação com o gene alvo CYP74A (dominio Cyt P450 ), envolvido em processos biológicos de defesa, biossíntese e metabolismo de ácido jasmônico (YAN et al., 2016). A regulação desses targets (CYP74A e PUMP5) pelos mirnas408 e 6225 pode estar associada a respostas moleculares que conferem maior/menor capacidade de tolerância das plantas às condições adversas do ambiente. Ou seja, estes mirnas quando induzidos, podem inibir o papel biológico dos genes alvos relatados e, consequentemente interferem na co-expressão de outros genes importantes para o metabolismo celular da planta. Todos os demais genes apresentados na rede podem ser modulados em consequência da indução ou repressão dos mirnas analisados. Figura 1 - Rede de co-expressão dos potenciais genes-alvo dos mirnas.

7 4 Conclusões A regulação dos genes RRA2, PUMP5, CYP74A e PDH2 pelos mirnas397, 408 e 6225, pode pomover alterações metabólicas e fisiológicas em cana-de-açúcar, milho e sorgo, resultando na deficiência de processos biológicos importantes para a planta e, consequentemente, interferindo na capacidade de tolerância a estresses abióticos. Referências AOKI, K.; OGATA, Y.; SHIBATA, D. Approaches for extracting practical information from gene co-expression networks in plant biology. Plant Cell Physiology, v. 48, n. 3, p , CREELMAN, R. A.; MULLET, J. E. Biosynthesis and action of jasmonates in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, v. 48, p , DAI, X.; ZHUANG, Z.; ZHAO, P.X. psrnatarget: a plant small RNA target analysis server (2017 release). Nucleic Acids Research, gky316, DILEO, M. V.; STRAHAN, G. D.; DEN BAKKER, M.; HOEKENGA, O. A. Weighted correlation network analysis (WGCNA) applied to the tomato fruit metabolome. Plos One, v. 6, n. 10, p. 1-10, GRIVET, L.; ARRUDA, P. Sugarcane genomics: depicting the complex genome of an important tropical crop. Current Opinion in Plant Biology, v. 5, n. 2, p , JONES-RHOADES, M. W.; BARTEL, D. P.; BARTEL, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology, v. 57, p , KOZOMARA, A.; GRIFFITHS-JONES, S. mirbase: annotating high confidence micrornas using deep sequencing data. Nucleic Acids Research, v. 42, n. D1, p. D68 D73, January KUAN, J.; SAIER, M. H. The mitochondrial carrier family of transport proteins: structural, functional, and evolutionary relationships. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, v. 28, n. 3, p , LIMA, J. C.; ARENHART, R. A.; MARGIS-PINHEIRO, M.; MARGIS, R. Aluminum triggers broad changes in micrornas expression in rice roots. Genetics and Molecular Research, v. 10, n. 4, p , MA, C.; BURD, S.; LERS, A. mir408 is involved in abiotic stress responses in Arabidopsis. The Plant Journal, v. 84, p , MANTOVANINI, L. J. Seleção de genótipos, análises fisiológicas e expressão de mirnas em cana-de-açúcar (Saccharum spp.) na resposta ao alumínio f.

8 Dissertação (Mestrado em Agronomia - Genética e Melhoramento de Plantas) - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias UNESP, Campus de Jaboticabal, Jaboticabal-SP, SWEETLOVE, L.J.; LYTOVCHENKO, A.; MORGAN, M.; et al. Mitochondrial uncoupling protein is required for efficient photosynthesis. PNAS, v. 103, n. 51, p , VERCESI, A. E.; BORECKY, J.; MAIA, I. G.; et al. Plant uncoupling mitochondrial proteins. Annual Review of Plant Biology, v. 57, p , VINCENTZ, M.; CARA, F. A. A.; OKURA, V.K.; et al. Evaluation of monocot and eudicot divergence using the sugarcane transcriptome. Plant Physiology, v. 134, p , VOINNET O. Origin, biogenesis, and activity of plant micrornas. Cell, 136: , WARDE-FARLEY, D.; DONALDSON, S. L.; COMES, O.; et al. The GeneMANIA prediction server: biological network integration for gene prioritization and predicting gene function. Nucleic Acids Research, v. 38, W214-W220, YAN, Q.; CUI, X.; LIN, S.; et al. GmCYP82A3, a soybean cytochrome p450 family gene involved in the jasmonic acid and ethylene signaling pathway, enhances plant resistance to biotic and abiotic stresses. Plos one, v. 11, n. 9, e , ZINATI, Z.; SHAMLOO-DASHTPAGERDI, R.; BEHPOURI, A. In silico identification of mirnas and their target genes and analysis of gene co-expression network in saffron (Crocus sativus L.) stigma. Molecular Biology Research Communications, v. 5, n. 4, p , 2016.