IVANA GIOVANNETTI CASTILHO LARISSA RAGOZO C. DE OLIVEIRA LUIZ ALQUATI

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1 Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA IBB/UNESP CURSO DE MEDICINA HUMANA ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS DE MICOLOGIA PROFESSORES EDUARDO BAGAGLI SANDRA BOSCO APOIO ACADÊMICO IVANA GIOVANNETTI CASTILHO LARISSA RAGOZO C. DE OLIVEIRA LUIZ ALQUATI 2019

2 Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina ASPECTOS GERAIS DA CARACTERIZAÇÃO MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA DAS COLÔNIAS FÚNGICAS A cultura de um micro-organismo refere-se à capacidade que este tem de crescer em meios nutritivos artificiais. Esse crescimento é evidenciado macroscopicamente pela formação de uma unidade estrutural, denominada colônia. As colônias de determinados fungos geralmente apresentam morfologias típicas, quando estes são semeados em meios com a mesma composição química e submetidos às mesmas condições de incubação. Através dos seus aspectos macro-estruturais de uma colônia, é possível sugerir a espécie fúngica presente na cultura. Sendo assim, o conhecimento do aspecto macro-morfológico das colônias é de extrema utilidade para a sugestão da identificação preliminar de determinada espécie fúngica. Na observação das características culturais de determinado fungo, pode-se considerar alguns aspectos, resumidos abaixo, os quais podem também ser encontrados no livro de SIDRIM, JJC, BRILHANTE, RSN, ROCHA, MFG. (Cap. 8 - Aspectos Gerais de fungos filamentosos e dimórficos na apresentação filamentosa. In: SIDRIM, JJC, ROCHA, MFG. Micologia Médica a luz de autores contemporâneos. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2004, p ). São estes: a) tamanho da colônia: pode ser bastante variável na dependência da quantidade e qualidade de substrato ofertado e da espécie fúngica. Por exemplo, os fungos zigomicetos apresentam velocidade de crescimento rápido e suas colônias tendem a ocupar toda a superfície da placa. O mesmo ocorre com as espécies do gênero Aspergillus quando cultivadas a 35 o C. Já o fungo Piedraia hortae apresenta crescimento muito lento, sendo sua colônia restrita ao centro da placa de Petri. b) bordas: na periferia das colônias fúngicas podem ser observados muitos desenhos que vão desde morfologias bem delimitadas até achados de projeções irregulares que lembram franjas. Além disso, também pode ser observada, nas bordas das colônias uma variação da coloração em relação ao centro. Esse achado é peça-chave para indicar o possível patógeno implicado, como por exemplo, nas colônias de Sporothrix schenckii, onde se observa que as bordas tornam-se escuras com o envelhecimento da cultura. c) textura: é, talvez, o mais importante achado utilizado na caracterização de uma colônia fúngica. A textura descreve a altura das hifas aéreas. As colônias podem ser classificadas quanto à textura em diversos tipos: colônias algodonosas: aquelas que se assemelham com algodão, colônias furfuráceas: aquelas que lembram um punhado de substância farinácea espalhada em uma superfície, colônias penugentas: aquelas nas quais se evidenciam estruturas que lembram penas de aves dispersas na superfície do meio, colônias arenosas ou pulverulentas: aquelas que lembram areia de praia, colônias veludosas: aquelas que apresentam o aspecto de tecido aveludado, colônias membranosas: aquelas que são bem aderidas à superfície do meio de cultura, recobrindo-o como uma película, colônias glabrosas: aquelas com aspecto compacto, coriáceo, podendo ter superfície lisa ou irregular e sempre com ausência de filamento, ou seja, não algodonosa,

3 Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina 2019 colônias cremosas: aquelas que apresentam aspecto visual cremoso, sendo comumente observados no grupo das leveduras e da maioria das colônias bacterianas. d) relevo: diz respeito à topografia da colônia e pode ser: colônias cerebriformes: apresentam topografia de altos e baixos, fazendo circunvoluções que lembram as observadas no cérebro, colônias rugosas: nada mais são do que variações da cerebriforme, porém as pregas topográficas são menos evidentes, sendo as vezes radiais partindo do centro da colônia, colônias apiculadas: caracterizam-se pela presença de uma saliência na parte central lembrando um pequeno cume, colônias crateriformes: são aquelas que se aprofundam no meio de cultura, assumindo o aspecto de cratera. e) pigmentação: quando se fala em pigmentação de uma colônia fúngica deve-se levar em consideração alguns aspectos primários: - se o pigmento é encontrado na superfície da colônia ou no reverso, - se o pigmento é encontrado tanto na superfície quanto no reverso da colônia, - se o pigmento é ou não difusível no meio de cultura, - se o pigmento está presaente apenas nos esporos e ausente nas hifas, como observado na maioria das espécies de Aspergillus e Penicillium, ou em ambos (hifa e esporos), como observado nas espécies de fungos causadores de cromoblastomicose (Ex. Fonsecaea pedrosoi). Observa-se uma grande variedade de cores na pigmentação fúngica que passam pelos tons de verde, amarelo, vermelho e castanho até ao preto. Importante ressaltar que esta caracterização fenotípica da colônia visando a auxiliar na identificação de determinada espécie fúngica apresenta algumas limitações, principalmente devido à ocorrência de variações destas características dentro de uma mesma espécie, devido tanto a efeito ambiental, como também da subjetividade do observador. Dessa forma, deve-se sempre ter em mente que, embora a colônia fúngica possa sugerir, indicar e muitas vezes até acertar o caminho da identificação, não se deve, contudo, considera-la como única ou principal forma de identificação fúngica. Quando empregada como único critério pode levar a diagnósticos pouco precisos ou errôneos. Os aspectos microscópicos são observados em materiais fúngicos (fragmentos de cultura, esfregaços, raspados, etc) sobre lâmina, com ou sem lamínula e coloração. As lâminas são inicialmente observadas no menor aumento e a seguir nos aumentos maiores, sem necessariamente empregar a objetiva de imersão. 3

4 Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina PRÁTICA 1 ASPECTOS MACROSCÓPICOS DAS CULTURAS DE FUNGOS a) finalidade: auxiliar na identificação das colônias fúngicas b) fundamento: Os estudos macroscópicos devem ser baseados nas seguintes características: tamanho, bordas, textura, relevo (na frente e verso da colônia) e pigmentação Exemplo: Frente: colônia de fungo (Filamentoso ou Leveduriforme), de textura (algodonosa, aveludada, pulverulenta, glabra, cremosa, etc), de relevo (cerebriforme, rugoso, crateriforme, apiculado, liso) de coloração (...), com bordos (regulares ou irregulares). Verso: (presença ou ausências) de fendas ou dobras, e (ausência ou presença) de pigmento difusível no meio de cultura. Descrever as características coloniais das culturas de Aspergillus sp., Saccharomyces sp., Candida sp e Cryptococus neoformans, conforme o modelo acima. Aspergillus sp. Saccharomyces sp.

5 Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina Candida sp. Cryptococcus neoformans. PRÁTICA 2 ASPECTOS MICROSCÓPICOS DAS CULTURAS DE FUNGOS - COLORAÇÃO COM LACTOFENOL AZUL ALGODÃO E TINTA NANKIN a) finalidade: O método de coloração com Lactofenol Azul Algodão é usado para preparar exame microscópico de colônias de fungos. É uma técnica que tem a finalidade de visualizar o micélio vegetativo e reprodutor de um fungo filamentoso, como também as características da célula vegetativa e reprodução por brotamento de leveduras. O uso da tinta Nankin é bem específico para visualizar leveduras que apresentam cápsula. b) técnica: 1. Colocar uma gota de lactofenol azul-algodão (LFAA) sobre a lâmina. 2. Retirar pequeno fragmento da cultura de bolor ou uma alíquota da cultura de levedura, utilizando alça ou fio de platina. 3. Colocar o fragmento da cultura ou a alíquota de levedura sobre a gota de lactofenol.e homogeneizar. 4. Cobrir com lamínula e examinar ao microscópio nas objetivas de 10 e 40 vezes.

6 Desenhar as estruturas observadas: Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina Aspergillus sp. Saccharomyces sp. Candida sp. C. neoformans sp. (Nankin) c) interpretação O corante LFAA produz um contraste azul em todo citoplasma fúngico. A tinta nankin (hidrossolúvel) gera contraste negativo ao longo da cápsula. As leveduras são unicelulares e podem ter diferentes formatos (oval, circular, naveta, etc) e se reproduzem por brotamento (únicos ou múltiplos) ou por fissão (mais raro). Os bolores são fungos filamentosos possuindo hifas septadas ou cenocíticas. Na sua reprodução assexuada, é possível visualizar no micélio vegetativo os clamidósporos e artrósporos, e no micélio reprodutor, os esporos endógenos (esporangiósporos) em esporângios (estrutura fechada) e esporos exógenos (conidiósporos, também denominados simplesmente conídios ou conídias) em conidióforos.

7 Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina 2019 PRÁTICA 3 7 OBSERVAÇÃO DE CULTURAS E LÂMINAS DE FUNGOS CAUSADORES DE MICOSES SUPERFICIAIS E CUTÂNEAS 1. Examinar ao microscópio material raspado de pele de pacientes com Pitiriase versicolor: Desenhar as estruturas observadas. 2. Observar os pêlos infectados com as Piedras (Branca e Preta) e desenhar as estruturas: Piedra Preta Piedra Branca

8 Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina Descrever as características coloniais, observar e desenhar as estruturas microscópicas dos seguintes fungos: 8 Trichosporon sp. Hortae werneckii Microsporum canis Microsporum gypseum

9 Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina Trichophyton mentagrophytes Epidermophyton flocosum 4 Quiz micológico: 4.1 Quais os agentes etiológicos das Piedras Branca e Preta? 4.2 Hortea werneckii é um fungo hialino ou dematiáceo? 4.3 Quais os tipos de conídios observados nos 3 gêneros de fungos dermatófitos?

10 Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina PRÁTICA 4 FUNGOS CAUSADORES DE MICOSES SUBCUTÂNEAS 1 Observar as lâminas de cortes histológicos de pacientes com Cromoblastomicose e Lacaziose. Desenhar as estruturas fúngicas observadas. Cromoblastomicose coloração: HE Lacaziose coloração GMS 2. Descrever as características coloniais, observar e desenhar as estruturas microscópicas dos seguintes fungos: Sporothrix spp. (Fase Micelial) Sporothrix spp. (Fase Leveduriforme)

11 Pythium insidosum Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina Coloração com LFAA produção de esporângio em material vegetal Phialophora verrucosa Cladophialophora carrionii

12 Fonsecaea pedrosoi Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina Quiz micológico: 3.1 Quais fungos observados são dematiáceos? 3.2 Quais os tipos de corpos frutificação observados nos agentes de cromoblastomicose? 3.3 Qual a estrutura patognomônica da cromoblastomicose? 3.4 Qual dos fungos, estudados hoje, não é cultivável? 3.5 Qual dos fungos, estudados na aula de hoje, não é um fungo verdadeiro?

13 Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina PRÁTICA 5 FUNGOS DIMÓRFICOS CAUSADORES DE MICOSES SISTÊMICAS 1. Descrever as características coloniais, observar e desenhar as estruturas microscópicas dos seguintes fungos: Paracoccidiodies brasiliensis (Fase Micelial) Paracoccidiodies brasiliensis (Fase Leveduriforme)

14 Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina Histoplasma capsulatum (Fase Micelial) Histoplasma capsulatum (Fase Leveduriforme) 2 Quiz micológico: 2.1 Quais são as estruturas infectantes de P. brasiliensis e H. capsulatum? 2.2 Qual a semelhança (morfológica) e diferença (de função e fase) entre leveduras de P. brasiliensis e macroconídias de H. capsulatum?

15 Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina PRÁTICA 6 FUNGOS CAUSADORES DE MICOSES OPORTUNISTAS 1. Descrever as características coloniais, observar e desenhar as estruturas microscópicas das espécies de Aspergillus: Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus niger

16 Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina Observar ao microscópio e desenhar as estruturas visualizadas de esfregaço de secreção vaginal de paciente com vulvovaginite por C. albicans corado pelo método de Gram ou Giemsa. 3. Descrever as características coloniais de cultura de Candida albicans cultivada em agar Sabouraud, observar e desenhar as estruturas microscópicas: esfregaço de cultura corado com LFAA, clamidósporo e formação de Tubo Germinativo. Candida albicans esfregaço de cultura filamentação e clamidoconídio tubo germinativo

17 Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina Diferenciação de Candida albicans de outras espécies de Candida pelo meio CHROMagar-Candida. Observar o crescimento das colônias e diferenciá-las pela coloração: Candida albicans cor: Candida tropicalis cor: Candida spp. cor: 5 Descrever as características coloniais de Cryptococcus neoformans cultivado em agar Sabouraud (SAB) e Agar Semente de Niger (NSA). Observar as características microscópicas de esfregaço de cultura corado pelo Nankin. Cryptococcus neoformans (cultivado em Agar Sabouraud) Cryptococcus neoformans (cultivado em Agar Semente de Niger) coloração pela tinta da China (Nankin)

18 Roteiro para aulas práticas de Micologia 2 o Medicina Diferenciação entre C. neoformans e C. gattii pelo método de CGB (Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol) Teste CGB positivo Cor: Espécie: Teste CGB negativo Cor: Espécie: 7 Quis micológico: 7.1 Diferencie as três espécies de Aspegillus pelo aspecto macroscópico (coloração) e microscópico (tipo de corpo de frutificação). 7.2 Como diferenciar se Candida albicans está em condição de comensalismo ou parasitismo? 7.3 Cite dois fatores de virulência de Cryptococcus neoformans observados na aula prática de hoje.